專利名稱：一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體及其應用。
背景技術：
當今隨著老齡化的發(fā)展以及各種心臟疾病的增多，導致心力衰竭病人逐年增加。心力衰竭(Heart Failure)是一種由于心臟功能障礙而產生的體征和癥狀的臨床綜合征。雖然現(xiàn)在的一些藥物可延緩病情惡化，但除非進行心臟移植，否則心力衰竭是無法治愈。心力衰竭早期診斷和避免病情惡化是當今醫(yī)療保健面臨的關鍵問題，越早開始治療，對病人就越有益。然而，心力衰竭(尤其是在心衰早期)是很難確診的。心衰的典型癥狀，如呼吸急促、踝關節(jié)腫脹、疲勞等都不具特異性，有些病情輕微的患者也沒有表現(xiàn)出典型癥狀。初級醫(yī)療機構僅依賴臨床標準作為診斷依據(jù)，診斷心力衰竭的假陽性率可高達50%。目前診斷心衰最常用有效的方法主要有超聲心動圖、放射核素顯像和心核磁共振檢查；但是日常實際診斷左心室功能衰竭時，上述檢查手段沒有一項是可以完全信賴，并具有良好的重現(xiàn)性的。因此，臨床上急需一種客觀、簡單、科學的快速診斷方法，提高心衰患者的診斷率。研究表明腦鈉肽(Brain natriuretic peptide, BNP)和氨基末端腦鈉肽前體(N-terminalpro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)濃度的升高對于心衰的診斷具有很高敏感性，并能評估心功能損害嚴重程度，是診斷和鑒別診斷心力衰竭非常有效的生物標記物。BNP是主要由心室分泌的一種多肽類激素，具有利鈉、擴張血管、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的作用。BNP屬于一類具有17氨基酸環(huán)狀結構的多肽激素家族，這其中還包括心鈉妝(trial natriuretic peptide, ANP)、C 型鈉妝(C-type natriureticpeptide, CNP)等。研究表明,這類物質對于慢性心力衰竭及心臟功能不全的診斷具有較強的指導意義。BNP是前腦鈉肽元(preproBNP)通過蛋白酶解過程形成的。proproBNP是在心肌細胞中合成的包含134個氨基酸殘基的多肽鏈，當切掉1-26位信號肽后就形成包含108個氨基酸殘基的腦鈉肽元(proBNP)。心室受刺激時腦鈉肽元(pro-BNP)裂解成有活性的BNP (32個氨基酸)和沒有活性的NT-proBNP (76個氨基酸)。NT-proBNP和含有C末端32個氨基酸的具有生物活性的BNP是等比例釋放，因此二者在心血管系統(tǒng)疾病的診斷、治療、監(jiān)測和預后方面有著相似的臨床應用。NT-proBNP的生物半衰期是60-120分`鐘，相比BNP20分鐘的生物半衰期要長的多。同時，心衰時NT-proBNP的升高幅度要明顯大于BNP，更利于檢測。此外，NT-proBNP在血清和血漿中非常穩(wěn)定，可以采用常規(guī)血液樣本的傳送及處理方法，無需對樣品進行預處理。一般情況下ΝΤ-ρι.οΒΝΡ含量幾乎沒有日間變異，這意味著隨時可以取樣檢測；而且還不受患者體位及運動狀況的影響，在抽取血液樣品時，患者無需休息或平躺。通過與紐約心臟學會(New York heart association, NYHA)心功能分級比較，NT-proBNP更能真實反映心功能的變化。NT-proBNP水平與心衰的嚴重程度相關，水平越高病變越嚴重，預后也越差。同時，NT-proBNP有利于在早期階段或病變輕微階段發(fā)現(xiàn)心衰。對于NT-proBNP的鑒定已經進行過相關研究及報道，W093/24531 (US5, 786，163)公開了能夠結合ΝΤ-ρι.οΒΝΡ47-64位氨基酸的多克隆抗體及檢測方法，Hunt，P.J.等公布了針對1-13位氨基酸的測定法。此外還有針對其它不同氨基酸區(qū)段的測定法，但這些方法都存在重復性較差，樣品預處理方法復雜，表征或/和臨床相關性較差等問題。因此，需要更有效的抗體和特異性檢測方法解決上述問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個目的是提供一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體在制備檢測早期心力衰竭的診斷試劑盒的用途。本發(fā)明的技術方案概述如下:一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體，是用下述方法制成:(I)將多肽片段aal與aa2，利用蛋白偶聯(lián)技術與KLH載體蛋白進行連接，得到偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2 ;(其中KLH載體蛋白又稱鑰孔蟲戚孔血藍蛋白，KLH是分子量十分巨大的蛋白，有幾百萬Da，所以在KLH分子表面有大量的活性基團，常用于蛋白偶聯(lián)的載體蛋白)。(2)用偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2免疫Balb/c小鼠，將免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，制備得到抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體，所述aal是SEQ ID N0.1所示的序列；aa2是SEQ ID N0.2所示的序列。—種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體在制備檢測早期心力衰竭的診斷試劑盒的用途。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所涉及的偶聯(lián)蛋白具有很好的蛋白表面活性及抗原性。能更容易的篩選出特異性好的單克隆抗體。本發(fā)明的偶聯(lián)蛋白有益于增加抗原決定簇的數(shù)量，進而增加單克隆抗體產生的種類，以及提高后期單克隆抗體配對的可能性。使用本發(fā)明制備的抗體具有實驗簡單，抗體親和力高。用本發(fā)明的抗體制備的試劑盒具有特異性強，靈敏度高，穩(wěn)定性好等特點。


圖1為試劑盒繪制的標準曲線。
具體實施例方式實驗材料:HMP resin (P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂)，F(xiàn)mocAA (9_芴基甲氧羰?；Ｗo的氨基酸)，MeoH (甲醇)，DCM (二氯甲烷)，DMAP (二甲基氨基吡啶)，上述材料購于Themo公司；Piperid ine (哌啶)，DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)，HOBT (羥基苯并三唑)，NMP (氮甲基吡咯烷酮)，EDT (1,2-乙二硫醇)，TFA (三氟乙酸)，Thioanisole (硫代苯甲醚)，Phenol, Crystalline (結晶苯酹)，Acetonitrile (乙腈),石臘,KLH載體蛋白，EDC,上述材料購于sigma公司；NT-proBNP 標準品，購于 Ieebio 公司。主要實驗儀器:多肽自動合成儀(美國ABI431A型)，旋轉蒸發(fā)儀(上海于華)，高效液相色譜儀(上海天普分析儀器)，冷凍干燥機，protein G親和層(Themo);低溫離心機(德國eppendorf)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Themo3100);加樣器,恒溫水浴鍋，(德國eppendorf);倒置顯微鏡(上海，H0508);生物安全柜(TECH，B2);酶標儀，Sephadex G-25層析柱，PH儀，(美國biorad)；分析天平(Satorius BS110S);超低溫冰箱(FORMA);液氮罐(成都液氮容器廠，YS-30-125)；普通離心機(北京醫(yī)用離心機廠，LD5-2A),色譜儀Waters 600 (美國Waters公司)，人NT-proBNP酶聯(lián)免疫試劑盒(德國IBL公司)以下結合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實施例1首先利用DNAstar軟件對人NT-proBNP全長氨基酸序列進行前期的蛋白結構及抗原表位分析，根據(jù)最優(yōu)條件，選取兩個多肽片段，即(aal) Y-N-H-L-Q-G-K和(aa2)Y-L-Q-V-E-Q-T-S-L, aal 是 SEQ ID N0.1 所不的序列；aa2 是 SEQ ID N0.2 所不的序列。NT-proBNP抗原決定簇多肽片段aal與aa2的制備:稱取HMP樹脂lOOmg，于美國ABI431A型多肽自動合成儀的反應腔內，由合成儀自動將特定的氨基酸按不同的順序聯(lián)接起來，偶聯(lián)率達99%。反應步驟如下:(I)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)(2)聯(lián)接氨基酸到樹脂上(3)脫去氨基酸的Fomc保護基
(4)氨基酸活化(HOBt/DCC 法)(5)偶聯(lián)(6)重復(3)- (5)直至合成結束。(7)裂解肽樹脂用TFA (三氟乙酸)切割肽鏈，用EDT，硫代苯甲醚，H2O作為清除劑，在室溫反應3小時，去除切割試劑，用乙醚萃取，得到NT-proBNP多肽的粗品。(8)多肽純化采用高效液相色譜分離純化條件:色譜柱C8IO X IOOmm色譜儀Waters600美國Waters公司流動相A-0.1%TFA (三氟乙酸)H20B-0.1%TFA (三氟乙酸)于60%乙腈檢測波長214nm流速4ml/min
洗脫梯度20%-60%B 于 30minHPLC (高效液相色譜)分析色譜柱C184.6X 150mm流動相A-0.1%TFA (三氟乙酸)H20
B-0.1%TFA (三氟乙酸)于60%乙腈檢測波長214nm流速lml/min洗脫梯度 0%-60%B 于 30min兩種多肽片段分析結果顯示純度95%以上。實施例2將實施例1所得的ΝΤ-ρι.οΒΝΡ抗原決定簇多肽片段(aal與aa2)與KLH載體蛋白連接，形成偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2 (簡稱偶聯(lián)蛋白)。蛋白偶聯(lián)步驟如下:1.稱取與所需連接多肽同等質量的KLH，溶于PH7.2PBS緩沖液中，終濃度4 一10mg/ml2.將溶液在PH7.2PBS緩沖液中2 — 8°C透析過夜，中間換一次緩沖液。3.再將溶液在連接緩沖液中室溫下透析2小時，然后轉到干凈的容器中。4.將待連接NT-proBNP抗原決定簇多肽片段(aal與aa2)用蒸懼水溶解至IOmg/ml ο5.按質量比1:1將NT-proBNP抗原決定簇多肽片段(aal與aa2)與KLH溶液混合，形成混合液。6.每Iml混合液中加入1.0mgEDC,室溫反應2 — 4小時。7.將混合物在PH7.2PBS緩沖液中2 — 8°C透析過夜，其間至少換兩次緩沖液。8.將溶液取出，計算濃度，分裝凍存。實施例3用實施例2制備的偶聯(lián)蛋白作為抗原免疫動物制備特異性單克隆抗體。1、動物免疫:將偶聯(lián)蛋白與弗氏佐劑等量混合充分乳化后注射3只Balb/c小鼠，每只小鼠25 μ g,共免疫3次，間隔時間15天。2、細胞融合、選擇性培養(yǎng)、篩選:融合前3天，小鼠腹腔注射無佐劑偶聯(lián)蛋白25 μ g，取出免疫小鼠的脾臟細胞，將2.0 X IO7個SP2/0骨髓瘤細胞與2.0 X IO8個經步驟Cl)免疫的Balb/c小鼠的脾細胞混勻，離心，棄上清，輕微振蕩混勻，于37°C水浴中，在90秒內滴加Iml體積濃度為50%的PEG-1500水溶液，然后滴加20mlDMEM培養(yǎng)基，離心，棄上清，再洗一次，離心，棄上清，得到雜交瘤細胞。使用HAT選擇培養(yǎng)基在96孔細胞培養(yǎng)板上選擇雜交瘤細胞，鏡下檢測總融合率> 95%。鏡下選擇單克隆細胞孔的上清進行檢測，挑取OD450 >0.8的孔內細胞進行亞克隆，最終獲得對NT-proBNP反應陽性率> 99%的細胞克隆，作為分泌抗人NT-proBNP單克隆抗體的雜交瘤細胞株。3、細胞克隆:對獲得的陽性細胞株進行克隆，使用有限稀釋法，克隆3次，最后得到產生高效價的抗人ΝΤ-ρι.οΒΝΡ單克隆抗體雜交瘤細胞系7株，擴大培養(yǎng)，凍存。4、腹水制備:6-8周齡雌性Balb/c小鼠用石蠟處理10天后，取雜交瘤細胞以2X IO6個細胞/只進行腹腔注射。10天后從小鼠腹腔中獲取富含抗體的腹水，測定腹水效價> IO505、純化鑒定:采用protein G親和層析法。首先制備protein G親和層析柱,用PBS平衡柱子后，取腹水過柱， 然后用PBS清洗柱子，至OD值接近于零，以50nmol/L的甘氨酸鹽酸鹽溶液洗脫，收集洗脫液，測定各收集管的OD值，保留峰值區(qū)的洗脫液，洗脫液經透析后收集。經SDS-PAGE電泳鑒定為純化的單克隆抗體，純度為98%以上。實施例4檢測早期心力衰竭的診斷試劑盒的制備本實施例中將實施例2中獲得的7株抗人NT-proBNP單克隆抗體中通過ELISA抗體夾心法挑得一對單克隆抗體作為試劑盒中的標記抗體和包被抗體,試劑盒包含如下。DELISA96孔檢測板一塊:以pH7.2的磷酸鹽緩沖液作為包被稀釋液，在微孔板中加入包被液(將人NT-proBNP單克隆抗體加入包被稀釋液中，使所述抗體的濃度為5-10 μ g/ml)，每孔100 μ 1，在4-8°C過夜，PBST洗板3次，用含有質量濃度為4%的蔗糖的PH7.2磷酸鹽緩沖液溶液封閉37°C，2小時。將微孔內液體拍干，置于零下20°C保存。2)配制人 NT-proBNP 標準品 6 瓶(各 1ml):S00pg/ml, S1150pg/ml, S2340pg/ml,S3890pg/ml, S41850pg/ml, S53500pg/ml,本系列標準品是用胎牛血清稀釋。3) HRP 標記抗體 I 瓶(IOml):6.15g Tris、7.92g 氯化鈉、1.15g 氯化鈣、3.75g 蔗糖、IOg牛血清白蛋白、0.12g柳硫萊鈉、0.05g慶大霉素、0.5ml吐溫200mg苯酹加雙蒸水定溶至IL ;加入ImgHRP標記抗體混勻。(HRP標記抗體步驟:稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。反應后的酶溶液經S^hadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。收集棕色流出液。將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。IM PH9.5的碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時。加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C I小時。3000轉/分鐘離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二`次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，在0.15MPH7.4的PBS緩沖液中透析后，10，000轉/分鐘離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。)4)酶底物溶液I瓶(15ml):為含有0.25g/L TMB,3.19g/L尿酸過氧化氫、lg/L乙酸鈉、2.5lg/L檸檬酸的水溶液。5)終止液 I 瓶(15ml):lmol/L HCl 水溶液。6)洗滌液I瓶(120ml):0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，該緩沖液含0.05%的吐溫20。實施例5使用方法制定標準曲線:將6種人NT-proBNP標準品，加入ELISA96孔檢測板的孔中，每孔100 μ 1，待檢血清，每孔IOOy 1，37°C溫育I小時，洗滌液洗板4次，甩干，加入HRP標記抗體，每孔100μ 1，37°C溫育I小時，洗滌液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，室溫避光顯色15分鐘，加入終止液，每孔100 μ 1，使用酶標儀在450nm測定吸光值(Α450)，以標準品濃度為橫坐標，450nm吸收值為縱坐標，繪制標準曲線，將待測血清450nm吸收值帶入曲線計算血清中NT-proBNP含量。(圖1)回歸方程:y=0.0009x+0.1454Correl=0.9919
權利要求
1.一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體,其特征是用下述方法制成: (1)將多肽片段aal與aa2，利用蛋白偶聯(lián)技術與KLH載體蛋白進行連接，得到偶聯(lián)蛋白 aal_KLH_aa2 ； (2)用偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2免疫Balb/c小鼠，將免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，制備得到抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體,所述aal是SEQ ID N0.1所示的序列；aa2是SEQ ID N0 .2所示的序列。
2.一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體在制備檢測早期心力衰竭的診斷試劑盒的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體及其應用，所述抗體制備為將多肽片段aa1與aa2,與KLH載體蛋白進行連接，得到偶聯(lián)蛋白aa1-KLH-aa2；(2)用偶聯(lián)蛋白免疫Balb/c小鼠，將免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，制備得到抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體，本發(fā)明所涉及的偶聯(lián)蛋白具有很好的蛋白表面活性及抗原性。能更容易的篩選出特異性好的單克隆抗體。有益于增加抗原決定簇的數(shù)量，進而增加單克隆抗體產生的種類，以及提高后期單克隆抗體配對的可能性。使用本發(fā)明制備的抗體具有實驗簡單，抗體親和力高。用本發(fā)明的抗體制備的試劑盒具有特異性強，靈敏度高，穩(wěn)定性好等特點。
文檔編號C07K16/26GK103087191SQ201210576560
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權日2012年12月26日
發(fā)明者魏丙卓 申請人:天健生物制藥(天津)有限公司