一種海藻糖的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟：（1）將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶反應(yīng)液經(jīng)酶解，過濾，制得海藻糖粗液；（2）海藻糖粗液經(jīng)活性炭脫色，過濾，制得混合液；（3）將混合液經(jīng)過離子交換樹脂，得到葡萄糖海藻糖糖液；（4）葡萄糖海藻糖糖液經(jīng)濃縮，然后通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，制得海藻糖溶液和葡萄糖溶液。本發(fā)明以海藻糖合酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生成的海藻糖酶反應(yīng)液為原料，通過酶法將與海藻糖為同分異構(gòu)的麥芽糖轉(zhuǎn)化后，再對雜質(zhì)葡萄糖、殘余的麥芽糖及蛋白、色素、金屬離子等雜質(zhì)進(jìn)行去除，得到了純度較高的海藻糖。
【專利說明】一種海藻糖的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種海藻糖的分離純化方法，特別涉及一種利用專用樹脂和模擬移動床色譜技術(shù)從生物發(fā)酵后的混合糖液中分離海藻糖的方法，屬于糖工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過α，α -1，I鍵結(jié)合而成的非還原性雙糖。它廣泛存在于細(xì)菌、真菌、藻類、低等植物及昆蟲中。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該糖具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，有保護(hù)生物大分子，保護(hù)細(xì)胞膜，保護(hù)蛋白質(zhì)免受冷凍、干燥及滲透壓變化等造成的破壞，在食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0003]目前國內(nèi)外市場對海藻糖的需求不斷擴(kuò)增，其生產(chǎn)技術(shù)也在不斷追求進(jìn)步。早期的海藻糖產(chǎn)品主要通過從酵母細(xì)胞中提取，產(chǎn)率低，成本高，工藝復(fù)雜，限制海藻糖的應(yīng)用。近年來許多微生物中發(fā)現(xiàn)海藻糖合酶，能夠一步轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖，該途徑不消耗高能物質(zhì)，不依賴磷酸，且底物麥芽糖價格低，便于獲得，與海藻糖相比有較大的價格空間。因此該途徑是一條極有工業(yè)化前景的途徑。
[0004]如中國專利文獻(xiàn)CN101831474A (申請?zhí)?01010137964.2)公開了一種利用惡臭假單胞菌生產(chǎn)海藻糖的方法，包括惡臭假單胞菌培養(yǎng)步驟、β -巰基乙醇處理步驟和發(fā)酵步驟。該發(fā)明以麥芽糖為底物，通過制備惡臭假單胞菌的透性細(xì)胞，利用其細(xì)胞內(nèi)海藻糖合酶將麥芽糖一步轉(zhuǎn)化為海藻糖。經(jīng)測定，用巰基乙醇處理的惡臭假單胞菌透性細(xì)胞溶液中約有3%-5%的海藻糖生成。
[0005]目前，酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)海藻糖所獲得的酶反應(yīng)液中除了海藻糖外，還含有麥芽糖、葡萄糖等糖類，此外還有蛋白、色素和金屬離子等雜質(zhì)。因此需要經(jīng)過系列純化過程才能得到純度較高的海藻糖。
[0006]模擬移動床(SMB)色譜分離技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種新型現(xiàn)代化學(xué)分離技術(shù)，在制備色譜技術(shù)中最適用于進(jìn)行連續(xù)性大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。SMB技術(shù)應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大，在糖類分離中應(yīng)用不斷得到企業(yè)重視。它是利用某種吸附劑對基質(zhì)吸附性能的差異，通過吸附-洗脫的過程，使性質(zhì)很相近的幾種物質(zhì)分離，而連續(xù)色譜分離技術(shù)是以層析為單元，利用逆流、回流等機(jī)制，分離效率較一般固定床技術(shù)高，此外，連續(xù)色譜分離過程能有效的利用填充劑床層，提高質(zhì)量恒定的產(chǎn)品，特別適合用于糖類生產(chǎn)之中。
[0007]但由于酶轉(zhuǎn)化法中的反應(yīng)液中糖的成分復(fù)雜，因此現(xiàn)有技術(shù)中的分離手段并不適用于酶轉(zhuǎn)化法中的反應(yīng)液。
[0008]中國專利CN103113425A (申請?zhí)?01310016164.9)公開了一種海藻糖和葡萄糖的分離方法。該方法利用納米金作催化劑，海藻糖與葡萄糖混合液為底物，納米金催化混合液中的葡萄糖生成葡萄糖酸，再通過色譜方法將葡萄糖酸與海藻糖分離開來。
[0009]由于麥芽糖和海藻糖為同分異構(gòu)，因此上述技術(shù)方案無法分離麥芽糖和海藻糖，并且上述工藝復(fù)雜，分離成本昂貴。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海藻糖的分離純化方法。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0012]一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟:
[0013](1)將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶反應(yīng)液加熱至80-100°C，保溫10-30分鐘，降溫，然后加入糖化酶，糖化酶加入量為12-24U/ml，調(diào)pH4.0-7.0，控制糖化溫度為60-65°C，酶解時間8-12h，然后升溫至80-100°C，保溫10-30分鐘，過濾，制得海藻糖粗液；
[0014](2)向步驟(I)制得的海藻糖粗液中按重量百分比0.5%-3%的添加量添加活性炭，脫色20-60分鐘，過濾，制得混合液；
[0015](3)將步驟(2)制得的混合液經(jīng)過離子交換樹脂，除去糖液中的金屬離子，得到電導(dǎo)率< 50 μ s/cm的葡萄糖海藻糖糖液；
[0016](4)步驟(3)制得的葡萄糖海藻糖糖液經(jīng)濃縮至糖液質(zhì)量體積濃度< 60%，單位g/ml，然后通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，流動相為水，分離樹脂為鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂，分離溫度為35°C-95°C，系統(tǒng)壓力< IMpa，料液進(jìn)料量為5-3800mL/min，洗脫水進(jìn)料量為O-3800mL/min，步進(jìn)時間為0.1s-99h，制得濃度>6wt%、純度≥95wt%的海藻糖溶液和濃度> 8wt%、純度≥91wt%的葡萄糖溶液。
[0017]所述步驟(I)中的海藻糖酶反應(yīng)液采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制得，如可以采用中國專利文獻(xiàn)CN101831474A (申請?zhí)?01010137964.2)中的方法制備的發(fā)酵液經(jīng)高壓細(xì)胞破碎儀破碎、過濾后制得。海藻糖酶反應(yīng)液中糖成分為麥芽糖、葡萄糖和海藻糖。
[0018]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的離子交換樹脂為陰離子交換樹脂柱和陽離子交換樹脂柱以串聯(lián)的方式分離糖液中的金屬離子，糖液在45-50°C，pH4.5-5.5進(jìn)入離子交換柱，其流速控制在每小時流過樹脂的量為樹脂體積的3-4倍，當(dāng)出口液體的電導(dǎo)率大于50 μ s/cm、陽離子交換樹脂柱出口液體的pH值恢復(fù)到4.0、陰離子交換樹脂柱出口液體的PH值降至6-6.5時或陰離子交換樹脂柱出口液體透光小于98%時，停止進(jìn)料，進(jìn)行再生操作。
[0019]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述陽離子交換樹脂為強(qiáng)酸性陽離子樹脂，如001X7陽離子樹脂；陰離子交換樹脂為強(qiáng)堿性陰離子樹脂，如201X7陰離子樹脂。
[0020]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中濃縮為真空旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度為60 -110。。。
[0021]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，條件如下:進(jìn)料濃度20-60%，進(jìn)料速度為3-25ml/min，分離溫度為40-85°C;進(jìn)一步優(yōu)選的，所述分離溫度為50-75°C。
[0022]所得海藻糖溶液中的海藻糖含量為95-97% ;所得葡萄糖溶液中的海藻糖含量為4-9%，濃度為8-20%。經(jīng)過本發(fā)明模擬移動床分離后，轉(zhuǎn)化糖中的海藻糖與葡萄糖組分得到有效分離，該步驟也是本發(fā)明的關(guān)鍵，海藻糖與葡萄糖分離如果不徹底，將會嚴(yán)重影響本發(fā)明后面的效果，甚至無法得到高純度的結(jié)晶海藻糖產(chǎn)品。
[0023]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，還包括將步驟(4)制得的海藻糖溶液濃縮至質(zhì)量濃度為65%-80%，然后按體積比1: (0-4)加入無水乙醇，在溫度5-40°C條件添加質(zhì)量百分比為0.1-3%的晶種攪拌結(jié)晶，過濾除濾液，然后干燥制得海藻糖。
[0024]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，上述海藻糖溶液濃縮至質(zhì)量濃度為65%-80%的具體步驟如下:將海藻糖溶液先經(jīng)反滲透膜濃縮至質(zhì)量濃度為20-35%，然后再經(jīng)真空濃縮至質(zhì)量濃度為65%-80%。
[0025]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，還包括將步驟(4 )制得的葡萄糖溶液經(jīng)過膜濃縮后，與上述濾液(海藻糖結(jié)晶母液)混合后，用于生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，葡萄糖酸鈉結(jié)晶分離后的母液與步驟(I)制得海藻糖粗液混合后回收利用。
[0026]有益效果
[0027]1、本發(fā)明以海藻糖合酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生成的海藻糖酶反應(yīng)液為原料，通過酶法將與海藻糖為同分異構(gòu)的麥芽糖轉(zhuǎn)化后，再對雜質(zhì)葡萄糖、殘余的麥芽糖及蛋白、色素、金屬離子等雜質(zhì)進(jìn)行去除，得到了純度較高的海藻糖。
[0028]2、本發(fā)明采用移動床連續(xù)色譜分離，并采用特定類型的分離樹脂實(shí)現(xiàn)海藻糖與葡萄糖之間的完全分離，樹脂利用率高；
[0029]3、本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程全自動化，勞動強(qiáng)度低，生產(chǎn)場地小，并且生產(chǎn)成本低，分離每立方米混合糖液，僅需要1.8立方米-3立方米水和少量電，生產(chǎn)過程中不需要使用化學(xué)品，環(huán)境友好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為模擬移動床色譜柱的結(jié)構(gòu)示意圖；
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0032]樹脂來源
[0033]實(shí)施例1所述的鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂購自Finex Oy公司；
[0034]實(shí)施例2所述的鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂購自purolite公司；
[0035]實(shí)施例3所述的鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂購自山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司；
[0036] 所述001\7陽離子樹脂購自口 公司；201 X 7陰離子樹脂購自purolite公司。
[0037]實(shí)施例中的海藻糖酶反應(yīng)液采用中國專利文獻(xiàn)CN101831474A (申請?zhí)?01010137964.2)中的方法制備的發(fā)酵液經(jīng)高壓細(xì)胞破碎儀破碎、過濾后制得。海藻糖酶反應(yīng)液中糖成分為麥芽糖、葡萄糖和海藻糖。
[0038]糖化酶購自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。
[0039]分離設(shè)備
[0040]模擬移動床包括由20根旋轉(zhuǎn)式色譜柱組成的五個分離區(qū)，I區(qū)為I-3號色譜柱串聯(lián)組成，II區(qū)為4-9號色譜柱串聯(lián)組成，III區(qū)為10-11號色譜柱串聯(lián)組成，IV區(qū)為12-19號色譜柱串聯(lián)組成，V區(qū)為20號色譜柱，20號色譜柱采用反接方式，I區(qū)的進(jìn)液口分別與進(jìn)水存儲罐和循環(huán)水緩沖罐相連接，I區(qū)的出液口通過葡萄糖緩沖罐與II區(qū)的進(jìn)液口相連接，II區(qū)的出液口和III區(qū)的出液口通過中間料緩沖罐與IV區(qū)的進(jìn)液口相連接，III區(qū)的進(jìn)液口與進(jìn)料罐相連接，IV區(qū)的出液口通過海藻糖緩沖罐與V區(qū)的進(jìn)液口相連接，V區(qū)的出液口與循環(huán)水緩沖罐相連接；10號色譜柱進(jìn)液口處連續(xù)進(jìn)料，在3號和19號色譜柱出液口處分別連續(xù)收集葡萄糖溶液和海藻糖溶液。
[0041]所述I-20號色譜柱內(nèi)填充鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂。
[0042]所述I-19號色譜柱轉(zhuǎn)動方向為按進(jìn)料口視角的順時針方向轉(zhuǎn)動，20號色譜柱為按進(jìn)料口視角的逆時針方向轉(zhuǎn)動。
[0043]實(shí)施例1
[0044]一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟:
[0045](I)將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶反應(yīng)液加熱至100°C，保溫10分鐘，降溫，然后加入糖化酶，糖化酶加入量為24U/ml，調(diào)pH4.5，控制糖化溫度為60°C，酶解時間8h，然后升溫至100°C，保溫10分鐘，過濾，制得海藻糖粗液；
[0046](2)向步驟(I)制得的海藻糖粗液中按重量百分比3%的添加量添加活性炭，脫色20分鐘，過濾，制得混合液；
`[0047](3)將步驟(2)制得的混合液經(jīng)過離子交換樹脂，所述離子交換樹脂為陰離子交換樹脂(201X7)柱和陽離子交換樹脂(001X7)柱以串聯(lián)的方式分離糖液中的金屬離子，糖液在45-50°C，pH4.5-5.5進(jìn)入離子交換柱，其流速控制在每小時流過樹脂的量為樹脂體積的3-4倍，當(dāng)出口液體的電導(dǎo)率大于50 μ s/cm、陽離子交換樹脂柱出口液體的pH值恢復(fù)到4.0、陰離子交換樹脂柱出口液體的pH值降至6-6.5時或陰離子交換樹脂柱出口液體透光小于98%時，停止進(jìn)料，進(jìn)行再生操作。除去糖液中的金屬離子，得到電導(dǎo)率
<50 μ s/cm的葡萄糖海藻糖糖液；
[0048]經(jīng)檢測，葡萄糖海藻糖糖液中總糖濃度為10wt%，其中海藻糖含量占總糖含量的59wt%,葡萄糖占總糖含量的41wt%。
[0049](4)步驟(3)制得的葡萄糖海藻糖糖液通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，流動相為水，分離樹脂為鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂。
[0050]模擬移動床操作條件如下:分離溫度60°C，系統(tǒng)壓力< 0.5Mpa，料液進(jìn)料量為15.7mL/min，洗脫水進(jìn)料量為25.5mL/min，步進(jìn)時間llmin，進(jìn)料2小時后達(dá)到平衡。
[0051]經(jīng)檢測，所得海藻糖溶液中的海藻糖純度為99wt%，平均質(zhì)量濃度為43.2g/L ;所得葡萄糖溶液中的海藻糖含量為5.4wt%。
[0052]將上述制得的海藻糖溶液先經(jīng)反滲透膜濃縮至質(zhì)量濃度為30%，然后再經(jīng)真空濃縮至質(zhì)量濃度80%，然后按體積比1:2加入無水乙醇，在溫度20°C條件下結(jié)晶，過濾除濾液，然后干燥制得海藻糖；經(jīng)檢測，海藻糖的純度為99.0%，回收率42.1% ；
[0053]然后將步驟(4)制得的葡萄糖溶液經(jīng)過濃縮后，與上述濾液混合后，用于生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，葡萄糖酸鈉結(jié)晶經(jīng)分離后的母液與步驟(I)制得海藻糖粗液混合后回收利用，葡萄糖酸鈉結(jié)晶經(jīng)干燥得成品。
[0054]由上述結(jié)果可以看出，經(jīng)過本發(fā)明模擬移動床分離后，轉(zhuǎn)化糖中的海藻糖與葡萄糖組分得到有效分離，該步驟同時為后續(xù)得到高純度結(jié)晶海藻糖產(chǎn)品提供保障。[0055]實(shí)施例2
[0056]一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟:
[0057](I)將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶反應(yīng)液加熱至100°C，保溫10分鐘，降溫，然后加入糖化酶，糖化酶加入量為24U/ml，調(diào)pH4.2，控制糖化溫度為63°C，酶解時間8h，然后升溫至100°C，保溫10分鐘，過濾，制得海藻糖粗液；
[0058](2)向步驟(I)制得的海藻糖粗液中按重量百分比1%的添加量添加活性炭，脫色20分鐘，過濾，制得混合液；
[0059](3)將步驟(2)制得的混合液經(jīng)過離子交換樹脂，所述離子交換樹脂為陰離子交換樹脂(201X7)柱和陽離子交換樹脂(001X7)柱以串聯(lián)的方式分離糖液中的金屬離子，糖液在45-50°C，pH4.5-5.5進(jìn)入離子交換柱，其流速控制在每小時流過樹脂的量為樹脂體積的3-4倍，當(dāng)出口液體的電導(dǎo)率大于50 μ s/cm、陽離子交換樹脂柱出口液體的pH值恢復(fù)到4.0、陰離子交換樹脂柱出口液體的pH值降至6-6.5時或陰離子交換樹脂柱出口液體透光小于98%時，停止進(jìn)料，進(jìn)行再生操作。除去糖液中的金屬離子，得到電導(dǎo)率
<50 μ s/cm的葡萄糖海藻糖糖液；
[0060]經(jīng)檢測，葡萄糖海藻糖糖液中總糖濃度為30wt%，其中海藻糖含量占總糖含量的62wt%,葡萄糖占總糖含量的38wt%。
[0061](4)步驟(3)制得的葡萄糖海藻糖糖液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮至糖液質(zhì)量體積濃度35%，單位g/ml，濃縮溫度為110°C，然后通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，流動相為水，分離樹脂為鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂。
[0062]模擬移動床操作條件如下:分離溫度60°C，系統(tǒng)壓力< l.0Mpa，料液進(jìn)料量為13.8mL/min,洗脫水進(jìn)料量為29.9mL/min,步進(jìn)時間Ilmin,進(jìn)料2小時后達(dá)到平衡。
[0063]經(jīng)檢測，所得海藻糖溶液中的海藻糖含量為97.6wt%，平均質(zhì)量濃度為58.lg/L ；所得葡萄糖溶液中的海藻糖含量為4wt%。
[0064]將上述制得的海藻糖溶液先經(jīng)反滲透膜濃縮至質(zhì)量濃度為35%，然后再經(jīng)真空濃縮至質(zhì)量濃度75%，然后按體積比1:3加入無水乙醇，在溫度30°C條件下結(jié)晶，過濾除濾液，然后干燥制得海藻糖；經(jīng)檢測，海藻糖的純度為99.0%，回收率85.2% ；
[0065]然后將步驟(4)制得的葡萄糖溶液經(jīng)過濃縮后，與上述濾液混合后，用于生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，葡萄糖酸鈉結(jié)晶經(jīng)分離后的母液與步驟(I)制得海藻糖粗液混合后回收利用，葡萄糖酸鈉結(jié)晶經(jīng)干燥后得成品。
[0066]實(shí)施例3
[0067]一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟:
[0068](I)將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶反應(yīng)液加熱至100°C，保溫10分鐘，降溫，然后加入糖化酶，糖化酶加入量為24U/ml，調(diào)pH4.5，控制糖化溫度為65°C，酶解時間8h，然后升溫至100°C，保溫10分鐘，過濾，制得海藻糖粗液；
[0069](2)向步驟(I)制得的海藻糖粗液中按重量百分比3%的添加量添加活性炭，脫色20分鐘，過濾，制得混合液；
[0070](3)將步驟(2)制得的混合液經(jīng)過離子交換樹脂，所述離子交換樹脂為陰離子交換樹脂(201X7)柱和陽離子交換樹脂(001X7)柱以串聯(lián)的方式分離糖液中的金屬離子，糖液在45-50°C，pH4.5-5.5進(jìn)入離子交換柱，其流速控制在每小時流過樹脂的量為樹脂體積的3-4倍，當(dāng)出口液體的電導(dǎo)率大于50 μ s/cm、陽離子交換樹脂柱出口液體的pH值恢復(fù)到4.0、陰離子交換樹脂柱出口液體的pH值降至6-6.5時或陰離子交換樹脂柱出口液體透光小于98%時，停止進(jìn)料，進(jìn)行再生操作。除去糖液中的金屬離子，得到電導(dǎo)率
<50 μ s/cm的葡萄糖海藻糖糖液；
[0071]經(jīng)檢測，葡萄糖海藻糖糖液中總糖濃度為30wt%，其中海藻糖含量占總糖含量的63wt%,葡萄糖占總糖含量的37wt%。
[0072](4)步驟(3)制得的葡萄糖海藻糖糖液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮至糖液質(zhì)量體積濃度55wt%，單位g/ml，濃縮溫度為110°C，然后通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，流動相為水，分離樹脂為鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂。
[0073]模擬移動床操作條件如下:分離溫度60°C，系統(tǒng)壓力< l.0Mpa，料液進(jìn)料量為11.6mL/min,洗脫水進(jìn)料量為25.lmL/min,步進(jìn)時間llmin,進(jìn)料2小時后達(dá)到平衡。
[0074]經(jīng)檢測，所得海藻糖溶液中的海藻糖含量為89wt%，平均質(zhì)量濃度為143g/L，所得葡萄糖溶液中的海藻糖含量為9wt%。
[0075]將上述制得的海藻糖溶液先經(jīng)反滲透膜濃縮至質(zhì)量濃度為30-35%，然后再經(jīng)真空濃縮至質(zhì)量濃度70%，然后按體積比1:4加入無水乙醇，在溫度10°C條件下結(jié)晶，過濾除濾液，然后干燥制得海藻糖；經(jīng)檢測，海藻糖的純度為98.0%，，回收率81.6% ；
[0076]然后將步驟(4)制得的葡萄糖溶液經(jīng)過濃縮后，與上述濾液混合后，用于生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，葡萄糖酸鈉結(jié)晶經(jīng)分離后的母液與步驟(I)制得海藻糖粗液混合后回收利用，葡萄糖酸鈉結(jié)晶經(jīng)干燥后得成品。
[0077]對比例1
[0078]一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟:
[0079](1)將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶反應(yīng)液加熱至100°C，保溫10分鐘過濾，制得海藻糖粗液；
[0080](2)向步驟(1)制得的海藻糖粗液中按重量百分比1%的添加量添加活性炭，脫色20分鐘，過濾，制得混合液；
[0081](3)將步驟(2)制得的混合液經(jīng)過離子交換樹脂，所述離子交換樹脂為陰離子交換樹脂(201X7)柱和陽離子交換樹脂(001X7)柱以串聯(lián)的方式分離糖液中的金屬離子，糖液在45-50°C，pH4.5-5.5進(jìn)入離子交換柱，其流速控制在每小時流過樹脂的量為樹脂體積的3-4倍，當(dāng)出口液體的電導(dǎo)率大于50 μ s/cm、陽離子交換樹脂柱出口液體的pH值恢復(fù)到4.0、陰離子交換樹脂柱出口液體的pH值降至6-6.5時或陰離子交換樹脂柱出口液體透光小于98%時，停止進(jìn)料，進(jìn)行再生操作。除去糖液中的金屬離子，得到電導(dǎo)率
<50 μ s/cm的葡萄糖海藻糖糖液；
[0082]經(jīng)檢測，混合糖液中總糖濃度為35wt%，其中海藻糖含量占總糖含量的60wt%，麥芽糖占總糖含量的38wt%。
[0083]( 4 )步驟(3 )制得的葡萄糖海藻糖糖液經(jīng)通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，流動相為水，分離樹脂為鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂。
[0084]模擬移動床操作條件如下:分離溫度60°C，系統(tǒng)壓力< l.0Mpa，料液進(jìn)料量為13.0mL/min,洗脫水進(jìn)料量為28.6mL/min,步進(jìn)時間llmin,進(jìn)料2小時后達(dá)到平衡。
[0085]經(jīng)檢測，所得海藻糖溶液中的海藻糖含量為82wt%，平均質(zhì)量濃度為63g/L ;所得麥芽糖溶液中的海藻糖含量為43wt%。
[0086]將上述制得的海藻糖溶液先經(jīng)反滲透膜濃縮至質(zhì)量濃度為35%，然后再經(jīng)真空濃縮至質(zhì)量濃度70%-80%，然后按體積比1:3加入無水乙醇，在溫度30°C條件下結(jié)晶，過濾除濾液，然后干燥制得海藻糖；經(jīng)檢測，海藻糖的純度為82.5.0%，回收率80.3% ；
[0087]然后將步驟(4 )制得的麥芽糖溶液經(jīng)過濃縮后，與上述濾液混合后，用于轉(zhuǎn)化液的循環(huán)利用。
[0088]由上述結(jié)果可以看出，經(jīng)過本發(fā)明模擬移動床分離后，轉(zhuǎn)化糖中的海藻糖與麥芽糖組分沒有得到有效分離，又因麥芽糖與海藻糖為同分異構(gòu)體，所以無法得到高純度結(jié)晶海藻糖產(chǎn)品。
[0089]對比例2
[0090]一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟:
[0091](I)將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶，總糖含量35%，反應(yīng)液加熱至100°C，保溫10分鐘，降溫，得海藻糖麥芽糖混合液。
[0092](2)向步驟(I)制得的海藻糖粗液中加入2%的釀酒酵母菌種(CICC1202)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24h，離心5000rpm，IOmin,分離酵母，取上清液。
[0093](3)將2中上清液按重量百分比1%的添加量添加活性炭，脫色20分鐘，過濾，制得混合液；
[0094](4)將步驟(2)制得的混合液經(jīng)過離子交換樹脂，所述離子交換樹脂為陰離子交換樹脂(201X7)柱和陽離子交換樹脂(001X7)柱以串聯(lián)的方式分離糖液中的金屬離子，糖液在45-50°C，pH4.5-5.5進(jìn)入`離子交換柱，其流速控制在每小時流過樹脂的量為樹脂體積的3-4倍，當(dāng)出口液體的電導(dǎo)率大于50 μ s/cm、陽離子交換樹脂柱出口液體的pH值恢復(fù)到4.0、陰離子交換樹脂柱出口液體的pH值降至6-6.5時或陰離子交換樹脂柱出口液體透光小于98%時，停止進(jìn)料，進(jìn)行再生操作。除去糖液中的金屬離子，得到電導(dǎo)率
<50 μ s/cm的葡萄糖海藻糖糖液；
[0095]經(jīng)檢測，麥芽糖海藻糖糖液中總糖濃度為15.52wt%，其中海藻糖含量占總糖含量的88.7wt%，麥芽糖占總糖含量的11.3wt%。
[0096](5 )步驟(4 )制得的的海藻糖溶液先經(jīng)反滲透膜濃縮至質(zhì)量濃度為35%，然后再經(jīng)真空濃縮至質(zhì)量濃度80%，然后按體積比1:3加入無水乙醇，在溫度30°C條件下結(jié)晶，過濾除濾液，然后干燥制得海藻糖；經(jīng)檢測，海藻糖的純度為89.0%，回收率78% ；
[0097]由上述結(jié)果可以看出，在大家常用的海藻糖分離方法中，利用發(fā)酵法去掉轉(zhuǎn)化液中的麥芽糖效果不理想，在釀酒酵母發(fā)酵過程中，不僅能消耗麥芽糖，同時消耗海藻糖，因此降低了海藻糖的總量，增加生產(chǎn)成本。所得混合糖液中麥芽糖含量仍非常高，因此不利于得到高純度海藻糖。
【權(quán)利要求】
1.一種海藻糖的分離純化方法，包括如下步驟: (O將用海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法制得的海藻糖酶反應(yīng)液加熱至80~100°C，保溫10~30分鐘，降溫，然后加入糖化酶，糖化酶加入量為12~24U/ml，調(diào)pH4.0~7.0，控制糖化溫度為60~65°C，酶解時間8~12h，然后升溫至80~100°C，保溫10~30分鐘，過濾，制得海藻糖粗液； (2)向步驟(I)制得的海藻糖粗液中按重量百分比0.5%~3%的添加量添加活性炭，脫色20~60分鐘,過濾,制得混合液； (3)將步驟(2)制得的混合液經(jīng)過離子交換樹脂，除去糖液中的金屬離子，得到電導(dǎo)率< 50 μ s/cm的葡萄糖海藻糖糖液； (4)步驟(3)制得的葡萄糖海藻糖糖液經(jīng)濃縮至糖液質(zhì)量體積濃度<60%，單位g/ml，然后通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，流動相為水，分離樹脂為鈣離子型聚體乙烯系凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂，分離溫度為35°C~95°C，系統(tǒng)壓力≤IMpa，料液進(jìn)料量為5-3800mL/min，洗脫水進(jìn)料量為O~3800mL/min，步進(jìn)時間為0.1s~99h，制得濃度>6wt%、純度≥95wt%的海藻糖溶液和濃度> 8wt%、純度≥91wt%的葡萄糖溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(3)中的離子交換樹脂為陰離子交換樹脂柱和陽離子交換樹脂柱以串聯(lián)的方式分離糖液中的金屬離子，糖液在45~50°C，pH4.5~5.5進(jìn)入離子交換柱，其流速控制在每小時流過樹脂的量為樹脂體積的3~4倍，當(dāng)出口液體的電導(dǎo)率大于50 μ s/cm、陽離子交換樹脂柱出口液體的pH值恢復(fù)到4.0、陰離子交換樹脂柱出口液體的pH值降至6~6.5時或陰離子交換樹脂柱出口液體透光小于98%時，停止進(jìn)料，進(jìn)行再生操作。
3.如權(quán)利要求2所述的分離純化方法，其特征在于，所述陽離子交換樹脂為強(qiáng)酸性陽離子樹脂；陰離子交換樹脂為強(qiáng)堿性陰離子樹脂。
4.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(4)中濃縮為真空旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度為60~110°C。
5.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(4)中通過模擬移動床進(jìn)行連續(xù)色譜分離，條件如下:進(jìn)料濃度20~60%，進(jìn)料速度為3~25ml/min，分離溫度為40~85°C ;進(jìn)一步優(yōu)選的，所述分離溫度為50~75°C。
6.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，還包括將步驟(4)制得的海藻糖溶液濃縮至質(zhì)量濃度為65%~80%，然后按體積比1: (0-4)加入無水乙醇，在溫度5~40°C條件添加質(zhì)量百分比為0.1~3%的晶種攪拌結(jié)晶，過濾除濾液，然后干燥制得海藻糖。
7.如權(quán)利要求6所述的分離純化方法，其特征在于，上述海藻糖溶液濃縮至質(zhì)量濃度為65%~80%的具體步驟如下:將海藻糖溶液先經(jīng)反滲透膜濃縮至質(zhì)量濃度為20~35%，然后再經(jīng)真空濃縮至質(zhì)量濃度為65%~80%。
8.如權(quán)利要求6所述的分離純化方法，其特征在于，還包括將步驟(4)制得的葡萄糖溶液經(jīng)過膜濃縮后，與濾液混合后，用于生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，葡萄糖酸鈉結(jié)晶分離后的母液與步驟(I)制得海藻糖粗液混合后回收利用。
【文檔編號】C07H3/04GK103450288SQ201310360328
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月16日
【發(fā)明者】王騰飛, 王瑞明, 李丕武 申請人:齊魯工業(yè)大學(xué)