抗人cxcl1單克隆抗體或其片段的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種抗人CXCL1單克隆抗體或其片段，特異性識(shí)別序列號(hào)1表示的氨基酸序列區(qū)，在輕鏈上，CDR1含有序列號(hào)12表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)13表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)14表示的氨基酸序列，在重鏈上，CDR1含有序列號(hào)15表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)16表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)17表示的氨基酸序列。
【專(zhuān)利說(shuō)明】抗人CXCL1單克隆抗體或其片段
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年10月29日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980149563.4 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/JP2009/068587)、發(fā)明名稱(chēng)為“人CXCLl蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種測(cè)定人CXCLl蛋白質(zhì)(以下記作人CXCL1)的方法。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及一種測(cè)定人CXCLl的免疫學(xué)測(cè)定方法，所述免疫學(xué)測(cè)定方法組合使用單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段與構(gòu)成人CXCLl的氨基酸序列上的特定3處的部分序列區(qū)中的任一個(gè)特異性結(jié)合。另外，本發(fā)明涉及可以在上述測(cè)定人CXCLl蛋白質(zhì)的方法中使用的、與人CXCLl特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段。
【背景技術(shù)】
[0003]人CXCLl是屬于CXC家族的趨化因子的一種。已知該蛋白質(zhì)在血液中存在于血小板內(nèi)，與其他CXC家族同樣地在炎癥反應(yīng)時(shí)過(guò)量表達(dá)。
[0004]近年來(lái)，有報(bào)道稱(chēng)上述人CXCLl作為腫瘤相關(guān)因子發(fā)揮作用。因此，人們期待通過(guò)從尿中定量地檢測(cè)可以成為尿路上皮癌的標(biāo)記物(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1、專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。進(jìn)而，有報(bào)道指出在大腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤等其他惡性腫瘤患者的組織或血液中，人CXCLl在基因水平、蛋白質(zhì)水平上發(fā)生變化(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2、非專(zhuān)利文獻(xiàn)3、非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，潛在地可以極早期及/或早期檢測(cè)出尿路上皮癌及上述癌。
[0005]然而，在使用現(xiàn)有 的酶免疫學(xué)測(cè)定法的測(cè)定法中，檢測(cè)上述癌所需要的靈敏度不足。例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)I中記載的R&DSYSTEMS公司(以下R&DSYSTEMS公司)制的人CXCLl測(cè)定用試劑盒的檢出限濃度為20pg/mL左右，而健康人的尿中的人CXCLl濃度達(dá)不到上述檢出限。因此，期待更高靈敏度的人CXCLl的測(cè)定法。
[0006]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:W02007/026895
[0007]非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Hiroaki Kawanishi et al, 2008, Clinical Cancer Research,vol.14，N0.9,2579-2587
[0008]非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Gong Yang et al，2006，PNAS, vol.103，N0.44，16472-16477
[0009]非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Yu Wen et al, 2006, Clinical Cancer Research, vol.12, N0.20,5951-5959
[0010]非專(zhuān)利文獻(xiàn)4:Jing Luan et al, 1997, Journal of Leukocyte Biology, vol.62,N0.5,588-597

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]因此，本發(fā)明的一個(gè)方案的目的在于提供一種以更高靈敏度檢測(cè)人CXCLl的免疫學(xué)測(cè)定法。更具體而言，本發(fā)明的目的在于，通過(guò)組合抗體或抗原識(shí)別部分的免疫學(xué)測(cè)定法，獲得以更高靈敏度檢測(cè)人CXCLl的方法，所述抗體或抗原識(shí)別部分與構(gòu)成人CXCLl的氨基酸序列中的特定3處的序列中的任一個(gè)特異性結(jié)合。
[0012]另外，本發(fā)明的另一個(gè)方案的目的在于提供特異性識(shí)別人CXCLl的單克隆抗體或其片段。更具體而言，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段可以用于上述以更高靈敏度檢測(cè)人CXCLl的方法、且含有特異性識(shí)別人CXCLl的新氨基酸序列、并且與現(xiàn)有抗體相比具有較高親和性。
[0013]本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)組合單克隆抗體或抗原識(shí)別部分進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)定，能夠以比現(xiàn)有技術(shù)更高的靈敏度檢測(cè)人CXCLl，所述單克隆抗體或抗原識(shí)別部分與構(gòu)成人CXCLl的氨基酸序列中的特定3處的部分序列區(qū)特異性結(jié)合。另外，成功地制備了含有與上述人CXCLl上的3處部分序列特異性結(jié)合的新氨基酸序列的單克隆抗體、及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤。進(jìn)而，分離了編碼構(gòu)成該抗體的氨基酸序列的基因，確定其堿基序列。由此，可以制備重組抗體及其重組片段。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的，即，提供以下⑴~(15)。
[0014](I) 一種人CXCLl蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法，其特征在于，使用2種以上的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，測(cè)定樣品中的人CXCLl或其片段，所述2種以上的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段特異性識(shí)別構(gòu)成人CXCLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分序列即序列號(hào)I~3表示的氨基酸序列中的任一序列區(qū)、且特異性識(shí)別各個(gè)不同的序列區(qū)。
[0015](2)如(I)所述的人CXCLl蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法，其特征在于，使用特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，測(cè)定樣品中的人CXCLl蛋白質(zhì)或其片段。
[0016](3)如(I)或(2)所述的人CXCLl蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法，其特征在于，使用特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段及特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的抗人CXCLl`單克隆抗體或其片段，測(cè)定樣品中的人CXCLl蛋白質(zhì)或其片段。
[0017](4)如(I)或(2)所述的人CXCLl蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法，其特征在于，使用特異性識(shí)別序列號(hào)2表示的氨基酸序列區(qū)的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段及特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，測(cè)定樣品中的人CXCLl蛋白質(zhì)或其片段。
[0018](5)如(I)~⑷中任一項(xiàng)所述的人CXCLl蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法，其中，所述樣品為術(shù)后收集的組織、血液、血清、血漿、尿、脊髓液、唾液、淋巴液、淚液或精液。
[0019](6) 一種抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，是特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的構(gòu)成人CXCLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分序列的單克隆抗體或其片段，在其輕鏈上，CDRl含有序列號(hào)4表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)5表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)6表示的氨基酸序列，在重鏈上，CDRl含有序列號(hào)7表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)8表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)9表示的氨基酸序列。
[0020](7)如(6)所述的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，其中，輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)10表示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)11表示的氨基酸序列。
[0021](8) 一種抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，是特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的構(gòu)成人CXCLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分序列的單克隆抗體或其片段，在其輕鏈上，CDRl含有序列號(hào)12表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)13表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)14表示的氨基酸序列，在重鏈上，CDRl含有序列號(hào)15表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)16表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)17表示的氨基酸序列。
[0022](9)如⑶所述的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，其中，輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)18表示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)19表示的氨基酸序列。
[0023](10) 一種抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，是特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的構(gòu)成人CXCLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分序列的單克隆抗體或其片段，在其輕鏈上，CDRl含有序列號(hào)20表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)21表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)22表示的氨基酸序列，在重鏈上，CDRl含有序列號(hào)23表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)24表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)25表示的氨基酸序列。
[0024](11)如(10)所述的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，其中，輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)26表不的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)27表不的氨基酸序列。
[0025](12) 一種抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，是特異性識(shí)別序列號(hào)2表示的構(gòu)成人CXCLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分 序列的單克隆抗體或其片段，在其輕鏈上，CDRl含有序列號(hào)28表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)29表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)30表示的氨基酸序列，在重鏈上，CDRl含有序列號(hào)31表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)32表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)33表示的氨基酸序列。
[0026](13)如(12)所述的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，其中，輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)34表不的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)35表不的氨基酸序列。
[0027](14) 一種抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，是特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的構(gòu)成人CXCLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分序列的單克隆抗體或其片段，在其輕鏈上，CDRl含有序列號(hào)36表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)37表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)38表示的氨基酸序列，在重鏈上，CDRl含有序列號(hào)39表示的氨基酸序列，CDR2含有序列號(hào)40表示的氨基酸序列，及CDR3含有序列號(hào)41表示的氨基酸序列。
[0028](15)如(14)所述的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，其中，輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)42表示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)含有序列號(hào)43表示的氨基酸序列。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，能夠以比現(xiàn)有技術(shù)更高的靈敏度測(cè)定人CXCLl的濃度。另外，可以提供一種特異性識(shí)別人CXCLl的高親和性的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030][圖1]表示采用現(xiàn)有方法進(jìn)行的免疫學(xué)測(cè)定，所述現(xiàn)有方法使用夾心ELISA法和市售試劑盒，所述夾心ELISA法使用特異性識(shí)別序列號(hào)I~3表示的氨基酸序列中的任一個(gè)的單克隆抗體。
[0031][圖2]使用特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列的單克隆抗體作為標(biāo)記抗體的夾心ELISA。
[0032][圖3]使用特異性識(shí)別序列號(hào)1、或2表示的氨基酸序列的單克隆抗體、及特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列的單克隆抗體、檢測(cè)尿中人CXCLl的夾心ELISA。
[0033][圖4]檢測(cè)緩沖液中的人CXCLl的曲線(xiàn)圖，在該檢測(cè)中將特異性識(shí)別序列號(hào)2表示的氨基酸序列的市售抗體固相化，并采用夾心ELISA法，該夾心ELISA法使用生物素標(biāo)記的識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列的本發(fā)明的抗體、或市售的生物素標(biāo)記抗人CXCLl多克隆抗體。
[0034][圖5]檢測(cè)緩沖液中的人CXCLl的曲線(xiàn)圖，在該檢測(cè)中將本發(fā)明的5種抗體(IgGl-1、IgGl-3、IgGl-10、IgGl-14、IgG2b_l)、及市售抗體固相化，并采用使用生物素標(biāo)記抗人CXCLl多克隆抗體的夾心ELISA法。
[0035][圖6]檢測(cè)血漿中的人CXCLl的曲線(xiàn)圖，在該檢測(cè)中將本發(fā)明的5種抗體及市售抗體固相化，并采用使用生物素標(biāo)記抗人CXCLl多克隆抗體的夾心ELISA法。
[0036][圖7]檢測(cè)尿中的人CXCLl的曲線(xiàn)圖，在該檢測(cè)中將本發(fā)明的5種抗體及市售抗體固相化，并采用使用生物素標(biāo)記抗人CXCLl多克隆抗體的夾心ELISA法。
[0037][圖8]表示本發(fā)明的5種抗體及市售抗體的膀胱癌細(xì)胞侵襲(invasion)抑制能的圖(I)。
[0038][圖9]表示本發(fā)明的4種抗體及市售抗體的膀胱癌細(xì)胞侵襲抑制能的圖(2)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0039]以下，詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。
[0040]1.抗人CXCLl單克隆抗體及其片段
[0041]本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“人CXCL1”，是指含有GenbankNM_001511中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其天然突變體。此處所謂的“天然突變體”是自然界存在的突變體，例如，是指在上述氨基酸序列中缺失、取代、或添加I個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變體，與上述氨基酸序列具有95%以上、優(yōu)選98%以上、較優(yōu)選99%以上的同源性的突變體等。此處所謂“同源性”，是指在2個(gè)氨基酸序列中引入空位或不引入空位的狀態(tài)下，進(jìn)行整列(排列整齊)使其一致度達(dá)到最高時(shí)，包含上述空位 數(shù)在內(nèi)的、相對(duì)于一個(gè)氨基酸序列的全部氨基酸殘基數(shù)、另一個(gè)氨基酸序列的相同氨基酸殘基數(shù)的比例)。另外，所謂“多個(gè)”是指2~10的整數(shù)，例如2~7、2~5、2~4、2~3的整數(shù)。作為天然突變體的具體例子，可以舉出SNP(單核苷酸多態(tài)性)等基于多型的突變體和剪接突變體等。上述取代優(yōu)選為保守的氨基酸取代。其原因是如果為保守的氨基酸取代，則可以使其具有與具有上述氨基酸序列的人CXCLl實(shí)質(zhì)上同等的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)。所謂保守的氨基酸，已知相互為非極性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨酸)及極性氨基酸(除非極性氨基酸之外的氨基酸)、帶電荷的氨基酸(酸性氨基酸(天門(mén)冬氨酸、谷氨酸)及堿性氨基酸(精氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸))及不帶電荷的氨基酸(除帶電荷的氨基酸之外的氨基酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)、支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、以及脂肪族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)等。
[0042]本說(shuō)明書(shū)中使用的所謂“單克隆抗體”，是指含有來(lái)自免疫球蛋白或其片段的構(gòu)架區(qū)(FR:Frame work region)及互補(bǔ)決定區(qū)(CDR:Complementarity determining region)、能夠與抗原特異性結(jié)合且識(shí)別抗原的多肽。因此，本發(fā)明的所謂“抗人CXCLl單克隆抗體”，是指能夠與人CXCLl或其片段特異性結(jié)合、且識(shí)別人CXCLl或其片段的多肽。所謂“特異性結(jié)合”，是指只與靶抗原(本發(fā)明中的人CXCLl或其片段)結(jié)合。
[0043]典型的免疫球蛋白分子形成四聚體結(jié)構(gòu)，其中稱(chēng)作重鏈及輕鏈的2條多肽鏈形成的組通過(guò)二硫鍵2組相互連接。重鏈含有N末端的重鏈可變區(qū)(Vh)和C末端的重鏈恒定區(qū)(Ch)，輕鏈含有N末端的輕鏈可變區(qū)和C末端的輕鏈恒定區(qū)(CJ。其中，從干預(yù)與抗體的結(jié)合特異性的方面考慮，Vh及\特別重要。所述Vh及\均由約110個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其內(nèi)部具有直接干預(yù)與抗原的結(jié)合特異性的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2、CDR3)、及作為可變區(qū)的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用的4個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR1、FR2、FR3、FR4)。已知互補(bǔ)決定區(qū)形成與抗原分子互補(bǔ)的立體結(jié)構(gòu)，決定抗體的特異性(E.A.Kabat et al., 1991, Sequences ofproteins of immunological interest, Vol.1, eds.5, NIH publication)。恒定區(qū)的氨基酸序列在種內(nèi)抗體間幾乎不變，而互補(bǔ)鏈決定區(qū)的氨基酸序列在各抗體間變異性很高，因此，也稱(chēng)作超可變區(qū)(Hypervariable region)。在可變區(qū)中，上述互補(bǔ)決定區(qū)與構(gòu)架區(qū)在從氨基酸末端至羧基末端的方向上以FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序進(jìn)行排列。在免疫球蛋白分子內(nèi)，'及Vh通過(guò)相互形成二聚體形成抗原結(jié)合部位。免疫球蛋白已知有IgG, IgM, IgA, IgE、及IgD各類(lèi)，本發(fā)明的抗體可以為任一類(lèi)，優(yōu)選為IgG。
[0044]本發(fā)明中有用的抗體，可以來(lái)自于包含鳥(niǎo)及哺乳動(dòng)物在內(nèi)的所有動(dòng)物源。例如可以舉出小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、山羊、驢、綿羊、駱駝、馬、雞或人等。另外，本發(fā)明的“單克隆抗體”可以化學(xué)合成或通過(guò)使用重組DNA法合成。例如，嵌合抗體及人源化抗體之類(lèi)的重組抗體也包含在本發(fā)明中。
[0045]所謂嵌合抗體是某抗體的恒定區(qū)被其他抗體的恒定區(qū)取代的抗體。例如，在抗人CXCLl小鼠單克隆抗體中其恒定區(qū)被人抗體的恒定區(qū)替換的抗體。作為更具體的例子，可以舉出下述抗體:\含有各個(gè)序列號(hào)10、18、26、34或42中的任一個(gè)表不的抗人CXCLl小鼠單克隆抗體的 '中的氨基酸序列、且Q含有任意人抗體的Q中的氨基酸序列、及/或Vh含有各個(gè)序列號(hào)11、19、27、35或43中的任一個(gè)表示的抗人CXCLl小鼠單克隆抗體的Vh中的氨基酸序列、且Ch含有任意人抗體的Ch中的氨基酸序列。
[0046]所謂人源化抗體，是將來(lái)自某抗體(通常為非人抗體、例如小鼠抗體)的CDR組與人抗體的FR及恒定區(qū)人為地組合而形成的嵌合體抗體(mosaic antibody)。例如,將抗人CXCLl小鼠單克隆抗體的各CDR、任意的人抗體的各FR和恒定區(qū)進(jìn)行組合得到的抗體。由于抗體的抗原結(jié)合特異性主要由可變區(qū)中的CDR組擔(dān)負(fù)，所以在制備與上述某抗體具有同樣的結(jié)合特性的重組抗體時(shí)，不需要`得到某抗體的全氨基酸序列。即，使用現(xiàn)有的重組DNA技術(shù)，制備嵌合體抗體，使其表達(dá)，所述嵌合體抗體中將編碼來(lái)自某抗體的各CDR的DNA序列分別取代為編碼來(lái)自人抗體的對(duì)應(yīng)的CDR的DNA序列，由此可以得到與某抗體的性質(zhì)相似的重組抗體。上述技術(shù)稱(chēng)作⑶R移植抗體(Nature，1986，Vol.321，522)。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的抗人CXCLl抗體或其片段用于人CXCLl或其片段的檢測(cè)時(shí)，不必一定是人源化抗體，使用上述移植抗體技術(shù)，F(xiàn)R及恒定區(qū)也可以來(lái)自除人之外的任意動(dòng)物的抗體。
[0047]進(jìn)而，本發(fā)明中的“抗體”可以為多重特異性抗體。所謂多重特異性抗體，是指多價(jià)抗體，即在一分子內(nèi)具有多個(gè)抗原結(jié)合部位的抗體中各個(gè)抗原結(jié)合部位與不同的表位結(jié)合的抗體。例如，可以舉出在IgG之類(lèi)的具有2個(gè)抗原結(jié)合部位的抗體中各個(gè)抗原結(jié)合部位與不同的表位結(jié)合的雙特異性抗體(Bispecific抗體)。在本發(fā)明中，上述多重特異性抗體優(yōu)選各個(gè)抗原結(jié)合部位可以與人CXCLl上存在的不同表位結(jié)合?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)，根據(jù)公知方法，通過(guò)人工改變IgG等得到上述抗體。
[0048]在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“單克隆抗體或其片段”中的“其片段”，是指上述抗體的部分區(qū)域，即，具有與該抗體具有的抗原特異性結(jié)合活性實(shí)質(zhì)上同等的活性的多肽鏈或其復(fù)合體。例如，包含至少一個(gè)上述抗原結(jié)合部位的抗體部分，即具有至少I(mǎi)個(gè)'和至少一個(gè)Vh的多肽鏈或其復(fù)合體。作為具體例，可以舉出通過(guò)用各種肽酶切斷免疫球蛋白產(chǎn)生的多個(gè)被充分付與特征的抗體片段等。作為更具體的例子，可以舉出Fab、F(ab’)2、Fab’等。Fab是通過(guò)用木瓜蛋白酶在比鉸合部的二硫鍵更接近N末端側(cè)切斷IgG分子而產(chǎn)生的片段，由多肽和輕鏈構(gòu)成，所述多肽含有Vh及構(gòu)成Ch的3個(gè)結(jié)構(gòu)域(CH1、Ch2、Ch3)中與Vh相鄰的Ch10 F(ab’)2是通過(guò)由胃蛋白酶在比鉸合部的二硫鍵更接近C末端側(cè)切斷IgG分子產(chǎn)生的Fab’的二聚體。與Fab相比，F(xiàn)ab’含有鉸合部，所以Fab’的H鏈稍長(zhǎng)，但實(shí)質(zhì)上Fab’具有與 Fab 同等的結(jié)構(gòu)(Fundamental Immunology,Paul ed., 3d ed., 1993)。Fab’可以通過(guò)在溫和的條件下還原F(ab’)2、切斷鉸鏈區(qū)的二硫鍵而得到。上述抗體片段均包含抗原結(jié)合部位，具有與抗原(即本發(fā)明中的人CXCLl或其片段)特異性結(jié)合的能力。
[0049]本發(fā)明的上述“其片段”可以通過(guò)化學(xué)合成或使用重組DNA法合成。例如，可以舉出使用重組DNA法新合成的抗體片段。雖然沒(méi)有限定，但具體而言可以舉出:通過(guò)具有適當(dāng)長(zhǎng)度及序列的連接肽等使本發(fā)明抗體的一個(gè)以上\及一個(gè)以上Vh人工連接形成的單體多肽分子、或其多聚體多肽。作為上述多肽的例子，可以舉出單鏈Fv(SCFv:singlechain Fragment of variable region)(參見(jiàn)Pierce catalog and Handbook, 1994-1995,Pierce Chemical c0.，Rockford, IL)、雙抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)或四鏈抗體(tetrabody)等合成抗體等。在免疫球蛋白分子中，Vlj及Vh通常分別位于多肽鏈(輕鏈和重鏈)上。單鏈Fv為具有下述結(jié)構(gòu)的合成抗體片段，所述結(jié)構(gòu)為上述可變區(qū)通過(guò)具有足夠長(zhǎng)度的柔性連接體進(jìn)行連接，包含在I條多肽鏈中。在單鏈Fv內(nèi)，兩可變區(qū)可以相互之間自組裝，形成I個(gè)功能性的抗原結(jié)合部位。單鏈Fv可以通過(guò)使用公知技術(shù)將編碼單鏈Fv的重組DNA參入噬菌體基因組，使其表達(dá)而得到。雙抗體是具有以單鏈Fv的二聚體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)的分子(H olliger et al.，1993, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448)。例如，上述連接體的長(zhǎng)度約短于12個(gè)氨基酸殘基時(shí)，單鏈Fv內(nèi)的2個(gè)可變部位不能自組裝，但是通過(guò)形成雙抗體，即，通過(guò)使2個(gè)單鏈Fv相互作用，一條Fv鏈的\與另一條Fv鏈的Vh能夠組裝，可以形成2功能性的抗原結(jié)合部位(Marvin et al., 2005, Acta Pharmacol.Sin., 26:649-658)。進(jìn)而,通過(guò)向單鏈Fv的C末端添加半胱氨酸殘基,2條Fv鏈之間的二硫鍵可以形成，也可以形成穩(wěn)定的雙抗體(Olafsen et al, 2004, Prot.，Engr, Des.Sel.，17:21-27)。如上所述，雙抗體為二價(jià)的抗體片段，但不需要各個(gè)抗原結(jié)合部位與同一表位結(jié)合，可以具有雙特異性，即識(shí)別且特異性結(jié)合分別不同表位。例如，一個(gè)抗原結(jié)合部位可以含有\(zhòng)及Vh，所述\包含含有序列號(hào)36、37、38表示的氨基酸序列的CDR (分別相當(dāng)于⑶R1、⑶R2、⑶R3)，所述Vh包含含有序列號(hào)39、40、41表示的氨基酸序列的⑶R(分別相當(dāng)于⑶R1、⑶R2、⑶R3)，另一個(gè)抗原結(jié)合部位可以含有 '及Vh，所述\包含含有序列號(hào)28、29、30表示的氨基酸序列的⑶R (分別相當(dāng)于⑶R1、⑶R2、⑶R3)，所述Vh包含含有序列號(hào)31、32、33表示的氨基酸序列的⑶R(分別相當(dāng)于⑶R1、⑶R2、⑶R3)。三鏈抗體及四鏈抗體與雙抗體同樣地具有以單鏈Fv結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的三聚體及四聚體結(jié)構(gòu)。分別可以為三價(jià)及四價(jià)抗體片段、或多重特異性抗體。
[0050]進(jìn)而，上述“其片段”是使用噬菌體展示文庫(kù)鑒定的抗體片段(例如，參見(jiàn)McCafferty et al., 1990，Nature, Vol.348，522-554)，并且含有具有抗原結(jié)合能力的物質(zhì)。此外，也可以參見(jiàn)例如 Kuby, J.1mmunology, 3rd Ed., 1998, W.H.Freeman&C0.,NewYork0
[0051]本發(fā)明提供了具有下述氨基酸序列的抗體或其片段，所述氨基酸序列構(gòu)成對(duì)人CXCLl具備期望結(jié)合活性的可變區(qū)及其CDR。即，本發(fā)明提供了含有下述免疫球蛋白可變區(qū)的抗體或其片段，所述免疫球蛋白可變區(qū)含有序列號(hào)4~43中的任一個(gè)表示的氨基酸序列。
[0052]對(duì)于本發(fā)明的抗體或其片段，在其輕鏈上，⑶R1、⑶R2、⑶R3可以分別含有序列號(hào)
4、5、6表示的氨基酸序列，在其重鏈上，⑶R1、⑶R2、⑶R3可以分別含有序列號(hào)7、8、9表示
的氨基酸序列。
[0053]另外，在本發(fā)明的抗體或其片段中，'及Vh可以分別含有序列號(hào)10、序列號(hào)11表示的氨基酸序列。
[0054]對(duì)于本發(fā)明的抗體或其片段，在其輕鏈上，⑶R1、⑶R2、⑶R3可以分別含有序列號(hào)12、13、14表示的氨基酸序列，在其重鏈上，⑶R1XDR2、⑶R3可以分別含有序列號(hào)15、16、17
表示的氨基酸序列。
[0055]另外，在本發(fā)明的抗體或其片段上，'及Vh可以分別含有序列號(hào)18、序列號(hào)19表示的氨基酸序列。
[0056]對(duì)于本發(fā)明的抗體或其片段，在其輕鏈上，⑶R1、⑶R2、⑶R3可以分別含有序列號(hào)20、21、22表示的氨基酸序列，在其重鏈上，CDRl、CDR2、CDR3可以分別含有序列號(hào)23、24、25
表示的氨基酸序列。
[0057]另外，在本發(fā)明的抗體或其片段上，Vl及Vh可以分別含有序列號(hào)26、序列號(hào)27表示的氨基酸序列。
[0058]對(duì)于本發(fā)明的抗體或其片段，在其輕鏈上，⑶R1、⑶R2、⑶R3可以分別含有序列號(hào)28、29、30表示的氨基酸序列，在其重鏈上，CDRl、CDR2、CDR3可以分別含有序列號(hào)31、32、33
表示的氨基酸序列。
[0059]另外，在本發(fā)明的抗體或其片段上，Vl及Vh可以分別含有序列號(hào)34、序列號(hào)35表示的氨基酸序列。
[0060]對(duì)于本發(fā)明的抗體或其片段，在其輕鏈上，⑶R1、⑶R2、⑶R3可以分別含有序列號(hào)36、37、38表示的氨基酸序列，在其重鏈上，CDRl、CDR2、CDR3可以分別含有序列號(hào)39、40、41
表示的氨基酸序列。
[0061]另外，在本發(fā)明的抗體或其片段上，Vl及Vh可以分別含有序列號(hào)42、序列號(hào)43表示的氨基酸序列。
[0062]本發(fā)明的抗體或其片段可以進(jìn)行修飾。此處所述的“修飾”，包括下述任一種:在本發(fā)明的抗體或其片段具有與人CXCLl的特異性結(jié)合活性的方面所需要的功能上的修飾(例如糖基化)、及在檢測(cè)本發(fā)明的抗體或其片段方面所需要的標(biāo)記。上述抗體標(biāo)記中，例如可以舉出采用熒光染料(FITC、羅丹明、德克薩斯紅、Cy3、Cy5)、熒光蛋白質(zhì)(例如PE、APC、GFP)、酶(例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶)、生物素或(鏈霉)抗生物素的標(biāo)記。另外，為了調(diào)節(jié)抗體對(duì)靶抗原的親和性，可以改變本發(fā)明的抗體的糖基化。上述改變例如可以通過(guò)變更抗體序列內(nèi)的一個(gè)以上的糖基化部位而達(dá)成。更具體地進(jìn)行說(shuō)明，例如向構(gòu)成FR內(nèi)的一個(gè)以上糖基化部位的氨基酸序列中導(dǎo)入一個(gè)以上的氨基酸取代，除去該糖基化部位，由此可以使所述部位的糖基化喪失。上述脫糖基化在增加抗體對(duì)抗原的親和性的方面有效(美國(guó)專(zhuān)利第5714350號(hào)及美國(guó)專(zhuān)利第6350861號(hào))。
[0063]對(duì)于本發(fā)明的測(cè)定方法中使用的單克隆抗體或其片段，為了確保針對(duì)人CXCLl或其片段的特異性結(jié)合活性，優(yōu)選在使用前事先驗(yàn)證與其他抗原(蛋白質(zhì)或其片段)的交叉反應(yīng)性。在本發(fā)明的抗體或其片段中，應(yīng)確認(rèn)交叉性的抗原可以舉出屬于CXC家族的蛋白質(zhì)、特別是與人CXCLl結(jié)構(gòu)上類(lèi)似的人CXCL2蛋白質(zhì)、人CXCL3蛋白質(zhì)。另外，除上述蛋白質(zhì)之外，對(duì)于部分結(jié)構(gòu)與人CXCLl共通的其他蛋白質(zhì)，也較優(yōu)選事先確認(rèn)在本發(fā)明的測(cè)定方法中使用的抗體或其片段的交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)的確認(rèn)中，可以使用以人CXCLl作為抗原的ELISA法。應(yīng)試驗(yàn)反應(yīng)特異性的抗體，即抗人CXCLl單克隆抗體及其片段與人CXCLl的反應(yīng)時(shí)，如果使應(yīng)確認(rèn)交叉性的其他抗原蛋白質(zhì)共存，則通過(guò)觀(guān)察兩者的競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)可以進(jìn)行交叉性的確認(rèn)。利用競(jìng)爭(zhēng)抑制原理的上述交叉性的確認(rèn)方法，不需要針對(duì)所有的抗原制備反應(yīng)體系，因此可以迅速進(jìn)行篩選。
[0064]2.單克隆抗體及雜交瘤制備方法
[0065]本發(fā)明的抗人CXCLl單克隆抗體或產(chǎn)生其抗體的雜交瘤可以通過(guò)以下記載的方法進(jìn)行制備。但并不限定于所述方法，也可以使用本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的其他任何方法制備。
[0066]A.抗人CXCLl單克隆抗體制備方法
[0067]為了制備與構(gòu)成人CXCLl的氨基酸序列中的序列號(hào)I~3中的任一個(gè)氨基酸部分序列區(qū)特異性結(jié)合的抗人CXCLl單克隆抗體，存在下述方法:以人CXCLl的全長(zhǎng)作為免疫原制備單克隆抗體，之后，篩選與序列號(hào)I~3中的任一個(gè)氨基酸部分序列區(qū)特異性結(jié)合的抗體的方法；事先以序列號(hào)1、2或3表示的人CXCLl的部分序列作為免疫原，制備單克隆抗體的方法。
[0068]Al.人 CXCLl 的制備
[0069]首先，制備用作免疫原(抗原)的人CXCLl。人CXCLl可以為天然型、重組型、或肽合成等化學(xué)合成氨基酸序列的全部或一部分得到的人CXCLl中的任一種。
[0070]天然型人CXCLl可以從血`液或尿等人體液為代表的人樣品、或人培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，使用凝膠色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等公知的蛋白質(zhì)分離.純化技術(shù)進(jìn)行回收。
[0071]重組型人CXCLl可以在導(dǎo)入編碼該蛋白質(zhì)的DNA的微生物、昆蟲(chóng)細(xì)胞、或動(dòng)物細(xì)胞中使DNA表達(dá)后，使用公知的蛋白質(zhì)分離.純化技術(shù)從該細(xì)胞中進(jìn)行回收。
[0072]合成人CXCLl例如可以利用公開(kāi)的人CXCLl氨基酸序列信息，通過(guò)本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的手法例如固相肽合成法等進(jìn)行合成。需要說(shuō)明的是，人CXCLl的cDNA序列在GenBank中以登記號(hào)X12510公開(kāi)。使上述合成人CXCLl與KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)、0VA(卵清蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)等載體蛋白質(zhì)連接進(jìn)行使用。
[0073]另外，最初以序列號(hào)I~3表示的人CXCLl的部分序列作為免疫原時(shí)，免疫原與免疫全長(zhǎng)序列時(shí)同樣地，也可以為天然型、重組型、或化學(xué)合成的免疫原。
[0074]例如，使用天然型人CXCLl的部分序列作為免疫原時(shí)，首先，將經(jīng)純化的人CXCLl用胰蛋白酶等適當(dāng)?shù)牡鞍酌高M(jìn)行處理后，用反相柱分離得到峰產(chǎn)物。分離得到的各峰中含有的肽的氨基酸序列通過(guò)質(zhì)譜儀進(jìn)行確定，可以使用序列號(hào)1、2或3表示的部分序列或其一部分的峰產(chǎn)物作為免疫原。
[0075]另外，使用重組型人CXCLl的氨基酸部分序列作為免疫原時(shí)，將編碼上述人CXCLl的DNA序列中的序列號(hào)I~3表示的氨基酸部分序列、或進(jìn)而編碼上述人CXCLl的一部分的DNA序列部分，與制備全長(zhǎng)人CXCLl時(shí)同樣地插入表達(dá)用載體中，導(dǎo)入各種細(xì)胞中，由此可以得到序列號(hào)I~3表示的氨基酸部分序列或其一部分的重組型人CXCL1。
[0076]以下，針對(duì)序列號(hào)I~3表示的重組型人CXCLl的氨基酸部分序列(以下稱(chēng)作人CXCLl部分序列)的制備進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0077](a)編碼重組型人CXCLl部分序列的多核苷酸的制備
[0078]關(guān)于所述多核苷酸的制備方法，在下述實(shí)施例1中詳細(xì)說(shuō)明，故在此處省略。
[0079]作為人CXCLl部分序列的表達(dá)中使用的載體，可以使用宿主微生物中能夠自主增殖的噬菌體或質(zhì)粒。例如，作為質(zhì)粒，可以舉出來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒(pET16b、pGEX6p、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等)、來(lái)自枯草菌的質(zhì)粒(pUB110、pTP5等)、來(lái)自酵母的質(zhì)粒(YEpl3、YEp24、YCp50等)等。另外，作為噬菌體，可以舉出λ噬菌體(λ gtll、λ ZAP等)。進(jìn)而，也可以使用疫苗病毒等動(dòng)物病毒、桿狀病毒等昆蟲(chóng)病毒載體。
[0080]向上述載體 中插入編碼人CXCLl部分序列的多核苷酸時(shí)，有下述方法:例如，用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嘟?jīng)純化的該多核苷酸，使用DNA連接酶將其連接到用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗟妮d體內(nèi)部。
[0081](b)人CXCLl部分序列表達(dá)載體向宿主內(nèi)的導(dǎo)入
[0082]將得到的人CXCLl部分序列表達(dá)載體導(dǎo)入能夠表達(dá)人CXCLl蛋白質(zhì)的宿主中，可以得到人CXCLl部分序列表達(dá)轉(zhuǎn)化體。使用的宿主是與所使載體相適合的宿主，只要是能夠表達(dá)人CXCLl的宿主即可，沒(méi)有特別限定。例如，優(yōu)選使用細(xì)菌(大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草菌(例如Bacillus subtilis等)、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞(COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞(Journal of immunology, 1998, Vol.160, 3393-3402)等。向細(xì)菌中導(dǎo)入上述載體的方法，只要是向細(xì)菌中導(dǎo)入該載體的公知的方法即可，沒(méi)有特別限定。例如，可以舉出熱休克法、使用鈣離子的方法、電穿孔法等。上述技術(shù)均在本領(lǐng)域公知，且記載于各種文獻(xiàn)中。例如ii#JALSambrook, J.et at.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork0 另外，動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中，優(yōu)選使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(PNAS, 1989，Vol.86，6077)、(PNAS, 1987，Vol.84,7413)、電穿孔法、憐酸鈣法(Virology, 1973, Vol.52,456-467) > DEAE-Dextran 法等。
[0083]以細(xì)菌作為宿主時(shí)，優(yōu)選人CXCLl部分序列表達(dá)載體在該細(xì)菌中能夠自主復(fù)制，同時(shí)由啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合序列、編碼人CXCLl部分序列的DNA序列及轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成。另外，也可以含有編碼控制啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)因子的基因。啟動(dòng)子只要能夠在大腸桿菌等宿主中發(fā)揮作用即可，可以使用任何啟動(dòng)子。
[0084]以酵母、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等真核細(xì)胞作為宿主時(shí)，同樣地按照本領(lǐng)域公知的方法，也可以得到人CXCLl部分序列表達(dá)轉(zhuǎn)化體。在真核細(xì)胞中使用的人CXCLl部分序列表達(dá)載體中，除啟動(dòng)子序列、編碼人CXCLl部分序列的DNA序列之外，根據(jù)期望也可以連接增強(qiáng)子等順式作用元件、剪接信號(hào)(供體部位、接受位點(diǎn)、分支點(diǎn)等)、加PolyA信號(hào)(polyAaddition signal)、選擇標(biāo)記物序列、核糖體結(jié)合序列(SD序列)等。
[0085](c)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)及重組型人CXCLl部分序列的表達(dá)
[0086]接著，培養(yǎng)上述制備的轉(zhuǎn)化體。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法按照宿主的培養(yǎng)中使用的通常方法進(jìn)行。例如，以微生物作為宿主時(shí)，培養(yǎng)基沒(méi)有特別限定，只要含有微生物可同化的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等、且能夠生長(zhǎng)、增殖即可?？梢允褂锰烊慌囵B(yǎng)基、合成培養(yǎng)基中的任一種。作為更具體的例子，可以舉出LB培養(yǎng)基，當(dāng)然并不限定于此。另外，為了選擇性地進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)，根據(jù)需要，可以向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。培養(yǎng)通常在通氣攪拌培養(yǎng)等需氣的條件下、在37°C下進(jìn)行6~24小時(shí)。培養(yǎng)期間中，pH優(yōu)選保持在中性附近。PH的調(diào)節(jié)使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿性溶液等進(jìn)行。轉(zhuǎn)化體為CHO細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，可以將宿主細(xì)胞以I X IO5細(xì)胞/mL接種在Gibco公司制DMEM培養(yǎng)基中，在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)中根據(jù)需要，可以向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。
[0087]上述人CXCLl部分序列表達(dá)載體為含有蛋白質(zhì)表達(dá)控制系統(tǒng)(例如宿主為微生物時(shí)，相當(dāng)于阻遏基因及操縱基因等)的蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)型載體時(shí)，必需對(duì)上述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行規(guī)定的處理，誘導(dǎo)人CXCLl部分序列的表達(dá)。表達(dá)誘導(dǎo)的方法根據(jù)載體中所含的蛋白質(zhì)表達(dá)控制系統(tǒng)而不同，因此只要進(jìn)行適應(yīng)其系統(tǒng)的誘導(dǎo)處理即可。例如，在以細(xì)菌作為宿主的蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)型載體中，最常利用的蛋白質(zhì)表達(dá)控制系統(tǒng)是含有Iac阻遏基因及Iac操縱基因的系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以通過(guò)IPTG(isopropyl-l_thio-0 -D-Galactoside)處理來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)。在具有含有上述系統(tǒng)的人CXCLl表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體中，為了使作為目標(biāo)的人CXCLl表達(dá)，可以向培養(yǎng)基中添加適當(dāng)量(例如終濃度ImM)的IPTG。
[0088](d)重組型人CXCLl部分序列的提取及/或回收
[0089]培養(yǎng)后，人CXCLl部分序列在菌體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，通過(guò)回收菌體或細(xì)胞進(jìn)行破碎，可以提取蛋白質(zhì)。另外，人CXCLl部分序列在菌體外或細(xì)胞外產(chǎn)生時(shí)，可以直接使用培養(yǎng)液，或可以通過(guò)離心分離等除去菌體或細(xì)胞、使用上清。之后，通過(guò)單獨(dú)或適當(dāng)組合使用例如硫酸銨沉淀、凝膠色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等一般的蛋白質(zhì)的純化方法，可以從上述培養(yǎng)物中分離純化人CXCL1?？梢酝ㄟ^(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等確認(rèn)是否得到人CXCLl部分序列。
[0090]A2.抗人CXCLl部分序列抗體的產(chǎn)生細(xì)胞的制備
[0091]將Al中得到的免疫原溶解在緩沖液中，制備免疫原溶液。此時(shí)，為了有效地進(jìn)行免疫，如果需要可以添加佐劑。作為佐劑的例子，可以舉出市售的完全弗氏佐劑(FCA)、不完全弗氏佐劑(FIA)等，上述佐劑可以單獨(dú)使用或混合使用。
[0092]接著,對(duì)哺乳動(dòng)物、例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠的BALB/c)、兔子等給與上述制備的免疫原溶液，進(jìn)行免疫。作為免疫原的給與方法，例如可以舉出使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔內(nèi)注射、或使用0.15mol/L氯化鈉的靜脈注射，但不限定于此。免疫原的I次給與量，根據(jù)免疫動(dòng)物的種類(lèi)、給與途徑等適當(dāng)確定，每只動(dòng)物約為30~200 μ g。另外，免疫的間隔沒(méi)有特別限定，初次免疫后，以數(shù)日至數(shù)周的間隔進(jìn)行追加免疫，優(yōu)選在I~4周的間隔內(nèi)進(jìn)行2~6次、優(yōu)選進(jìn)行3~4次追加免疫。從初次免疫后，通過(guò)ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay))法等測(cè)定免疫動(dòng)物的血清中的抗體價(jià)，當(dāng)抗體價(jià)達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，向靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)注射免疫原，作為最終免疫。從最終免疫日開(kāi)始2~5天后、優(yōu)選在3天后，收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
[0093]B.產(chǎn)生抗人CXCLl部分序列單克隆抗體的雜交瘤制備方法
[0094]B1.從免疫動(dòng)物回收抗體產(chǎn)生細(xì)胞及細(xì)胞融合
[0095]通過(guò)將從免疫動(dòng)物得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，可以制備產(chǎn)生特異性識(shí)別抗人CXCLl部分序列的單克隆抗體的雜交瘤。作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞,可以舉出脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、末梢血細(xì)胞等，但優(yōu)選脾細(xì)胞或局部淋巴結(jié)細(xì)胞。作為與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞，可以使用通?？少?gòu)買(mǎi)的來(lái)自小鼠等的細(xì)胞系。作為使用的細(xì)胞株，優(yōu)選具有下述性質(zhì):具有藥劑選擇性，在未融合的狀態(tài)下不能在HAT選擇培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)中生存，只能在與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的狀態(tài)下生長(zhǎng)。另外，細(xì)胞系優(yōu)選來(lái)自于免疫動(dòng)物同種系的動(dòng)物。作為骨髓瘤細(xì)胞的具體例子，可以舉出來(lái)自BALB/c小鼠的次黃嘌呤.鳥(niǎo)嘌呤.磷酸核糖.轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷細(xì)胞株的、P3X62-Ag.8 株(ATCCTIB9)、P3X63_Ag.8.Ul 株(JCRB9085)、P3/NSI/l_Ag4_l 株(JCRB0009)、P3X63Ag8.653 株(JCRB0028)或 Sp2/0_Agl4 株(JCRB0029)等。
[0096]為了使上述骨髓瘤細(xì)胞與抗體產(chǎn)生細(xì)胞細(xì)胞融合，在不含血清的DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，以約1:1~20:1的比例混合抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下進(jìn)行融合反應(yīng)。作為細(xì)胞融合促進(jìn)劑，可以以約10~80%的濃度使用平均分子量為1，500~4，OOODa的聚乙二醇等。另外，根據(jù)情況，為了提高融合效率，可以聯(lián)用二甲基亞砜等助劑。進(jìn)而，也可以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售細(xì)胞融合裝置使抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合(Nature，1977，Vol.266，550-552)。
[0097]B2.目標(biāo)雜交瘤的選擇
[0098]作為從細(xì)胞融合處理后的細(xì)胞中選擇目標(biāo)雜交瘤、即產(chǎn)生抗人CXCLl部分序列單克隆抗體的雜交瘤的方法，例如，在含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基等中將細(xì)胞懸浮液適當(dāng)稀釋后，以約2 X IO6個(gè)/孔的程度接種在96孔微量滴定板上，各孔中加入選擇培養(yǎng)基，之后適當(dāng)?shù)亟粨Q選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20~40°C，優(yōu)選約為37°C。骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT缺陷株或胸腺嘧啶胸苷激酶(TK)缺陷株時(shí)，通過(guò)使用含有次黃嘌呤.氨基蝶呤.胸腺嘧啶脫氧核苷的選擇培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)，可以?xún)H選擇性地使抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤生長(zhǎng)、增殖，因此，可以選擇在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)開(kāi)始后約10目開(kāi)始生長(zhǎng)的細(xì)胞作為雜交瘤。
[0099]對(duì)于在HAT培養(yǎng)基中選擇的雜交瘤，首先，以針對(duì)天然型或重組型人CXCL1、或序列號(hào)I~3表示的氨基酸序列的結(jié)合活性作為指標(biāo)進(jìn)行篩選。接著，針對(duì)產(chǎn)生與人CXCLl具有結(jié)合活性的抗體的雜交瘤，進(jìn)行交`叉性的試驗(yàn)。即，驗(yàn)證與其他CXC家族等的結(jié)合活性，選擇可允許的雜交瘤。所謂“可允許的交叉性”是指在目標(biāo)抗體的用途中，可忽視程度的交叉性。例如，是用于免疫學(xué)測(cè)定的單克隆抗體時(shí)，如果在最終測(cè)定體系中由交叉反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度被控制在小于背景水平中因特異性反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度的1%，則可以認(rèn)為事實(shí)上沒(méi)有交叉反應(yīng)。
[0100]為了確認(rèn)與人CXCLl的反應(yīng)性、或與其他CXC家族的交叉反應(yīng)性，例如可以利用ELISA法。ELISA法中，準(zhǔn)備微孔板，在該微孔板中將作為抗原的人CXCLl或其片段固相化，之后向該微孔板中加入樣品使其反應(yīng)，該樣品是適當(dāng)稀釋上述雜交瘤的培養(yǎng)上清而得到的。充分反應(yīng)后，清洗孔，加入針對(duì)免疫球蛋白的2次抗體的標(biāo)記體，進(jìn)一步使其反應(yīng)。再次清洗孔，最終利用與孔結(jié)合的2次抗體的標(biāo)記進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可以定量地知曉培養(yǎng)上清中存在的抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性。
[0101]B3.使用雜交瘤產(chǎn)生抗體
[0102]本發(fā)明中的雜交瘤可以通過(guò)使用小鼠進(jìn)行腹水化，而用于抗體生產(chǎn)。具體而言，向制備雜交瘤時(shí)使用的融合伴侶所用的細(xì)胞的來(lái)源的小鼠、或裸鼠的腹腔內(nèi)接種雜交瘤，適當(dāng)收集腹水，由此可以回收含有抗體的腹水液。更具體而言，將以Sp/Ο細(xì)胞作為融合伴侶的雜交瘤接種在姥鮫烷接種后經(jīng)過(guò)10天的BALB/c小鼠的腹腔中，由此可以回收含有抗體的腹水液。
[0103]另外，本發(fā)明的雜交瘤通過(guò)使用適合的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可以用于抗體生產(chǎn)。具體而言，向Gibco公司制的雜交瘤SFM培養(yǎng)基中以I X IO5細(xì)胞/mL接種雜交瘤，在37°C的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至雜交瘤死亡，由此可以得到含有抗體的培養(yǎng)液上清,但并不限定于此。
[0104]3.重組抗人CXCLl部分序列單克隆抗體的制備方法
[0105]本發(fā)明的抗體或其片段也可以如下得到:利用編碼單克隆抗體的氨基酸序列的cDNA序列，通過(guò)重組DNA操作得到，所述單克隆抗體特異性識(shí)別本發(fā)明中公開(kāi)的人CXCLl部分序列。
[0106]例如，使用編碼氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列編碼來(lái)自用B2.方法取得的抗人CXCLl部分序列單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤的該抗體的可變區(qū)，Vh及' 的堿基序列分別與編碼任意的(^及Ch的堿基序列連接，將各個(gè)多核苷酸參入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，也可以使其表達(dá)為完全的免疫球蛋白分子。另外，使用⑶R移植抗體技術(shù)，編碼用B2.方法取得的可變區(qū)內(nèi)的CDR的氨基酸序列的多核苷酸與編碼任意的免疫球蛋白的各FR的多核苷酸連接，參入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，也可以表達(dá)為完全的免疫球蛋白分子。各多核苷酸可以化學(xué)合成，也可以采用作為長(zhǎng)鏈DNA的合成法已知的藤本等的方法(藤本英也，合成基因的制備法，植物細(xì)胞工程系列7，植物PCR實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)，1997，秀潤(rùn)社，P95-100)合成。另外，本發(fā)明中公開(kāi)的CDR原本來(lái)自小鼠的免疫球蛋白，因此，連接的Q、Ch及FR區(qū)的序列優(yōu)選來(lái)自小鼠，但也可以來(lái)自人等其他任意動(dòng)物。此時(shí)，重鏈與輕鏈在同一宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，以由重鏈/輕鏈構(gòu)成的二聚體形式生成，十分便利。具體而言，例如利用輕鏈表達(dá)載體及重鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞也可以得到本發(fā)明的抗體。或者，也可以將編碼上述氨基酸序列的多核苷酸直接參入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，以免疫球蛋白分子的片段的形式進(jìn)行表達(dá)?；蛘?，如上所述，利用適當(dāng)?shù)倪B接體連接分別編碼含有上述氨基酸序列的\及Vh、或輕鏈及重鏈的多核苷酸，參入噬菌體，形成單鏈Fv，也可以以該單鏈Fv或雙抗體等的合成抗體片段的形式進(jìn)行表達(dá)。另外，通過(guò)利用近年來(lái)開(kāi)發(fā)的基因工程技術(shù)使重組抗體在噬菌體表面表達(dá)的噬菌體展示抗體技術(shù)(Brinkmann et al, 1995, J Tmmunol Methods, 182,41-50,國(guó)際公開(kāi)W097/13844號(hào)，國(guó)際公開(kāi)W090-02809號(hào))，人工地改組編碼重鏈、輕鏈的基因，多樣化的單鏈Fv抗體以噬菌體融合蛋白的形式表達(dá)，由此也可以得到特異抗體。
[0107]編碼重組抗人CXCLl部分序列單克隆抗體或其片段的多核苷酸的制備，參入該多核苷酸的載體、該載體的宿主導(dǎo)入法，可以使用上述“A.人CXCLl抗體制備方法”中記載的本領(lǐng)域中公知的重組DNA技術(shù)。目標(biāo)重組抗人CXCLl抗體或其片段可以從轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)液中或該細(xì)胞內(nèi)得到。
[0108]作為免疫球蛋白表達(dá)載體，例如可以使用質(zhì)粒、噬菌粒、黏粒、病毒載體(例如SV40病毒表達(dá)載體、EB病毒表達(dá)載體、BPV表達(dá)載體)等，但不限定于此。例如，作為BPV表達(dá)載體之一的BCMGS Neo載體，是通過(guò)轉(zhuǎn)化為C0S7細(xì)胞等有效表達(dá)外來(lái)基因的優(yōu)選載體(鳥(niǎo)山一“牛乳頭瘤病毒載體”、村松正實(shí)及網(wǎng)山博人編，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分冊(cè):基因工程手冊(cè)，1991，羊土公司(日本)，297-299)。
[0109]除編碼抗體或其片段的多核苷酸之外，上述載體還可以含有表達(dá)上述抗體或其片段所需要的調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接位點(diǎn))、或根據(jù)需要還可以含有選擇標(biāo)記物。
[0110]作為轉(zhuǎn)化的宿主，除上述“A.抗人CXCLl單克隆抗體制備方法”中記載的宿主之外，還可以?xún)?yōu)選使用Sp2/0 (小鼠骨髓瘤)細(xì)胞(European Journal of Cancer ResarchPreview(1996)Vol.5，512-519 ；Cancer Resarch(1990)Vol.50，1495-1502)。
[0111]本發(fā)明中，含有表達(dá)抗體或其片段的載體的宿主細(xì)胞通過(guò)按照通常方法進(jìn)行培養(yǎng)，可以使其培養(yǎng)液上清或宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗體。具體而言，以CHO細(xì)胞作為宿主時(shí)，將宿主細(xì)胞以I X IO5細(xì)胞/mL接種在Gibco公司制DMEM培養(yǎng)基中，在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由此可以得到含有抗體的培養(yǎng)液上清。另外,例如宿主細(xì)胞為大腸桿菌時(shí),通過(guò)接種在LB培養(yǎng)基等大腸桿菌培養(yǎng)中使用的一般的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以使培養(yǎng)液上清或宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗體。
[0112]需要說(shuō)明的是，作為表達(dá)產(chǎn)物的抗體或其片段含有恒定區(qū)時(shí)，使用蛋白A柱、蛋白G柱、抗免疫球蛋白抗體親和柱等，可以從培養(yǎng)液上清、細(xì)胞破碎液中純化.回收。另一方面，以只由可變區(qū)構(gòu)成、不含有恒定區(qū)的狀態(tài)表達(dá)時(shí)，上述純化方法不適用，因此應(yīng)用其他適當(dāng)?shù)募兓椒ā＠?，以在C末端融合有組氨酸標(biāo)簽等有利于純化的標(biāo)簽序列的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，可以通過(guò)利用對(duì)應(yīng)配體的親和色譜法進(jìn)行純化。不是標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)時(shí)，可以按照硫酸銨沉淀、離子交換色譜法、反相色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法、羥磷灰石色譜法等蛋白質(zhì)純化的通常方法進(jìn)行純化。
[0113]4.得到的抗人CXCLl單克隆抗體識(shí)別的人CXCLl上的表位的確認(rèn)
[0114]得到的抗人CXCLl單克隆抗體識(shí)別的人CXCLl上的表位，通過(guò)如下所述的方法進(jìn)行確認(rèn)。
[0115]首先，使還原烷基化的 人CXCLl與抗人CXCLl單克隆抗體反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合體后，使用胰蛋白酶等適當(dāng)?shù)牡鞍酌高M(jìn)行分解處理。即使經(jīng)過(guò)分解處理，抗體也難以被胰蛋白酶消化，因此，可以使用ProteinG瓊脂糖等回收抗原抗體復(fù)合體。此時(shí)，抗原通過(guò)蛋白酶處理，除與抗體結(jié)合被保護(hù)的部分之外，其余部分被消化，因此，回收的抗原抗體復(fù)合體通過(guò)使用LC-MS進(jìn)行分析，可以鑒定與抗體結(jié)合被保護(hù)的部分、即抗體識(shí)別的人CXCLl上的表位。
[0116]另外，抗人CXCLl單克隆抗體識(shí)別的人CXCLl上的表位，例如也可以通過(guò)使用合成肽的競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行確認(rèn)。首先，通過(guò)構(gòu)成人CXCLl的氨基酸序列中的每4~8氨基酸的固相合成法等制備合成肽。在利用上述ELISA法確認(rèn)針對(duì)人CXCLl的結(jié)合性的實(shí)驗(yàn)中，在使抗人CXCLl單克隆抗體與固相人CXCLl反應(yīng)時(shí)，使所述合成肽作用，如果確認(rèn)抑制了抗人CXCLl單克隆抗體的結(jié)合，則可以判斷該合成肽的氨基酸序列為抗人CXCLl單克隆抗體識(shí)別的表位。
[0117]5.人CXCLl檢測(cè)方法
[0118]本發(fā)明中，通過(guò)使用如上所述得到的單克隆抗體或其片段，可以獲得人CXCLl的免疫學(xué)測(cè)定方法。本發(fā)明的測(cè)定方法針對(duì)人CXCLl的特異性?xún)?yōu)異，可以提供人CXCLl理想的免疫學(xué)測(cè)定方法。
[0119]本發(fā)明的測(cè)定方法中使用的所謂“樣品”，是指含有人CXCLl的各種樣品。例如，為含有編碼人CXCLl的DNA或其片段的培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞破碎液、培養(yǎng)液上清或人樣品。所謂人樣品是從人體內(nèi)收集的組織(例如術(shù)后收集的組織)、血液、血清、血漿、尿、脊髓液、唾液、淋巴液、淚液、精液等體液等所有來(lái)自人的生物樣品，優(yōu)選為血液、血清、血漿或尿。另外，本發(fā)明中的樣品不僅可以為液體樣品，也可以為固體樣品。例如，可以使用組織切片樣本等。對(duì)組織切片樣本進(jìn)行本發(fā)明的人CXCLl測(cè)定方法時(shí)，可以在原位觀(guān)察人CXCLl的有無(wú)或局部存在，因此很方便。
[0120]本發(fā)明的特征在于，組合2種以上的上述抗人CXCLl部分序列單克隆抗體或其片段，該2種以上的抗人CXCLl部分序列單克隆抗體或其片段特異性識(shí)別構(gòu)成人CXCLl的氨基酸序列的部分序列即序列號(hào)I~3表示的氨基酸序列中的任一序列區(qū)、且特異性識(shí)別各個(gè)不同的序列區(qū)，優(yōu)選組合2種上述抗人CXCLl部分序列單克隆抗體或其片段，較優(yōu)選以含有特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的抗人CXCLl單克隆抗體的組合進(jìn)行使用。通過(guò)組合分別識(shí)別人CXCLl不同的氨基酸序列區(qū)的抗人CXCLl部分序列單克隆抗體或其片段，有助于提高人CXCLl的檢測(cè)靈敏度。
[0121]本發(fā)明的免疫學(xué)的測(cè)定可以通過(guò)使用ELISA法、EIA法、熒光免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法或放射免疫測(cè)定法等標(biāo)記抗體的公知的免疫學(xué)的測(cè)定法、或表面等離子體共振法(SPR法)、石英晶體微天平測(cè)定法(QCM法)實(shí)施，優(yōu)選適于使用標(biāo)記抗體的免疫學(xué)的測(cè)定法。
[0122]ELISA法也稱(chēng)作酶聯(lián)免疫吸附分析法，是使用酶標(biāo)記的抗體或抗原、利用所述酶的作用，在抗原抗體反應(yīng)中以顯色濃度或熒光強(qiáng)度的形式檢測(cè)樣品中含有的微量的靶抗原，定量靶抗原的方法。即，將本發(fā)明的抗體或其片段、或者人CXCLl或其片段固定在固相載體中，酶檢測(cè)與該抗體等及人CXCLl等的免疫學(xué)反應(yīng)的方法。有直接法、間接法、夾心法等方法，本發(fā)明應(yīng)用于夾心法。關(guān)于ELISA法的測(cè)定方法，請(qǐng)參照公知的方法(日本臨床病理學(xué)會(huì)編“臨床病理臨時(shí)增刊特集第53號(hào)用于臨床檢查的免疫測(cè)定技術(shù)及應(yīng)用_，，，臨床病理刊行會(huì)，1983年；石川榮治等編“酶免疫測(cè)定法”，第3版，醫(yī)學(xué)書(shū)院，1987年；北川常廣等編“蛋白質(zhì)核酸酶分冊(cè)N0.31酶免疫測(cè)定法”，共立出版，1987年，入江寶編“放射免疫測(cè)定法”，講談社Scientific，1974年`；入江寶編“放射免疫測(cè)定法續(xù)”，講談社Scientific，1979年)。作為上述固相載體，可以使用聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、乳膠、明膠、瓊脂糖、纖維素、瓊脂糖、玻璃、金屬、陶瓷或磁性體等材料形成的微珠、微孔板、試管、棒或試驗(yàn)片等形狀的不溶性載體。本發(fā)明的抗體或其片段、或者人CXCLl或其片段在固相載體上的固定，可以通過(guò)按照物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法或上述方法的聯(lián)用等公知的方法使其結(jié)合而達(dá)成。
[0123]作為上述標(biāo)記物質(zhì)，例如在ELISA法的情況，可以使用過(guò)氧化物酶(POD)、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡糖氧化酶、乳酸脫氫酶、淀粉酶或生物素-抗生物素復(fù)合體等；在熒光免疫測(cè)定法的情況，可以使用異硫氰酸熒光素、四甲基羅丹明異硫氰酸酯、取代羅丹明異硫氰酸酯、二氯三嗪異硫氰酸酯(dichlorotriazineisothiocyanate)、Alexa480或AlexaFluor488等；在放射免疫測(cè)定法的情況,可以使用氣、碘125或碘131等，但并不限定于此。
[0124]另外，發(fā)光免疫測(cè)定法可以使用NADH-FMNH2-熒光素酶系統(tǒng)、氨基苯二酰肼-過(guò)氧化氫-POD系統(tǒng)、Π丫唳酯(acridinium ester)系統(tǒng)或二氧雜環(huán)丁燒化合物系統(tǒng)等。標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合法，在ELISA法的情況，可以使用戊二醛法、馬來(lái)酰亞胺法、吡啶二硫醚(pyridyl disulfide)法或高碘酸法等公知的方法,在放射免疫測(cè)定法的情況,可以使用氯胺T法、Bolton-Hunter法等公知的方法。
[0125]進(jìn)而，本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法，也可以如下進(jìn)行:對(duì)由免疫比濁法、乳膠凝集反應(yīng)、乳膠比池法、紅細(xì)胞凝集反應(yīng)或粒子凝集反應(yīng)等的免疫復(fù)合體凝集物的生成,可以通過(guò)光學(xué)方法或目視測(cè)定其透射光或散射光。這種情況下，作為溶劑，可以使用磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液或Good’ s緩沖液等，進(jìn)而，也可含有聚乙二醇等反應(yīng)促進(jìn)劑或非特異性反應(yīng)抑制劑。
[0126]本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法中，優(yōu)選從3種上述抗人CXCLl部分序列單克隆抗體或其片段中選擇2種使用。關(guān)于具體的方法，作為例子，舉出了使用特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體、和特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體的情況，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限定于此。
[0127]例如，應(yīng)用于ELISA法的夾心法時(shí)，首先，將特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體固相化在不溶性的載體上。固相化的抗體為特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)的抗體時(shí)，可以為I種，也可以為多種。接著，在抗體的固相化表面上，使含有人CXCLl的樣品作用，在載體的表面形成固相化抗體與人CXCLl的復(fù)合體。之后，通過(guò)使用洗滌液充分清洗，除去樣品中存在的除人CXCLl之外的未結(jié)合物質(zhì)。進(jìn)而，制備特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體的標(biāo)記體，使該標(biāo)記抗體與結(jié)合有固相化抗體與人CXCLl的復(fù)合體的載體發(fā)生作用，使用洗滌液充分清洗后，利用標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，由此可以檢測(cè)樣品中存在的人CXCL1。此時(shí)，標(biāo)記抗體為特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體時(shí)，可以為I種，也可以為多種，但優(yōu)選使用2種以上，較優(yōu)選使用2種。另外，特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體與特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體的來(lái)源動(dòng)物種類(lèi)不同時(shí)，即使不對(duì)特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體進(jìn) 行標(biāo)記，使用識(shí)別特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的抗體的標(biāo)記二次抗體，也可以檢測(cè)。
[0128]使用特異性識(shí)別序列號(hào)2表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體時(shí)，與上述相同。另外，固相化中使用的抗體與標(biāo)記中使用的抗體，也可以分別相反地用于標(biāo)記和固相化。
[0129]另外，預(yù)先將標(biāo)記抗體與含有人CXCLl的樣品混合，形成抗原抗體復(fù)合體后,也可以在固相化抗體上作用。對(duì)固相化的抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記時(shí)，將生物素化固相化抗體、含有人CXCLl的樣品、實(shí)施除生物素之外的標(biāo)記的抗體全部混合，形成抗原抗體復(fù)合體后，通過(guò)與將抗生物素固相化的載體作用，利用除生物素化之外的標(biāo)記可以檢測(cè)抗原抗體復(fù)合體。
[0130]進(jìn)而，本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法，也可以使用免疫色譜法用試驗(yàn)條帶。所謂免疫色譜法用試驗(yàn)條帶，例如包括:由易于吸收樣品的材料形成的樣品接受部、含有標(biāo)記的本發(fā)明的診斷劑的試劑部、樣品與診斷劑的反應(yīng)物移動(dòng)的展開(kāi)部、捕捉展開(kāi)的反應(yīng)物進(jìn)行顯色的顯示部等。市售的妊娠診斷劑等具有與上述相同的形態(tài)。本測(cè)定方法的原理如下所述。首先，將樣品供給樣品接受部，樣品接受部吸收樣品，使樣品到達(dá)試劑部。接著，試劑部中，樣品中的人CXCLl與標(biāo)記的上述抗人CXCLl部分序列單克隆抗體或其片段發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成的反應(yīng)復(fù)合體在展開(kāi)部中移動(dòng)，到達(dá)顯示部。在顯示部中，上述反應(yīng)復(fù)合體和另一種抗人CXCLl部分序列單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，所述另一種抗人CXCLl部分序列單克隆抗體與標(biāo)記的單克隆抗體不同且識(shí)別CXCLl部分序列，之后所得的反應(yīng)復(fù)合體被捕捉，可以呈現(xiàn)出由反應(yīng)復(fù)合體的標(biāo)記產(chǎn)生的顯色。上述免疫色譜法用試驗(yàn)條帶，侵襲性極低，不會(huì)對(duì)使用者造成痛苦或因使用試劑產(chǎn)生危險(xiǎn)，因此，可以用于家庭監(jiān)測(cè)，基于其結(jié)果能夠以各醫(yī)療機(jī)構(gòu)的水平進(jìn)行細(xì)查.治療(外科的切除等)，可以用于預(yù)防轉(zhuǎn)移.復(fù)發(fā)。另外，目前對(duì)于上述試驗(yàn)條帶，例如通過(guò)如日本特開(kāi)平10-54830號(hào)公報(bào)中記載的制造方法可以低成本大
量生產(chǎn)。
[0131]舉例說(shuō)明使用特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體、及特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體的情況時(shí)，首先，將含有人CXCLl的樣品給予樣品接受部，樣品接受部吸收該樣品使該樣品達(dá)到試劑部。接著，在試劑部中，樣品中的來(lái)自尿路上皮癌細(xì)胞的人CXCLl與特異性識(shí)別標(biāo)記的本發(fā)明的序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)的復(fù)合體在展開(kāi)部移動(dòng)，到達(dá)顯示部。在顯示部中，上述反應(yīng)復(fù)合體與特異性識(shí)別序列號(hào)3表示的氨基酸序列區(qū)的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，從而見(jiàn)到顯色。
[0132]另外，本發(fā)明的測(cè)定方法也可以使用表面等離子體共振法(SPR法)。所謂表面等離子體共振現(xiàn)象，是指以特定的入射角度(共振角)向金屬薄膜照射激光時(shí)反射光強(qiáng)度顯著衰減的現(xiàn)象。利用SPR現(xiàn)象原理的SPR傳感器，可以以高靈敏度測(cè)定金屬薄膜表面上的吸附物。因此，在該金屬薄膜表面上事先將抗體及/或靶抗原固相化，通過(guò)使樣品在該金屬薄膜表面上通過(guò)，可以檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的樣品通過(guò)前后的金屬表面上的吸附物的差。已知取代法、間接競(jìng)爭(zhēng)法等，可以使用任一種。本技術(shù)在本領(lǐng)域公知。例如，請(qǐng)參照永田和弘、半田宏，生物物質(zhì)相互作用的實(shí)時(shí)分析實(shí)驗(yàn)法，Springer.Verlag東京,東京，2000。
[0133]進(jìn)而，本發(fā)明的測(cè)定方法也可以使用石英晶體微天平測(cè)定法(QCM法)。所述方法利用下述現(xiàn)象:物質(zhì)吸附在安裝在石英振蕩器上的電極表面時(shí)，根據(jù)其質(zhì)量石英振蕩器的共振頻率減少。使用該方法的QCM傳感器，是根據(jù)水共振頻率的變化量，定量地捕捉極微量的吸附物的質(zhì)量測(cè)定傳感器。本技術(shù)在本領(lǐng)域公知。例如，參見(jiàn)J.ChristopherLove, L.A.Estroff, J.K.Kriebel, R.G.Nuzzo, G.M.Whitesides, 2005, Self-Assembled,Monolayers of a Form of Nanotechnology,Chemical Review, 105:1103-1169 ;森泉豐榮、中本高道，1997，傳感器工程，昭晃堂，等。
[0134]6.人CXCLl檢測(cè)試劑盒
[0135]另外，本發(fā)明可以作為用于實(shí)施上述免疫學(xué)的測(cè)定方法的試劑盒使用。即，以本發(fā)明的抗體或其片段為代表，可以將該抗體或該片段、標(biāo)記二次抗體、以及標(biāo)記的檢測(cè)需要的基質(zhì)、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照、或樣品的稀釋和清洗中使用的緩沖液等組合，制成試劑盒。
[0136]實(shí)施例
[0137]以下，利用實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于所述實(shí)施例。
[0138](實(shí)施例1)使用大腸桿菌制備重組型人CXCLl
[0139](人CXCLl基因的制備)
[0140]為了制備用作抗體的免疫原的重組型人CXCL1，首先，使用HEK293細(xì)胞制備人CXCLlmRNA。mRNA 的制備使用 Qiashredder 及 RNeasy mini kit (Qiagen 公司制),按照附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行詳細(xì)操作。
[0141]然后，使用逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII (invitrogen公司制),以得到的總mRNA為模板合成cDNA，制備人cDNA文庫(kù)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照上述酶附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行操作。
[0142]接著，以得到的人cDNA文庫(kù)為I旲板，使用由序列號(hào)44及45表不的喊基序列構(gòu)成的引物集進(jìn)行PCR。序列號(hào)44表不的喊基序列含有人CXCLl基因的5’末端區(qū)的一部分及在其上游的NdeI識(shí)別序列。序列號(hào)45表不的喊基序列含有人CXCLl基因的3’末端區(qū)的一部分和在其下游的BamHI識(shí)別序列。使用KOD(東洋紡公司制)作為DNA聚合酶，按照KOD附帶的操作說(shuō)明制備PCR的反應(yīng)液，使其含有IOng cDNA文庫(kù)及IOpmol各引物。反應(yīng)條件為在94°C的溫度下加熱10分鐘后，在94°C下保持30秒、在55°C下保持30秒、在72°C下保持I分鐘，將上述循環(huán)重復(fù)30次后，最后在72°C下保溫4分鐘。擴(kuò)增的DNA片段使用Quantum prep PCR Kleen Spin Columns (Bio-rad公司制)進(jìn)行純化。通過(guò)上述反應(yīng)得到全長(zhǎng)約300bp的PCR產(chǎn)物。
[0143]為了將得到的DNA片段參入經(jīng)過(guò)HincII切斷及BAP處理的開(kāi)環(huán)pUCl 18 (TakaraBio公司制)內(nèi)，而進(jìn)行連接反應(yīng)。使用Ligation High (東洋紡公司制)作為DNA連接酶，按照附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)。接著，使用連接反應(yīng)后的溶液，進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。作為感受態(tài)細(xì)胞，使用大腸桿菌株DH5ci (Takara Bio公司制)，詳細(xì)操作按照附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化處理后的菌體涂布在含有100 μ g/mL抗生素氨芐青霉素的LB平板上，在37°C下培養(yǎng)一夜。所得的轉(zhuǎn)化體在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)一夜，通過(guò)小量制備(min1-prep)得到目標(biāo)pUC118_CXCLl。
[0144]然后，使用限制酶NdeI及BamHI切斷pUCl 18-CXCL1，進(jìn)行反應(yīng)溶液的瓊脂糖電泳。電泳后，從凝膠切出通過(guò)紫外線(xiàn)照射確認(rèn)的約300bp的片段，進(jìn)行DNA片段的提取。使用PCR GFX Column (GE Healthcare Bio-Sciences 公司制)進(jìn)行提取。為了將提取的 DNA 片段參入經(jīng)過(guò)Ndel/BamHI切斷處理的表達(dá)載體pET16b (Novagen公司制)(約6kb片段)內(nèi)，進(jìn)行連接反應(yīng)。接著，使用連接反應(yīng)后的溶液進(jìn)行DH5CI的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)、及小量制備，得到目標(biāo)pET16b_CXCLl。各個(gè)步驟按照上述方法進(jìn)行。
[0145](重組型人CXCLl的制備)
[0146]為了制備重組型人CXCLl，使用pET16b_CXCLl進(jìn)行大腸桿菌株Rosetta-Gami2 (Novagen公司制)的轉(zhuǎn)化。將得到的轉(zhuǎn)化體在30mL含有氨節(jié)青霉素及氯霉素的LB培養(yǎng)基中、37°C下進(jìn)行一夜前培養(yǎng)。然后，將前培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體接種在3L相同培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)3小時(shí)，添加終濃度ImM的IPTG，在32°C下培養(yǎng)6小時(shí)，誘導(dǎo)目標(biāo)重組型人CXCLl的表達(dá)后，通過(guò)離心分離回收菌體。
[0147]將得到的菌體用PBS清洗后，使用B-PER (PIERCE公司制)以沉淀的形成制備得到不溶性級(jí)分。具體操作按照附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行。然后，使用包涵體溶解試劑(Inclusionbody solubilization Reagent) (PIERCE公司制)將不溶性級(jí)分可溶化后，使用TALON金屬親和性樹(shù)脂(TALON Metal Affinity Resin) (CL0NETECH公司制)使組氨酸標(biāo)簽融合人CXCLl吸附。將蛋白質(zhì)吸附的樹(shù)脂用含有IOmM咪唑的PBS進(jìn)行清洗后，使用IM咪唑溶液溶出。
[0148]接著，利用得到的溶出級(jí)分進(jìn)行蛋白質(zhì)的重折疊。首先，在加入6M尿素的PBS溶液中透析一夜后，向透析液中分步地加入PBS直至透析液中的尿素終濃度為1M，進(jìn)行稀釋。最后，在新配制的PBS溶液中透析一夜，對(duì)得到的重折疊溶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用考馬斯亮藍(lán)染色確認(rèn)分子量約10，OOODa的組氨酸標(biāo)簽融合人CXCLl的純化。[0149](實(shí)施例2)針對(duì)人CXCLl的小鼠單克隆抗體的制備及選擇
[0150](抗人CXCLl抗體產(chǎn)生小鼠的制作)
[0151]將實(shí)施例1 得到的 100 μ L0.3mg/mL 人 CXCLl 溶液與 100 μ LMPL+TDMEmulsion(Corixa公司制)混合，將其全部腹腔給與7周齡的BALB/c小鼠。在2周后及4周后，給與相同量的同樣配制的人CXCLl溶液。接著，從小鼠尾部靜脈采集100 μ L血液，靜置一夜后，以5000Xg離心5分鐘，回收上清作為血衆(zhòng)。
[0152]向96孔聚苯乙烯平板(Greiner公司制)的孔中加入100 μ L的I μ g/mL人CXCLl溶液，固相化一夜。棄去孔中的蛋白溶液后，注入200 μ L稀釋至4倍的BlockAce溶液(大日本住友制藥公司制)，在室溫下靜置I小時(shí)。之后，用PBS-T清洗，制成人CXCLl固相化平板。將上述得到的血漿稀釋100倍，向上述人CXCLl固相化平板的孔中加入100 μ L，在室溫下靜置I小時(shí)。之后，棄去孔中的溶液，用PBS-T清洗后，加入100 μ L HRP標(biāo)記抗小鼠IgG溶液(Dako公司制)，進(jìn)而在室溫下靜置I小時(shí)。棄去孔中的溶液，用PBS-T清洗后，加入100 μ LTMB溶液，使其反應(yīng)15分鐘。在450nm的吸光度下確認(rèn)由反應(yīng)產(chǎn)生的顯色，判斷在顯色的血液樣品中產(chǎn)生了針對(duì)人CXCLl的抗體。
[0153](抗人CXCLl單克隆抗體的制備)
[0154]對(duì)于已經(jīng)確認(rèn)產(chǎn)生了針對(duì)人CXCLl的抗體的小鼠，腹腔給與與上述同樣配制的人CXCLl溶液，3天后摘出脾。用注射器在摘出的脾上開(kāi)個(gè)孔，注入RPMI1640培養(yǎng)基(GIBC0公司制)擠壓脾細(xì)胞，得到脾細(xì)胞液。得到的脾細(xì)胞液在1200rpm下離心7分鐘后除去上清，在RPMI1640培養(yǎng)基中清洗。再次混懸于RPMI1640培養(yǎng)基中，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，配制脾細(xì)胞數(shù)1/10量的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞液。將兩細(xì)胞液混合，在2200rpm下離心10分鐘，棄去上清。用穿刺術(shù)(tapping)使細(xì)胞松散，添加將PEG (R0CHE公司制)和HBSS (GIBC0公司制)以5:1的比例混合得到的溶液lmL，并攪拌。以后的操作中，除非另作說(shuō)明，使用的溶液或培養(yǎng)基均在37 °C下保溫。
`[0155]向加入了 PEG和HBSS的細(xì)胞溶液中，經(jīng)5分鐘添加9mL RPMI1640培養(yǎng)基，慢慢混合后，在2200rpm下離心10分鐘，除去上清。將得到的沉淀細(xì)胞混懸在添加有15% FCS及HAT (R0CHE公司制)的RPMI1640培養(yǎng)基中，以每孔200 μ L注入96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板(Greiner公司制)中，在37°C、5% CO2的條件下下培養(yǎng)I周。
[0156]將在添加HAT條件下生長(zhǎng)的菌群判斷為脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤，將生長(zhǎng)有菌群的孔中的上清稀釋5倍，向上述人CXCLl固相化平板的孔中添加100 μ L稀釋液，用與上述同樣的方法確認(rèn)有無(wú)抗體產(chǎn)生。以確認(rèn)到抗體產(chǎn)生的孔作為陽(yáng)性。將陽(yáng)性孔的菌群混懸在含有15% FCS和HT(invitrogen公司制)的RPMI培養(yǎng)基中，利用有限稀釋法進(jìn)行陽(yáng)性克隆的克隆。將克隆的結(jié)果得到的75種雜交瘤在SFM培養(yǎng)基(GIBC0公司制)中馴化，產(chǎn)生抗體。在60mL100% SFM培養(yǎng)基中以I X IO5細(xì)胞/mL接種雜交瘤，培養(yǎng)10天直到細(xì)胞死亡，之后將培養(yǎng)液在3000rpm下離心分離15分鐘除去細(xì)胞。所得的培養(yǎng)上清用MabTrap Kit (GE HEALTHCARE BIOSCIENCE 公司制)純化所含的抗體。
[0157](抗人CXCLl單克隆抗體的篩選)
[0158]對(duì)于上述75種純化抗體，用如下所述的方法篩選與人CXCLl親和性高的抗體。首先，將各純化抗體分別制備10 μ g/mL溶液，分別以每孔100 μ L加入96孔聚苯乙烯平板(Greiner公司制)的孔中，固相化一夜。棄去孔內(nèi)的純化抗體溶液后,注入200 μ L稀釋至4倍的BlockAce溶液(大日本住友制藥公司制)，在室溫下靜置I小時(shí)。之后，棄去溶液，將經(jīng)過(guò)用PBS-T清洗的平板作為純化抗體固相化平板。接著，將從1000pg/mL至15pg/mL階段稀釋重組型人CXCLl的抗原溶液添加到上述純化抗體固相化平板的各孔中，每孔100 μ L，在室溫下反應(yīng)I小時(shí)。接著，棄去抗原溶液，用PBS-T清洗后，向孔中加入100 μ L的50 μ g/mL生物素標(biāo)記抗人CXCLl多克隆抗體(R&DSYSTEMS公司制)，在室溫下反應(yīng)I小時(shí)。棄去孔內(nèi)的溶液，用PBS-T清洗后，使100 μ Lavidin-HRP溶液(R&DSYSTEMS公司制)在室溫下反應(yīng)30分鐘。進(jìn)而，棄去avidin-HRP溶液，用PBS-T清洗后，加入100 μ LTMB溶液使其反應(yīng)15分鐘。通過(guò)添加100 μ L2N硫酸溶液，使反應(yīng)停止。通過(guò)在450nm處測(cè)定吸光度確認(rèn)顯色。將顯色反應(yīng)強(qiáng)的孔中的純化抗體判斷為與人CXCLl親和性高的抗體。其結(jié)果，篩選出 5 種抗體=IgGl-U IgGl-3、IgGl-10、IgGl-14, IgG2b_l。
[0159](使用雜交瘤確定單克隆抗體的輕鏈及重鏈cDNA序列和氨基酸序列)
[0160]對(duì)于篩選出的5種抗體，確定其輕鏈及重鏈的cDNA序列和氨基酸序列。首先，使用添加了 15% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2的條件下對(duì)產(chǎn)生各個(gè)抗體的雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)至I X IO6細(xì)胞/mL。之后，培養(yǎng)液在1200rpm離心分離5分鐘，回收細(xì)胞。用回收的雜交瘤制備mRNA。制備中使用Qiashredder及RNeazy mini kit (Qiagen公司制)，按照附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行詳細(xì)操作。接著，使用逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII (invitrogen公司制),以得到的Total mRNA為模板、使用Oligo dT引物合成cDNA，制作cDNA文庫(kù)。
[0161]然后，以各雜交瘤得到的cDNA文庫(kù)為模板,使用Mouse Ig Primer (Novagen公司制)進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物(小鼠免疫球蛋白可變區(qū)cDNA)插入Invitrogen公司提供的ZERO BLUNT PCR T0P0 Vector的EcoRI部位進(jìn)行連接。連接使用Ligation High(東洋紡公司制)，按照附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行。使用連接反應(yīng)液進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)胞使用DH5ci (Takara Bio公司制)，按照附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行詳細(xì)操作。將轉(zhuǎn)化處理后的菌體涂布在含有100 μ g/mL的 氨芐青霉素的LB平板上，在37°C下培養(yǎng)一夜。將來(lái)自各擴(kuò)增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體接種在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，分別為4個(gè)克隆，在37°C下培養(yǎng)一夜。通過(guò)小量制備利用各培養(yǎng)液制備載體DNA溶液，結(jié)果對(duì)于各擴(kuò)增產(chǎn)物，得到4種參入編碼單克隆抗體的DNA的載體溶液。
[0162]對(duì)于得到的載體溶液，使用M13引物進(jìn)行編碼單克隆抗體的區(qū)域DNA序列分析。分析使用3130X1遺傳分析儀(Applied Biosystems公司制)進(jìn)行。將在插入?yún)^(qū)沒(méi)有終止密碼子的克隆判斷為編碼目標(biāo)單克隆抗體的DNA序列，確定上述5個(gè)抗體(IgGl-1、IgGl-3、IgGl-10、IgGl-14、IgG2b-l)的輕鏈、重鏈的DNA序列。對(duì)于經(jīng)過(guò)確定的DNA序列,根據(jù)大腸桿菌的密碼子使用頻度，確定編碼的氨基酸序列，可以得到序列號(hào)4~43所示的序列。
[0163]作為編碼IgGl-1的氨基酸序列，得到序列號(hào)36~43表示的氨基酸序列。更詳細(xì)而言，序列號(hào)36、37、38分別編碼IgGl-1的輕鏈CDRl、CDR2、CDR3。另外，序列號(hào)39、40、41分別編碼相同IgGl-1的重鏈⑶R1XDR2、⑶R3。另外，序列號(hào)42、43分別編碼IgGl-1的輕鏈可變區(qū)全長(zhǎng)、重鏈可變區(qū)全長(zhǎng)。
[0164]作為編碼IgGl-3的氨基酸序列，得到序列號(hào)28~35表示的氨基酸序列。更詳細(xì)而言，序列號(hào)28~33依次編碼IgGl-3的輕鏈⑶Rl~3、重鏈⑶Rl~3。另外，序列號(hào)34、35分別編碼IgGl-3的輕鏈可變區(qū)全長(zhǎng)、重鏈可變區(qū)全長(zhǎng)。
[0165]作為編碼IgGl-1O的氨基酸序列，得到序列號(hào)4~11表示的氨基酸序列。更詳細(xì)而言，序列號(hào)4~9依次編碼IgGl-1O的輕鏈⑶Rl~3、重鏈⑶Rl~3。序列號(hào)10、11分別編碼IgGl-1O的輕鏈可變區(qū)全長(zhǎng)、重鏈可變區(qū)全長(zhǎng)。
[0166]作為編碼IgGl-14的氨基酸序列，得到序列號(hào)20~27表示的氨基酸序列。更詳細(xì)而言，序列號(hào)20~25依次編碼IgGl-14的輕鏈⑶Rl~3、重鏈⑶Rl~3。序列號(hào)26、27分別編碼IgGl-14的輕鏈可變區(qū)全長(zhǎng)、重鏈可變區(qū)全長(zhǎng)。
[0167]作為編碼IgG2b_l的氨基酸序列，得到序列號(hào)12~19表示的氨基酸序列。更詳細(xì)而言，序列號(hào)12~17依次編碼IgG2b-l的輕鏈⑶Rl~3、重鏈⑶Rl~3。序列號(hào)18、19分別編碼IgG2b-l的輕鏈可變區(qū)全長(zhǎng)、重鏈可變區(qū)全長(zhǎng)。
[0168](實(shí)施例3)篩選出的抗體識(shí)別的人CXCLl部分序列的分析
[0169]針對(duì)實(shí)施例2中篩選出的5個(gè)抗體，進(jìn)行識(shí)別的人CXCLl氨基酸序列上的表位分析。
[0170]首先，向100 μ L的I μ g/μ L人CXCLl溶液中添加DTT，使終濃度為10mM，在95°C下反應(yīng)5分鐘，進(jìn)行CXCLl內(nèi)的二硫鍵的還原，接著添加終濃度20mM的碘乙酰胺，在37°C、避光條件下進(jìn)行30分鐘硫醇基的烷基化反應(yīng)。向得到的12 μ g還原烷基化人CXCL中分別添加20 μ g實(shí)施例2中篩選出的各個(gè)抗體，添加IOOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ8.0)至100 μ L，一邊攪拌混合一邊在室溫下反應(yīng)I小時(shí)。
[0171 ] 接著，添加胰蛋白酶(Promega公司制)、氨肽酶M(R0CHE公司制)、羧肽酶Y(R0CHE公司制)使終濃度分別為0.2μ g、0.5μ U、0.02 μ g，在37°C下使其反應(yīng)2小時(shí)以上，然后在事先用I % BSA-PBS封閉、用PBS清洗的ProteinA-玻璃微珠(GE HEALTHCAREBIO-SCIENCES 公司制)和 NP-40 緩沖液(IOOmM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8.0) 5mM EDTA、150mMNaClU % NP-40)中混合，在4°C下反應(yīng)30分鐘。
[0172]反應(yīng)液用25mM碳酸銨緩沖液(pH8.0)清洗后，使用100 μ L的0.1%甲酸溶出抗原抗體復(fù)合體，溶出液使用Q-TOF Premier (Waters-MicroMass公司制)進(jìn)行LC-MS分析。按照機(jī)器附帶的操作說(shuō)明進(jìn)行分析。
[0173]其結(jié)果，判明了實(shí)施例2中得到的各抗體識(shí)別的人CXCLl部分序列，示于表1。
[0174](參考例I)市售抗體識(shí)別的人CXCLl部分序列的分析
[0175]對(duì)于在市售的人CXCLl檢測(cè)試劑盒即Human CXCLI/GRO alphaDuoSet (R&DSYSTEMS公司制)中作為固相化用抗體添加的單克隆抗體，與實(shí)施例3同樣地對(duì)識(shí)別的人CXCLl氨基酸序列上的表位進(jìn)行分析。
[0176]其結(jié)果，明確了市售抗體識(shí)別的人CXCLl部分序列，示于表1。
[0177][表1]
[0178]
【權(quán)利要求】
1.一種抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，特異性識(shí)別序列號(hào)I表示的氨基酸序列區(qū)， 在輕鏈上， CDRl含有序列號(hào)12表示的氨基酸序列， CDR2含有序列號(hào)13表示的氨基酸序列，及 CDR3含有序列號(hào)14表示的氨基酸序列， 在重鏈上， CDRl含有序列號(hào)15表示的氨基酸序列， CDR2含有序列號(hào)16表示的氨基酸序列，及 CDR3含有序列號(hào)17表示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的抗人CXCLl單克隆抗體或其片段，其中，輕鏈可變區(qū)含有序列號(hào)18表示的氨基酸序列，重鏈可變 區(qū)含有序列號(hào)19表示的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C07K16/24GK103483450SQ201310360469
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2008年10月31日
【發(fā)明者】金森智子, 鄭基晚, 田中祥德, 高山愛(ài)子 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社