專利名稱：：鐮刀菌特異單鏈抗體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及鐮刀菌特異單鏈抗體，還涉及鐮刀菌特異單鏈抗體的制備方法，還涉及鐮刀菌特異單鏈抗體在檢測鐮刀菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鐮刀菌(Fusarium)是世界范圍內(nèi)廣泛存在的赤霉病病原真菌，能夠侵染小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、燕麥(AvenasativaL.)、玉米(ZeamaysL.)、水稻(Oryzasativa)、黑麥(SecalecerealeL.)等多種禾谷類作物,嚴重影響作物的生長發(fā)育狀況及籽粒質(zhì)量，或產(chǎn)生直接危害人畜健康的真菌毒素，引起各種急性或慢性疾病，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失。鐮刀菌侵染作物引起的各種病害是我國小麥、玉米和水稻等主要糧食作物生產(chǎn)上的重要病害，特別是在我國長江流域、華中、華南及東北小麥玉米種植區(qū)流行頻繁，近年來已有向黃淮區(qū)擴展蔓延之勢。調(diào)查也顯示我國的主要糧食作物籽粒均不同程度受到鐮刀菌及其產(chǎn)生的真菌毒素的污染。因此，監(jiān)控鐮刀菌的污染情況，有利于防止田間病害的大面積發(fā)生，也可控制真菌毒素進入食品或飼料中。串珠鐮刀菌(F.verticillioides)是一種非常重要的鐮刀菌，主要侵染玉米，引起穗腐和粒腐，產(chǎn)生有毒的伏馬菌素(Fumonisins)、串珠鐮刀菌素(Moniliformin)、鐮刀菌素C(FusarinC)和鐮刀菌酸(Fusarinicacid)等真菌毒素。所以本發(fā)明選用串珠鐮刀菌作為原始材料制備抗原。目前用于檢測鐮刀菌的方法主要是生物方法和分子檢測，但這些方法需要在檢測前先培養(yǎng)真菌，樣品處理過程繁瑣，費時費力。此外，這些方法對技術(shù)人員和專業(yè)設(shè)備的要求也使得其難以在野外或偏遠地區(qū)開展檢測工作。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測除了具有很高的特異性和檢測限外，還能高通量快速開展工作，不受地域和設(shè)備的限制，易于推廣使用。傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測需要將酶或熒光染料標(biāo)記到一抗或二抗上，用于ELISA檢測與抗體化學(xué)交聯(lián)最常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。但是，由于化學(xué)交聯(lián)是一個隨機的反應(yīng)過程，所以有可能導(dǎo)致活性降低或完全失活，也可能產(chǎn)生抗體-抗體或酶-酶等非特異交聯(lián)物。因此，需要專業(yè)的技術(shù)人員、復(fù)雜的操作和最優(yōu)的反應(yīng)條件來保證獲得高質(zhì)量的抗體-酶交聯(lián)物。生物技術(shù)的發(fā)展使得這一策略發(fā)生了根本性的改變，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建表達單鏈抗體-堿性磷酸酶(scFv-AP)融合蛋白，被認為是快速免疫學(xué)檢測的一個很好的選擇。ScFv-AP融合蛋白通過原核表達系統(tǒng)高效表達純化后用于抗原檢測，不需要添加酶標(biāo)記二抗，從而使免疫學(xué)檢測的效率明顯提高，而檢測費用則大幅降低，應(yīng)用前景十分廣泛。本發(fā)明通過構(gòu)建免疫抗體基因文庫，利用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選獲得鐮刀菌特異單鏈抗體，再通過基因工程技術(shù)手段將單鏈抗體與AP在基因水平上進行融合，原核表達的scFv-AP融合蛋白可為檢測和調(diào)查玉米等糧食作物、飼料以及食品或制品中鐮刀菌的污染情況提供快速可靠的檢測手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供了一種鐮刀菌特異單鏈抗體基因，從串珠鐮刀菌菌絲中抽提細胞壁蛋白(SCWPs)，免疫來亨母雞后提取脾臟細胞，利用分子克隆方法和技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體基因文庫，再通過噬菌體展示技術(shù)篩選、PhageELISA和表達ELISA鑒定，并進行序列測定，最后獲得一個高親和力的鐮刀菌特異單鏈抗體及其編碼基因，申請人將其命名為FvSG7。該基因由810個核苷酸組成，其序列為SEQIDΝΟ:1所示。重鏈可變區(qū)Vh由372個核苷酸組成，其序列為SEQIDNO:3所示。輕鏈可變區(qū)'由315個核苷酸組成，其序列為SEQIDNO5所示。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種鐮刀菌特異單鏈抗體，其序列為SEQIDNO:2所示，由269個氨基酸組成，本發(fā)明的鐮刀菌特異單鏈抗體主要由抗體重鏈可變區(qū)Vh、抗體輕鏈可變區(qū)\和連接肽組成，抗體重鏈可變區(qū)Vh和抗體輕鏈可變區(qū)\通過連接肽(Gly4Ser)3連接共同完成鐮刀菌的識別和結(jié)合。其重鏈可變區(qū)Vh由124個氨基酸組成，序列為SEQIDNO:4所示，輕鏈可變區(qū)'由105個氨基酸組成，其序列為SEQIDN0:6所示。本發(fā)明的另一個目的是提供了一種鐮刀菌特異單鏈抗體在檢測鐮刀菌中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供了一種鐮刀菌特異單鏈抗體的FvSG7-AP融合蛋白基因，其序列為SEQIDN0:7所示。本發(fā)明的還有一個目的是提供了一種鐮刀菌特異單鏈抗體的融合蛋白，其序列為SEQID勵.8所示，鐮刀菌特異單鏈抗體基因？^^67構(gòu)建到？042/5載體中獲得？^^67-八卩融合蛋白表達載體，F(xiàn)vSG7-AP融合蛋白在大腸桿菌中進行大量表達純化后，可直接應(yīng)用于鐮刀菌的檢測。本發(fā)明最后一個目的是提供了一種鐮刀菌特異單鏈抗體的融合蛋白在檢測鐮刀菌中的應(yīng)用。本發(fā)明克服現(xiàn)有檢測技術(shù)存在的缺陷和不足，利用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選獲得一種鐮刀菌特異單鏈抗體，再與堿性磷酸酶構(gòu)建表達融合蛋白，用于在植物或植物來源產(chǎn)品中鐮刀菌污染情況的免疫學(xué)檢測，為鐮刀菌病情調(diào)查及出入境糧食和飼料中鐮刀菌污染情況的檢驗檢疫提供可靠有效的檢測手段。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的直接從串珠鐮刀菌菌絲中抽提細胞壁蛋白(SCWPs)，免疫來亨母雞后提取脾臟細胞，利用分子克隆方法和技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體基因文庫，再通過噬菌體展示技術(shù)篩選、PhageELISA、表達ELISA和序列測定，最后獲得一個高親和力的鐮刀菌特異單鏈抗體及其編碼基因，申請人將其命名為FvSG7，該單鏈抗體與堿性磷酸酶構(gòu)建融合蛋白表達載體，在大腸桿菌中進行可溶性表達，用于檢測鐮刀菌的污染情況。一種鐮刀菌特異單鏈抗體基因FvSG7，其制備步驟是制備SCWPs，免疫來亨母雞，提取其脾臟總RNA、純化mRNA以及合成cDNA第一鏈，再經(jīng)PCR擴增獲得重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(')及單鏈抗體(scFv)基因；隨后，scFv片段經(jīng)酶切后連入PHENHi載體，構(gòu)建單鏈抗體基因文庫；最后，抗體基因文庫經(jīng)噬菌體展示淘選、PhageELISA鑒定和序列測定得到鐮刀菌特異單鏈抗體基因FvSG7，其序列為SEQIDNO1所示。一種鐮刀菌特異單鏈抗體，其制備步驟是將含有鐮刀菌特異單鏈抗體基因FvSG7的pHENHi載體(pHENH1-FvSG7)電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態(tài)細胞，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達，然后經(jīng)N1-NTA柱純化得到FvSG7抗體，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖6所示，可見約35kD大小的目的蛋白，其序列為SEQIDN0:2所示。一種鐮刀菌特異單鏈抗體在鐮刀菌檢測中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是表達純化的FvSG7抗體通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)或制備檢測試劑盒或蛋白芯片等應(yīng)用于鐮刀菌的檢測。I)在ELISA板孔中加入100μI串珠鐮刀菌SCWPs(20μg/ml)，37°C水浴包被2h。2)用200μIPBS洗滌3次。3)在抗原包被的孔及對照孔中分別加入150μI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)，于37°C水浴封閉2h。4)用200μIPBS分別洗滌3次，每次3min。5)在抗原包被孔及其對照孔中分別加入100μI封閉液稀釋的含200nMFvSG7抗體，37°C反應(yīng)2h。6)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。7)每孔加入100μI封閉液稀釋(體積比為1:5000)的抗His單克隆抗體，37°C反應(yīng)1.5h。8)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。9)每孔加入100μI封閉液稀釋(體積比為1:5000)的AP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37°C反應(yīng)1.5h。10)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。11)每孔加入100μI顯色液(O.2%(W/V)對硝基苯磷酸二鈉(ρΝΡΡ)溶液)，黑暗條件下反應(yīng)1530min。12)每孔加入50μINaOH溶液(3Μ)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD4tl5nm讀值。表達ELISA結(jié)果顯示，F(xiàn)vSG7抗體對串珠鐮刀菌SCWPs具有很強的結(jié)合能力，OD405憧平均讀值達到2.331，比陰性對照(O.055)高出42.4倍。在檢測鐮刀菌時，不需要提取SCWPs，將采集的樣品直接研磨后即可檢測。一種鐮刀菌特異單鏈抗體的融合蛋白，其制備步驟是鐮刀菌單鏈抗體基因FvSG7通過酶切連入pDAP2/S載體，重組載體pDAP2/S_FvSG7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態(tài)細胞，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達，然后經(jīng)N1-NTA柱純化得到FvSG7-AP融合蛋白。FvSG7_AP融合蛋白表達純化后，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖6所示，可見約80kD大小的目的蛋白，其序列為SEQIDNO8所示。一種鐮刀菌特異單鏈抗體的融合蛋白在鐮刀菌檢測中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是表達純化的FvSG7_AP融合蛋白通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)或制備檢測試劑盒或蛋白芯片等應(yīng)用于鐮刀菌的檢測。I)在ELISA板孔中加入100μI抗原SCWPs(20μg/ml)，37°C溫育2h。2)用200μIPBS洗滌3次。3)加入150μI封閉液，37°C封閉2h，同時封閉空白孔作對照。4)用200μIPBS洗滌3次。5)每孔加入100μI封閉液稀釋的純化的FvSG7_AP融合蛋白(200nM)，37°C溫育2h。6)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次。7)加入100μ10.2%(W/V)pNPP顯色液顯色1530min,讀取OD405nm值。ELISA結(jié)果顯示，F(xiàn)vSG7_AP融合蛋白對串珠鐮刀菌SCWPs仍保持很強的結(jié)合能力，OD405nm平均讀值達到2.304，比陰性對照(O.052)高出44.3倍。在檢測鐮刀菌時，不需要提取SCWPs，將采集的樣品直接進行研磨處理后即可檢測。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的有益效果之一是利用噬菌體抗體庫技術(shù)，構(gòu)建了鐮刀菌特異單鏈抗體基因文庫，通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得一個高親和力的鐮刀菌特異單鏈抗體及其編碼基因FvSG7。2、本發(fā)明的有益效果之二是鐮刀菌特異單鏈抗體FvSG7可在大腸桿菌中可溶性表達，操作簡單，生產(chǎn)成本低。3、本發(fā)明的有益效果之三是表達純化的FvSG7抗體可用于鐮刀菌的檢測，包括制備檢測試劑盒或蛋白芯片等用于在田間作物、飼料、糧食或食品鐮刀菌污染中的檢測。4、本發(fā)明的有益效果之四是FvSG7抗體與AP在大腸桿菌中融合表達，提供的FvSG7-AP融合蛋白可在重組大腸桿菌中進行大量可溶性表達，不需要貴重的儀器設(shè)備和繁鎖的操作，成本低，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。5、本發(fā)明的有益成果之五是表達純化的FvSG7-AP融合蛋白可用于鐮刀菌的檢測，包括制備檢測試劑盒或蛋白芯片等用于在田間作物、飼料、糧食或食品鐮刀菌污染中的快速檢測。在檢測過程中不需要標(biāo)簽抗體和酶標(biāo)記抗體，降低了檢測成本，縮短了檢測時間。圖1:為一種技術(shù)流程2:為VH、\和scFv片段的凝膠電泳圖。圖中MDNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:重鏈可變區(qū)片段(Vh);泳道2:輕鏈可變區(qū)片段(');泳道3:單鏈抗體基因片段(scFv)。圖3:為一種pHENHi載體結(jié)構(gòu)圖。圖4:為一種PhageELISA鑒定SCWPs免疫雞源淘選抗體庫示意圖。圖中★標(biāo)記為測序的10個單克隆。圖5:為一種FvSG7抗體免疫標(biāo)記串珠鐮刀菌孢子和菌絲的顯微圖像。圖中a和c:顯微鏡明場下的串珠鐮刀菌孢子；e和g:顯微鏡明場下的串珠鐮刀菌菌絲；b和fCy3熒光檢測FvSG7抗體與a和e中串珠鐮刀菌孢子和菌絲的結(jié)合情況；d和hCy3熒光檢測PIPP抗體(對照)與c和g中串珠鐮刀菌孢子和菌絲的結(jié)合情況；標(biāo)尺為10μm。圖6:為一種SDS-PAGE電泳檢測純化的FvSG7抗體和FvSG7_AP融合蛋白示意圖。圖中M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1:scFv_AP融合蛋白；泳道2FvSG7單鏈抗體。圖7:為一種Westernblot分析FvSG7及其融合蛋白對串珠鐮刀菌SCWPs的結(jié)合情況示意圖。圖中aFvSG7抗體檢測；b:FvSG7_AP融合蛋白檢測；M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。圖8:為一種表面等離子共振(SPR)分析FvSG7抗體及FvSG7_AP融合蛋白的結(jié)合力示意圖。圖9:為一種ELISA檢測FvSG7抗體及FvSG7_AP融合蛋白的最低檢測限示意圖。圖10:為一種ELISA檢測FvSG7_AP融合蛋白的最低定量限示意圖。具體實施例方式實施例1:串珠鐮刀菌細胞壁蛋白(SCWPs)制備I)用接種針挑取串珠鐮刀菌(Fusariumverticillioides)whl_2(該菌株已于2010年10月28日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為=CCTCCM2010283)，接種于20mlCMC培養(yǎng)基(成分0.75%(W/V)羧甲基纖維素酯，O.05%(ff/V)NH4NO3,O.05%(ff/V)KH2PO4,0.025%(ff/V)MgSO4·7Η20，0·05%(W/V)酵母粉)中，28°C，200r/min振蕩光照培養(yǎng)3天，用兩層滅菌紗布過濾，收集孢子液。2)取Iml孢子液接種于160mlCzapek培養(yǎng)基(成分3%(W/V)蔗糖，O.3%(W/V)NaNO3,0.1%(WA)K2HPO4,0.05%(ff/V)MgSO4·7Η20,0.05%(ff/V)KCl,O.001%(ff/V)FeSO4,pH9.O)中，28°C，225r/min振蕩避光培養(yǎng)57天。3)用2層滅菌紗布過濾培養(yǎng)液，并用滅菌水洗滌3次后將菌絲置于超凈工作臺上吹干。4)在研缽中加入液氮研磨菌絲，裝入2ml離心管中，置于冰上。5)加入1.52mlCWP緩沖液(IOmMTris-HCl，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH7.8)混勻。6)4°C,50r/min旋轉(zhuǎn)洗漆30min。7)4°C,4600r/min離心IOmin,棄上清。8)用預(yù)冷的CWP洗脫液(IMNaCl，ImMPMSF)洗滌35次，每次4°C，50r/min旋轉(zhuǎn)洗漆30min,再4°C,4600r/min離心IOmin后棄上清。9)加入IOml含ImMPMSF的滅菌水混勻，4600r/min離心IOmin,棄上清。10)力卩入5ml處理液(50mMTris-HCl(pH8.0),0.1MEDTA,2%(W/V)SDS，IOmMDTT)懸浮沉淀，煮沸IOmin。2)室溫15000r/min離心lOmin。3)吸取上清，加入4倍體積的丙酮和等體積的三氯乙酸(TCA)，充分混勻后冰上放置30min。4)4°C,15000r/min離心45min,棄上清。5)加入25ml預(yù)冷丙酮重懸沉淀，_20°C放置Ih或過夜。6)重復(fù)步驟4和5操作23次。7)棄上清，干燥5IOmin直至丙酮完全揮發(fā)。8)加入2mlPBS，超聲波助溶30min。9)4°C,12000r/min離心IOmin,保留上清。10)重復(fù)步驟8和9，合并上清。ll)4°C，12000r/min離心lOmin，取上清加入超濾管，加入IOmlPBS超濾23次(4°C,4000r/min離心3060min)。12)吸取超濾液至離心管，4°C，12000r/min離心lOmin，取上清保存于_20°C備用。實施例2=SCffPs免疫來亨母雞用制備的串珠鐮刀菌SCWPs免疫來亨母雞(購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)雞場)4次，每次間隔14天。第一次取500μI免疫抗原(100μg)與500μI弗氏完全佐劑混合后免疫，后三次取500μI免疫抗原與500μI弗氏不完全佐劑混合后免疫。第三次免疫后第5天取血清從1:103倍比稀釋至1:128Χ103，參照林巧愛、董海艷主編，《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》,浙江大學(xué)出版社,2006年出版介紹的間接ELISA法檢測免疫雞血清中抗體的水平。檢測結(jié)果顯示被免疫后的雞血清中產(chǎn)生了較高的抗體滴度(稀釋度>1:105)。實施例3:提取脾臟總RNA、純化mRNA以及合成cDNA第一鏈I)最后一次免疫后第7天取免疫后產(chǎn)生較高抗血清反應(yīng)的雞的脾臟。2)利用TRNzol-A+總RNA提取試劑(購自天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，按照該試劑的說明書操作)提取脾臟總RNA。3)用mRNA純化試劑盒(購自QIAGEN公司，按該試劑盒的說明書操作)對步驟2提取的總RNA進行純化。4)用SuperScriptIII反轉(zhuǎn)錄酶(購自Invitrogen公司，按照該酶的說明書操作)分別以步驟3得到的mRNA為模板，用特異引物chicVHM(CGGTGGGGGACATCTGAGTGGG)反轉(zhuǎn)錄合成抗體重鏈可變區(qū)(Vh)的cDNA第一鏈；用特異引物chicVLM(AGGGGTGGAGGACCTGCACCTC)反轉(zhuǎn)錄合成輕鏈可變區(qū)的cDNA第一鏈。實施例4:PCR擴增重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(')及單鏈抗體(scFv)基因I)PCR擴增Vh和Vl基因以實施例3反轉(zhuǎn)錄合成的Vh的cDNA為模板，用正向引物CPDVHF(ATCTAGGCATCCCTTGGCCCAGCCGGCCATGGCTGCCGTGACGTTGGACGAGTCC)和反向引物CHICGly(GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGATGACCTCGGTCCC)進行PCR擴增獲得Vh片段；以實施例3反轉(zhuǎn)錄合成的\的cDNA為模板，用正向引物CHICSer(GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCGCTGACTCAGCCGTCCTCGGTG)和反向引物CPDVLB(TGACCTTCGAGGATGCGCGGCCGCGTCGACGGGCTGGCCTAGGACGGTCAG)進行PCR擴增獲得Vl片段。在50μIPCR反應(yīng)體系中，含有4μIcDNA,5μIPCR緩沖液(含Mg2+)，8μ11.25mMdNTPs，2μI正向引物(10μΜ)，2μI反向引物(10μΜ)，2·5UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為95°C5min；94°Clmin，55°Clmin，72°C80sec，30個循環(huán)；最后72°CIOmin0PCR產(chǎn)物通過1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果如圖2所示，Vh和\片段大小與預(yù)期相一致。2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)分別純化步驟I擴增得到的Vh和\片段。3)SOE-PCR擴增scFv基因加入近等摩爾的Vh和\片段作為模板，用正向引物CPDVHF和反向引物CPDVLB進行SOE-PCR擴增，獲得scFv基因。SOE-PCR分兩步反應(yīng)完成，第一步反應(yīng)在50μIPCR反應(yīng)體系中，含有％和Vl片段各400ng，5yIPCR緩沖液(含Mg2+)，8μ11.25mMdNTPs,2.5UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為95°C5min,55°C2min,72°C15min，7個循環(huán)；第二步反應(yīng)在50μIPCR反應(yīng)體系中，含有10μI第一步反應(yīng)PCR產(chǎn)物，4μIPCR緩沖液(含Mg2+)，8μ1.25mMdNTPs，2μI正向引物(10μM)，2μI反向引物(10μM)，2.5UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為95°C5min；94°Clmin,55°C80sec,72°C2min,30個循環(huán)；最后72°CIOmin0PCR產(chǎn)物通過1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果如圖2所示，SCFv片段大小與預(yù)期相一致。4)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)回收純化步驟3獲得的scFv片段。實施例5=PHENHi載體及scFv片段酶切、連接I)分別用SfiI和NotI限制性內(nèi)切酶(購自NEB公司，按照該酶的說明書操作)雙酶切載體pHENHi(PeschenD,LiHP,etal.FusionproteinscomprisingaFusarium-specificantibodylinkedtoantifungalpeptidesprotectplantsagainstafungalpathogen.Nat.Biotechnol.,2004,22:732-738,如圖3所不)和實施例4得到的scFv片段。2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)純化步驟I酶切后的PHENHi載體和scFv片段。3)用T4DNA連接酶(購自NEB公司，按照該酶的說明書操作)連接步驟2回收的pHENHi載體和scFv片段，得到酶連接產(chǎn)物pHENH1-scFv。4)參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法對步驟3得到的酶連接產(chǎn)物pHENH1-scFv進行乙醇沉淀除鹽。實施例6:單鏈抗體基因文庫構(gòu)建I)大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態(tài)細胞制備用無菌牙簽蘸取大腸桿菌菌株XLl-BlueMRF’(購自Stratagene公司),在LB固體培養(yǎng)基(成分1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)NaCl,l.5%(ff/V)瓊脂，pH7.0)平板上劃線，于37°C恒溫箱培養(yǎng)16h后，挑取一單克隆菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基(成分1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，1%(ff/V)NaCl,ρΗ7·0)中，37°C,200r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。取1.6ml菌液加入到160mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C，230r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltol達到0.45左右時，取出培養(yǎng)菌的三角瓶置于冰上冷卻30min后，將菌液分裝于50ml離心管中，4°C,4000r/min離心15min,棄上清,然后用30ml預(yù)冷的10%(V/V)甘油洗滌菌體沉淀兩次(4°C，4000r/min離心15min后棄上清)。最后每個離心管中加入100μI預(yù)冷的GYT培養(yǎng)基(成分0.25%(W/V)胰蛋白胨，0.125%(W/V)酵母提取物，10%(V/V)甘油)懸浮菌體，分裝成100μI/管，立即保存于_80°C冰箱。2)電轉(zhuǎn)化酶連接產(chǎn)物將_80°C保存的大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態(tài)細胞取出，置冰上溶化后，每管感受態(tài)細胞(100μI)中加入5μI酶連接產(chǎn)物pHENH1-scFv，小心輕微地混勻后放冰上靜置3min，然后將感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯(0.2cm)(購自BIO-RAD公司)中，用BIO-RAD公司的MicroPulser電轉(zhuǎn)化儀進行電轉(zhuǎn)化(設(shè)置BacteriaEc2程序)。轉(zhuǎn)化后立即加入ImlSOC培養(yǎng)基(成分2%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，0.05%(W/V)NaCl，20mM葡萄糖，pH7.0)到電轉(zhuǎn)化杯中，并將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)Ih使細胞復(fù)蘇。3)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞涂布平板培養(yǎng)取出復(fù)蘇后的感受態(tài)細胞，取100μI涂布于含1%(W/V)葡萄糖和100μg/ml氨節(jié)青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基平板用于計算單克隆菌落數(shù)。其余的菌液通過6000r/min離心Imin后吸棄部分上清，每管保留約100150μI上清重懸菌體，涂布于含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的LB固體培養(yǎng)基平板，置于37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)1216h至長出單克隆菌落。4)抗體基因文庫收集保存計算電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞涂布平板培養(yǎng)后長出的單克隆菌落數(shù)量，估算抗體基因文庫容量。收集LB固體培養(yǎng)基平板上長出的菌落，加入等體積50%(V/V)甘油保存于_80°C冰箱。通過以上步驟操作，最后構(gòu)建的鐮刀菌特異單鏈抗體基因文庫容量約為4.7X107cfu。實施例7:單鏈抗體基因文庫鑒定I)從實施例6平板上長出的轉(zhuǎn)化子中隨機挑取20個單克隆菌落接種到含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。2)參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的煮沸裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過O.8%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測抗體基因文庫的陽性率。3)以步驟2得到的質(zhì)粒DNA為模板，用正向引物pHENpel(GCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGC)和反向引物pHENmyc(ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG)進行PCR擴增。在25μIPCR反應(yīng)體系中，含有50ng質(zhì)粒DNA，2.5μIPCR緩沖液(含Mg2+)，2μ11.25mMdNTPs,IμI正向引物pHENpel(10μΜ)，IμI反向引物pHENmyc(10μΜ)，1.25UTaq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為94°C5min；94°C50sec,48°C90sec,72°C90sec，30個循環(huán)；最后72°CIOmin0PCR產(chǎn)物通過1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測抗體基因文庫的陽性率。4)用BstNI限制性內(nèi)切酶(購自NEB公司，按照該酶的說明書操作)酶切步驟3擴增的PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物通過1.5%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測抗體基因文庫的多樣性。鑒定結(jié)果顯示，構(gòu)建的抗體基因文庫陽性率達到100%，多樣性高于70%，說明構(gòu)建的文庫質(zhì)量較高，可用于特異單鏈抗體的篩選。實施例8:噬菌體展示篩選單鏈抗體基因文庫I)取實施例6收集保存的菌液(抗體基因文庫)500μI加入到50ml含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的2XTY培養(yǎng)基(成分1.6%(W/V)胰蛋白胨，1%(W/V)酵母提取物，O.5%(ff/V)NaCl,ρΗ7·O)中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm達到O.5。2)取5ml菌液于50ml離心管中，加入O.5μIMl3Κ07輔助卩遼菌體(購自AmershamBiosciences公司，參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法制備保存，其中噬菌體的量為大腸桿菌的20倍)，混勻后于37°C水浴靜置30min。3)4000r/min離心lOmin，棄上清，然后重懸于140ml含100μg/mlAmp和25μg/ml卡那霉素(Kan)的2XTY培養(yǎng)基中，30°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)至少15h。4)將過夜培養(yǎng)的菌液分裝于50ml離心管中，4°C,4000r/min離心30min。5)取上清，加入1/5體積的PEG/NaCl溶液(20%(W/V)聚乙二醇(PEG)6000，2·5MNaCl),充分混勻后置冰上沉淀lh。6)4°C,8000r/min離心30min,棄上清,將沉淀重懸于40ml滅菌水中，并立即加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，充分混勻后4°C放置20min。7)4°C,4000r/min離心30min,棄上清。8)輕微離心，去除殘留的PEG/NaCl溶液。9)加入1.6ml滅菌水重懸沉淀，4°C,12000r/min離心lOmin,取上清于4°C保存。10)用串珠鐮刀菌SCffPs包被ELISA板(共20孔，每孔100μI)，37°C水浴2h。11)用磷酸鹽緩沖液(PBS)(成分137mMNaCl,2.7mMKCl,IOmMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,ρΗ7·27·4)洗滌3次。12)每孔加入150μI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)，37°C水浴封閉2h(用封閉液封閉一空白孔作為陰性對照)。10)用200μIPBS分別洗滌3次，每次3min。11)每孔中加入100μI步驟9保存的上清(噬菌體)，37°C水浴2h。12)用200μIPBST(含O.1%(V/V)Tween20的PBS)和PBS分別洗滌5次，每次3min(第二輪和第三輪淘選時增加洗滌次數(shù)至10次和15次)。13)每孔加入ΙΟΟμI三乙胺溶液(IOOmM),室溫放置lOmin。14)立即加入50μITris-HCl溶液(1Μ，ρΗ7·4)中和，并轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。15)取6ml在37°C，230r/min振蕩培養(yǎng)條件下生長至OD6tltlnm為0.50.9的大腸桿菌XLl-BlueMRF’加入到50ml離心管中，37°C水浴侵染30min。16)4000r/min離心lOmin,棄上清。17)加入800μILB培養(yǎng)基重懸菌體后涂布于TYE固體培養(yǎng)基(成分1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，0.8%(W/V)NaCl,l.5%(W/V)瓊脂，ρΗ7·0)平板上，37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)1216h至長出菌落。18)收集TYE固體培養(yǎng)基平板上長出的菌落，進行下一輪淘選或加入等體積50%(V/V)甘油保存于-80°c冰箱。實施例9=PhageELISA鑒定淘選抗體庫I)在96孔細胞培養(yǎng)板孔中加入180μI含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的2XTY培養(yǎng)基，用滅菌牙簽從第三輪淘選抗體庫的菌落中隨機挑取48個單克隆接種，30°C，150r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。2)在另一96孔培養(yǎng)板孔中加入180μ12XTY培養(yǎng)基(含1%(W/V)葡萄糖，100μg/mlAmp以及約IO8輔助噬菌體M13K07)，再加入20μI過夜培養(yǎng)菌液，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)2h。3)室溫1800r/min離心IOmin,棄上清。4)加入180μI含100μg/mlAmp和50μg/mlKan的2XTY培養(yǎng)基至培養(yǎng)板孔中，37°C,150r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。5)1800r/min離心lOmin,培養(yǎng)基上清用于phageELISA檢測。6)在ELISA板孔中加入100μISCWPs(50μg/ml)或PBS(對照)，37°C水浴包被2h。7)用200μIPBS洗滌3次。8)加入150μI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)，37°C水浴封閉2h。9)用200μIPBS洗滌3次。10)加入50μI步驟5收集的培養(yǎng)基上清，并加入50μI封閉液，37°C反應(yīng)2h。11)用PBST和PBS分別洗滌3次。12)加入ΙΟΟμ11:5000(V/V)稀釋的HRP標(biāo)記鼠抗M13抗體，37°C反應(yīng)2h。13)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次。14)加入100μI可溶性單組份TMB底物(購自天根生化科技(北京)有限公司)，黑暗條件下反應(yīng)1530min。15)加入50μIH2SO4溶液(2Μ)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD45tlnm讀值。PhageELISA鑒定結(jié)果顯示，48個單克隆樣品中有33個顯色(如圖4所示)，從其中挑取顯色較高的10個單克隆樣品(圖4中★標(biāo)注)的培養(yǎng)菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，分析結(jié)果顯示它們具有一致的核苷酸序列(命名為FvSG7)，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，其氨基酸序列如序列表SEQIDΝ0:2所示。含有該基因的大腸桿菌命名為重組大腸桿菌XLl-BlueMRF’/pHENHi_FvSG7，單克隆培養(yǎng)菌液加等體積50%(V/V)甘油保存于_80°C冰箱。實施例10:重組大腸桿菌超量表達、純化FvSG7抗體I)取5μI甘油保存的重組大腸桿菌XLl-BlueMRF’/pHENH1-FvSG7接種于20ml含1%(W/V)葡萄糖和ΙΟΟμg/mlAmp的2XTY培養(yǎng)基中，37°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)12h。2)取8ml過夜培養(yǎng)菌液加入160ml含1%(W/V)葡萄糖和100μg/mlAmp的2XTY培養(yǎng)基中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm達到O.5左右。3)加入終濃度為O.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，置于30°C，200r/min誘導(dǎo)表達8h。4)取培養(yǎng)菌液分裝到50ml離心管中，4°C,5000r/min離心lOmin,棄上清。5)每管中加入500μIPPP溶液(30mMTris-HCl,20%(W/V)蔗糖，ρΗ8·0)重懸菌體，再加入IμI乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(終濃度ImM)，冰上放置15min。6)4°C,5000r/min離心15min,上清裝入另一離心管中。7)每管中加入ImlMgCl2溶液(終濃度5mM)重懸菌體，再加入2μIEDTA溶液(終濃度ImM)，冰上放置15min。8)4°C,5000r/min離心15min,上清與步驟6上清合并。9)取收集步驟6和8上清的離心管于4°C,12000r/min離心15min。10)取上清用PBS透析72h。11)安裝純化柱(購自BIO-RAD公司)，加入400μI充分混勻的基質(zhì)(購自QIAGEN公司)，使其固定2h以上。12)剪去下端封口，使液體流下，用5mlPBS進行平衡。13)加入步驟10透析后的單鏈抗體樣品過柱，收集保存過柱后的樣品流出液。14)加入Iml緩沖液B(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，20mM咪唑，ρΗ8·0)洗脫純化柱3次，分別收集洗脫液為Β1、Β2、Β3(雜蛋白)。15)加入400μI緩沖液C(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，250mM咪唑，ρΗ8·0)洗脫純化柱3次，分別收集洗脫液為Cl、C2、C3(目的蛋白)。16)加5mlPBS平衡純化柱后，加入Iml30%(V/V)酒精4°C保存純化柱。17)重組抗體通過SDS-PAGE電泳檢測(實施例11)后用PBS.透析。實施例11:SDS-PAGE電泳檢測純化的FvSG7抗體I)取10μI實施例10純化的FvSG7抗體，加入2.5μ15X十二烷基硫酸鈉(SDS)加樣緩沖液(250mMTris-HCl(pH6.8),10%(ff/V)SDS(電泳級)，0.5%(W/V)溴酚藍，50%(V/V)甘油，5%(ff/V)β-巰基乙醇)，充分混勻，水浴煮沸5min，然后置于冰上備用。2)參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法制備分離膠和濃縮膠。3)安裝蛋白垂直電泳系統(tǒng)(購自BIO-RAD公司)，加入IXTriS-甘氨酸電泳緩沖液(25mMTris，250mM甘氨酸，O.1%(W/V)SDS)，取放置在冰上的樣品上樣。4)先設(shè)置電壓80伏電泳20min，再用120伏電壓電泳80120min至溴酚藍跑至分離膠外。5)取下凝膠，去掉濃縮膠后用染色液(O.1%(W/V)考馬斯亮藍R-250，25%(V/V)異丙醇，10%(V/V)冰醋酸)染色30min。6)用脫色液(5%(V/V)甲醇，7.5%(V/V)冰醋酸)脫色35次，觀察照相。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖6所示，可見約35kD大小的目的蛋白。實施例12:表達ELISA檢測FvSG7抗體I)在ELISA板孔中加入100μI串珠鐮刀菌SCWPs(20μg/ml)，37°C水浴包被2h。2)用200μIPBS洗滌3次。3)在抗原包被的孔及對照孔中分別加入150μI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)，37°C水浴封閉2h。4)用200μIPBS分別洗滌3次，每次3min。5)在抗原包被孔及其對照孔中分別加入100μI封閉液稀釋的含200ηΜ實施例10純化的FvSG7抗體，37°C反應(yīng)2h。6)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。7)每孔加入ΙΟΟμI封閉液稀釋(體積比為1:5000)的抗His單克隆抗體(購自天根生化科技(北京)有限公司)，37°C反應(yīng)1.5h。8)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。9)每孔加入ΙΟΟμI封閉液稀釋(體積比為1:5000)的AP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(購自Sigma公司)，37°C反應(yīng)1.5h。10)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。11)每孔加入ΙΟΟμI顯色液(0.2%(W/V)對硝基苯磷酸二鈉(ρΝΡΡ)溶液)，黑暗條件下反應(yīng)1530min。12)每孔加入50μINaOH溶液(3Μ)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD4tl5nm讀值。表達ELISA結(jié)果顯示，F(xiàn)vSG7抗體對串珠鐮刀菌SCWPs具有很強的結(jié)合能力，OD405憧平均讀值達到2.331，比陰性對照(0.055)高出42.4倍。實施例13:免疫熒光檢測FvSG7抗體的結(jié)合特性I)按實施例1的步驟I培養(yǎng)串珠鐮刀菌孢子。2)取IO5孢子液接種于20mlYPG培養(yǎng)基(成分0.3%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)蛋白胨，2%(W/V)葡萄糖)中，28°C，200r/min振蕩避光培養(yǎng)1216h至大部分孢子萌發(fā)。3)用2MNa0H浸泡蓋玻片2h，再用蒸餾水清洗。4)多聚賴氨酸浸泡蓋玻片5min，用蒸餾水清洗。5)向12孔細胞培養(yǎng)板孔中加入2ml2%(W/V)小牛血清白蛋白(BSA，購自Sigma公司)溶液，37°C保濕封閉2h。6)用2mlPBS洗滌3次。7)在細胞培養(yǎng)板孔中放入蓋玻片，加入Iml萌發(fā)孢子液。8)細胞培養(yǎng)板在室溫條件下,2800r/min離心15min。9)用2mlPBS洗滌3次。10)加入500μI實施例10純化的FvSG7抗體(Iμg/ml)，37°C保濕反應(yīng)2h。11)用2mlPBST和PBS分別洗滌3次。12)加入500μ11:3000(V/V)稀釋的抗His單克隆抗體，37°C保濕反應(yīng)2h。13)用2mlPBST和PBS分別洗滌3次。14)加入500μ11:100(V/V)稀釋的Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)抗體(購自美國ProteinTechGroup公司)，37°C反應(yīng)lh。15)用2mlPBST和PBS分別洗滌3次。16)在載玻片上滴加封片劑,蓋上蓋玻片，置于突光顯微鏡下觀察。免疫熒光實驗結(jié)果如圖5所示，加入FvSG7抗體反應(yīng)后，在串珠鐮刀菌孢子和菌絲的表面都有很強的熒光亮度(圖5b和5f)，而對照加入人類絨毛促性腺素特異單鏈抗體PIPP(KathuriaS，SriramanR,etal.Efficacyofplant-producedrecombinantantibodiesagainstHCG.Hum.Reprod.,2002,17:2054-2061.)與菌絲或抱子反應(yīng)后，未見任何熒光反應(yīng)(圖5d和5h)，說明FvSG7抗體能與串珠鐮刀菌孢子和菌絲細胞壁表面的靶抗原特異結(jié)合。實施例14FvSG7-AP融合蛋白表達載體構(gòu)建、原核表達和純化I)FvSG7抗體基因通過SOE-PCR擴增在3’端加上218連接肽(WhitlowM,BellBA,etal.Animprovedlinkerforsingle-chainFvwithreducedaggregationandenhancedproteolyticstability.Protein.Eng.,1993,6:989-995.),然后利用SfiI和NotI內(nèi)切酶(購自NEB公司，按照該酶的說明書操作)酶切后直接連接到PDAP2/S載體(KerschbaumerRJ,HirschlS，etal.Single-chainFvfusionproteinssuitableascoatinganddetectingreagentsinadoubleantibodysandwichEnzyme-linkedimmunosorbentassay.Anal.Biochem.,1997,249:219-227.)中，得到含有FvSG7_AP融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化到E.coliXLl-BlueMRF’感受態(tài)細胞(方法見實施例6步驟2)中，挑取單克隆培養(yǎng)后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定陽性克隆，得到含有重組質(zhì)粒DNA的重組大腸桿菌。2)FvSG7-AP融合蛋白的表達和純化按實施例10的方法操作，但步驟3誘導(dǎo)表達為16°C誘導(dǎo)表達20h。FvSG7-AP融合蛋白表達純化后，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖6所示，可見約80kD大小的目的蛋白。實施例15FvSG7-AP融合蛋白活性檢測I)在ELISA板孔中加入100μI抗原SCWPs(20μg/ml)，37°C溫育2h。2)用200μIPBS洗滌3次。3)加入150μI封閉液，37°C封閉2h，同時封閉空白孔作對照。4)用200μIPBS洗滌3次。5)每孔加入100μI封閉液稀釋的實施例14純化的FvSG7_AP融合蛋白(200nM)，37°C溫育2h。6)用200μIPBST和PBS分別洗滌3次。7)加入100μ10.2%(ff/V)ρΝΡΡ顯色液顯色1530min,讀取OD405nm值。ELISA結(jié)果顯示，F(xiàn)vSG7_AP融合蛋白對串珠鐮刀菌SCWPs仍保持很強的結(jié)合能力，OD405nm平均讀值達到2.304，比陰性對照(O.052)高出44.3倍。實施例16=ELISA分析FvSG7抗體和FvSG7_AP融合蛋白的結(jié)合特性I)選取23個鐮刀菌和其它真菌菌株(見表I)，按實施例1的步驟I培養(yǎng)真菌孢子。2)取IOVml孢子液接種于2mlYPG培養(yǎng)基中，28°C，200r/min振蕩避光培養(yǎng)1216h至大部分孢子萌發(fā)。3)在ELISA板孔中加入100μI真菌萌發(fā)孢子液，37°C水浴包被2h。4)分別用FvSG7抗體和FvSG7_AP融合蛋白檢測。①FvSG7抗體檢測按實施例12步驟212操作。②FvSG7_AP融合蛋白檢測按實施例15步驟27操作。ELISA結(jié)果見表1，結(jié)果表明FvSG7抗體和FvSG7_AP融合蛋白對鐮刀菌都具有很高的親和力，而與其它真菌無交叉反應(yīng)，說明FvSG7-AP融合蛋白保留了FvSG7抗體的親和力和特異性。表IELISA檢測分析FvSG7抗體和FvSG7_AP融合蛋白的親和力和特異性權(quán)利要求1.一種鐮刀菌特異單鏈抗體基因，其特征在于基因FVSG7，其序列為SEQIDNO:1所/Jnο2.權(quán)利要求1所述的一種鐮刀菌特異單鏈抗體基因，其特征在于該基因的重鏈可變區(qū)Vh由372個核苷酸組成，其核苷酸序列為SEQIDNO:3所示；輕鏈可變區(qū)'由315個核苷酸組成，其核苷酸序列為SEQIDNO:5所示。3.一種鐮刀菌特異單鏈抗體，其特征在于FvSG7抗體，其序列為SEQIDNO2所示。4.權(quán)利要求3所述的一種鐮刀菌特異單鏈抗體，其特征在于其重鏈可變區(qū)Vh由124個氨基酸組成，序列為SEQIDNO4所示；輕鏈可變區(qū)\由105個氨基酸組成，其序列為SEQIDNO6所示。5.一種鐮刀菌特異單鏈抗體重組基因，其特征在于基因FvSG7-AP，其序列為SEQIDNO7所示。6.一種鐮刀菌特異單鏈抗體融合蛋白，其特征在于FvSG7-AP融合蛋白，其序列為SEQIDNO8所示。7.權(quán)利要求3所述的一種鐮刀菌特異單鏈抗體在鐮刀菌檢測中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求6所述的一種鐮刀菌特異單鏈抗體融合蛋白在鐮刀菌檢測中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了鐮刀菌特異單鏈抗體及制備方法和應(yīng)用，從串珠鐮刀菌菌絲中抽提細胞壁蛋白，免疫來亨母雞后提取脾臟細胞，利用分子克隆方法和技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體基因文庫，通過噬菌體展示技術(shù)篩選、PhageELISA、表達ELISA和序列測定，獲得了一個高親和力的鐮刀菌特異單鏈抗體及其編碼基因，申請人將其命名為FvSG7，并與堿性磷酸酶基因構(gòu)建融合蛋白表達載體，在大腸桿菌中進行可溶性表達，得到鐮刀菌特異單鏈抗體FvSG7和FvSG7-AP融合蛋白，該抗體和融合蛋白可用于在植物或植物來源產(chǎn)品中鐮刀菌污染情況的免疫學(xué)檢測，為鐮刀菌病情調(diào)查及出入境糧食和飼料中鐮刀菌污染情況的檢驗檢疫提供可靠有效的檢測手段。文檔編號C07K19/00GK103014012SQ201210574749公開日2013年4月3日申請日期2012年12月26日優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日發(fā)明者廖玉才,胡祖權(quán),李和平,張靜柏申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)