專利名稱：從毛蚶中分離制備一種抗腫瘤多肽化合物的方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從海洋生物毛紺(Area subcrenataLischke)中經(jīng)過一系列提取、分離、層析純化等步驟得到一個具抗腫瘤活性的多肽化合物，其內(nèi)容包括分離制備方法及該化合物抗腫瘤醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
毛紺(Area subcrenata Lischke)屬于軟體動物門，屬于瓣觸綱列齒目紺科,是我國資源豐富的海產(chǎn)生物之一。毛蚶的營養(yǎng)與藥用價(jià)值很高，其殼和肉皆有藥用價(jià)值，藥用歷史悠久。其貝殼為中藥瓦楞子，《神農(nóng)本草經(jīng)》及歷代本草均有記載，具有化痰、軟堅(jiān)、止痛等功效；蚶肉是其軟體部分，在《海洋中藥》、《食療本草》、《本草拾遺》和《醫(yī)林纂要》等中藥現(xiàn)代和古書籍文獻(xiàn)中均有記載，具有補(bǔ)血、溫中、健胃等功效。因此，合理利用海洋資源，對毛蚶軟體部分進(jìn)行深入、系統(tǒng)研究具有重大意義。經(jīng)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在國外從毛蚶中提取活性物質(zhì)的研究未見報(bào)道。而在國內(nèi)對毛蚶的研究主要集中對毛蚶多糖成分的分離及其抗氧化或免疫活性方面和毛蚶水解產(chǎn)物活性的研究，但是對毛蚶蛋白多肽類物質(zhì)的研究則很少，如:中國專利申請?zhí)?8110478.9公開了 “一種能抗癌的海洋生物提取物”技術(shù)，所用的方法過于簡單，得到的物質(zhì)復(fù)雜而且無法進(jìn)行定量，無法對其進(jìn)行藥物的開發(fā)與利用；而中國專利申請?zhí)?005100043797.4公開了 “一種毛蚶抗癌肽類提取物及其制備方法”和200610043222.7公開了一種“從毛蚶中提取小分子活性多肽的方法”，這兩個專利主要針對于分子量3000Da以下的小分子多肽活性復(fù)合組分進(jìn)行了研究；此外，中國專利申請?zhí)?00510043846.4公開了 “一種毛蚶糖肽類提取物及其制備方法”。上述專利文獻(xiàn)僅 描述了從毛蚶中提取活性粗蛋白、多肽類物質(zhì)的過程，其提取產(chǎn)物是粗的復(fù)合成分，純度不高且活性物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。迄今為止，均未見從毛蚶中提取分離到純度高且物質(zhì)基礎(chǔ)明確的抗腫瘤多肽化合物及其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)解析的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于借助現(xiàn)代提取分離純化技術(shù)，從海洋生物中提取分離蛋白多肽類活性物質(zhì)，特別是提供一種來源于毛蚶的活性多肽化合物，包括制備方法、醫(yī)藥用途和結(jié)構(gòu)解析等。本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:將新鮮毛蚶剝殼、取出內(nèi)容物、清洗、力口入緩沖液、勻漿、提取、離心、取上清液、硫酸銨分級沉淀、取沉淀透析脫鹽，采用離子交換柱層析分離，分別收集活性峰，透析脫鹽后經(jīng)疏水層析柱分離，得到純度為99%、分子量為20491.0Da的抗腫瘤活性多肽化合物，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。該多肽化合物是天然提取分離的物質(zhì)，具有顯著的抗腫瘤活性，體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明其抑瘤率達(dá)到了 87% ;另外，由于該成分為天然提取分離所得，未經(jīng)任何化學(xué)修飾；再次，該多肽化合物尚具有毒副作用低的特點(diǎn)。本發(fā)明涉及經(jīng)過離子交換層析法和疏水層析法分離純化得到一個多肽化合物，該多肽化合物純度高、毒性低、抗腫瘤活性顯著，適用于醫(yī)藥用途。


圖1為實(shí)例I中用電噴霧電離質(zhì)譜測定活性多肽化合物的相對分子量圖譜。圖2、3、4、5、6、7、8為實(shí)例I中基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜測定多肽化合物的部分氨基酸序列圖譜。
具體實(shí)施方式
:下面結(jié)合技術(shù)方案和圖表詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1將毛蚶剝殼，取其內(nèi)容物，用低溫蒸餾水清洗三次，控干后稱重，按照1: 3的重量比例加入提取緩沖液(pH = 8.0,0.03mol/L，磷酸鈉緩沖液)，采用高速組織搗碎機(jī)，以8000rpm間隔勻漿3min至細(xì)膩無塊狀，將勻漿液置于低頻超聲儀中超聲提取40min，使用低溫高速離心機(jī)，IOOOOrpm, 4°C，離心30min，去渣，量取上清液的體積后將其置于冰浴環(huán)境中加入70%飽和度的硫酸銨，繼續(xù)攪拌鹽析lh，高速離心除去沉淀取上清液，量取體積后加入100%飽和度的硫酸銨,再繼續(xù)攪拌鹽析Ih,離心30min(10000rpm,4°C ),收集沉淀。將沉淀用少量提取液溶解后置于3000D透析袋中透析24h以除鹽，每間隔6h更換外周蒸餾水。將透析脫鹽后的活性組分使用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進(jìn)行分離，用pH為6.0-8.0的0 .03mol/L的Tris-HCl緩沖液作為初始洗脫液，通過增加氯化鈉的濃度進(jìn)行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰，收集0.lmol/L氯化鈉洗脫的洗脫液，透析脫鹽后，再使用Phenyl Sepharose CL-4B疏水層析柱分離。首先用1.0mol/L, pH為6.0-8.0的硫酸銨磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，然后依次用含0.5mol/L和Omol/L的硫酸銨和pH為6.0-8.0的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰，收集不含硫酸銨的磷酸鈉緩沖液洗脫的洗脫液，透析脫鹽后，濃縮冷凍干燥，得到了毛蚶中的活性多肽化合物。用RP_HPLC(反相高效液相色譜)檢測該多肽化合物的純度為99%。采用EMS-MS(電噴霧電離質(zhì)譜)測定了該多肽的分子量為20491.0Da，用MALD1-T0F/T0F-MS (基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜)檢測了多肽化合物的部分片段氨基酸序列。實(shí)施例2采用MTT法對整個提取分離過程進(jìn)行抗腫瘤活性跟蹤篩選。將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞(貼壁細(xì)胞需用胰酶消化)，制成含細(xì)胞3 4X103個/ml單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度)，分別接種于無菌96孔培養(yǎng)板中，100 μ I/孔，于5% CO2,37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)12h后，設(shè)空白對照組(加等體積RPMI1640)、陽性對照(順鉬)和給藥組，每個濃度組設(shè)3個重復(fù)孔，加入藥物，每孔總反應(yīng)體積為200 μ 1，細(xì)胞置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)終止前4h加人ΜΤΤ20μ l(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加入DMS0200l.! I/孔，置于振蕩儀上振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀于波長570nm處測定A57tl值。以順鉬為陽性對照，使用藥理學(xué)方法計(jì)算IC5tl值(抑制率達(dá)到50%時的藥物濃度)。以順鉬為陽性對照藥，測定此多肽化合物對人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肝癌細(xì)胞H印G2和人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示。表1.多肽化合物的體外抗腫瘤活性測試結(jié)果漢土SD, n=3)
權(quán)利要求
1.一種毛紺(Arcasubcrenata Lischke)中抗腫瘤活性多肽化合物，其分子量為20491. ODa0該多肽化合物的氨基酸片段序列包含ISMEDVEESR、KNGMHSIDVNHDGK、HRAYffADNTYLMK, CMDLPYDVLDTGGKDR、SSDKNTDLVDLFELDMVPDR、KNNECMNMIMDVIDTNTAAR 和PYYCSLDNVHDGAGLSMEDVEEDK。
2.權(quán)利要求I的毛蚶中的抗腫瘤活性多肽化合物的分離制備方法，其特征是將新鮮毛蚶剝殼、取出內(nèi)容物清洗，加入緩沖液勻漿、提取，離心，取上清液，硫酸銨分級沉淀，取沉淀透析脫鹽，采用離子交換柱層析分離，分別收集活性峰，透析脫鹽后經(jīng)疏水層析柱分離，得到了純度為99 %的活性多肽化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離制備方法，其特征在于加入的緩沖液為O. 01 O. 05mol/L, pH為6. O 9. O的磷酸鈉、磷酸鉀或Tris堿緩沖液，力口入緩沖液的體積與毛蚶的重量比為I : I I : 3，用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行勻漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離制備方法，其特征在于采用硫酸銨分級沉淀，先使提取上清液達(dá)到70%飽和度硫酸銨，離心，取上清夜，加入硫酸銨鹽析達(dá)到100%飽和度，離心，留沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離制備方法，其特征在于將沉淀用少量緩沖液溶解后，用透析袋透析脫鹽后，用DEAE-Sephorose Fast Flow陰離子交換層析柱分離，其洗脫初始緩沖液為PH8. OTris-HCl緩沖液，O 2. Omol/L NaCl進(jìn)行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離制備方法，其特征在于收集用O. lmol/L氯化鈉洗脫的洗脫液,透析脫鹽后,用Phenyl Sepharose CL-4B疏水層析柱分離，其洗脫液為O. 03mol/L, pH8. O磷酸鈉緩沖液，濃度2. O Omol/L的硫酸銨進(jìn)行階段洗脫，280nm處檢測吸收峰。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離制備方法，其特征在于收集用不含硫酸銨的磷酸鈉緩沖液洗脫的洗脫液，透析脫鹽后，濃縮冷凍干燥，得到了毛蚶中的活性多肽化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛蚶中抗腫瘤活性多肽化合物的分離制備方法，其特征在于得到的毛蚶多肽化合物的分子量為20491. ODa0
9.權(quán)利要求I或2所述的毛蚶中抗腫瘤多肽化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及毛蚶(Arca subcrenata Lischke)中一種活性多肽化合物的分離制備及其醫(yī)藥用途。所述制備方法包括將毛蚶剝殼、內(nèi)容物清洗，加入緩沖液勻漿，提取，離心除渣，取上清液，硫酸銨分級沉淀，透析脫鹽得到抗腫瘤活性組分。將活性組分透析脫鹽、冷凍干燥后，進(jìn)行離子交換柱層析，分別收集活性峰，再經(jīng)疏水柱層析實(shí)現(xiàn)分離純化，就得到一個純度為99％的抗腫瘤活性多肽化合物。本發(fā)明創(chuàng)造性地運(yùn)用現(xiàn)代提取分離技術(shù)從毛蚶中分離得到一個物質(zhì)基礎(chǔ)明確、分子量為20491.0Da的活性多肽化合物。該化合物具有顯著的抗腫瘤活性，體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明抑瘤率達(dá)到87％，且毒副作用小，可用于新型抗腫瘤藥物的開發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號C07K14/435GK103254302SQ201310111139
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者于榮敏, 陳莉莉, 朱建華, 宋麗艷 申請人:于榮敏