專利名稱：從太湖藍(lán)藻中提取微囊藻毒素-lr的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水處理應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種從太湖藍(lán)藻中提取微囊藻毒素-LR (MC-LR)的方法。
背景技術(shù)：
微囊藻毒素(MCs)是一種環(huán)七肽化合物，其基本結(jié)構(gòu)為環(huán)(D-丙氨酸-L-X-D-赤-甲基- β -D-異天冬氨酸-L-Z-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸)， 其中N-甲基脫氫丙氨酸為一種特殊的氨基酸，含α、β不飽和雙鍵，Adda結(jié)構(gòu)為3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6- 二烯酸。Χ、Υ分別為兩種可變的L氨基酸， 其氨基酸的更替或者其它氨基酸的去甲基化，衍生出眾多的毒素類型，其中MC-LR (分子式為C49H75N13O12)毒性最大。近年來(lái)，我國(guó)太湖、松花江、淮河等飲用水源地藍(lán)藻水華污染嚴(yán)重，向水體釋放大量的MC-LR，由MC-LR引起的健康問(wèn)題日益受到重視，大量科技工作人員正在深入研究 MC-LR各種毒理和分解特性。由于研究過(guò)程中MC-LR樣品嚴(yán)重缺乏，只能依賴進(jìn)口。一支規(guī)格為10 ug的MC-LR進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品售價(jià)高達(dá)3500元，使得實(shí)驗(yàn)室研究成本較高，一般中小研究機(jī)構(gòu)難以開(kāi)展相關(guān)研究工作。因此，迫切需要一種經(jīng)濟(jì)、有效的提取、純化MC-LR的方法。 如何從現(xiàn)有的藍(lán)藻中提取MC-LR已成為國(guó)內(nèi)研究的一大難點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種以太湖新鮮藍(lán)藻為原材料，經(jīng)陽(yáng)光暴曬干燥后，研磨成藻粉，從中提取MC-LR的方法。關(guān)于MCs提取提純方法，最早見(jiàn)于Bote等1982年發(fā)表在英國(guó)的《毒素》期刊中的 《銅綠微囊藻》一文中。Bote等提出了幾種不同的MCs提取、提純方法。但這些方法對(duì)MCs 的提取、提純效率均存在一定的差異，很難普及一種公認(rèn)且簡(jiǎn)便有效的方法。此外，由于MCs 的變體較多，性質(zhì)不統(tǒng)一，難以形成普遍認(rèn)同的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前，MCs常規(guī)提取方法是以藍(lán)藻細(xì)胞為對(duì)象，經(jīng)過(guò)提取、濃縮和分離等過(guò)程后獲得MCs純品；對(duì)于MC-LR的提純，最普遍的方法是應(yīng)用C18固相萃取柱進(jìn)行分離提純。這種方法可獲得較高純度的MC-LR，但每次提純的量較少，并且分離柱價(jià)格昂貴。本發(fā)明以太湖新鮮藍(lán)藻為原材料，以藻粉為提取對(duì)象，以幾種不同濃度的甲醇溶液為MC-LR的提取液，以C18固相萃取柱為提純工作站。通過(guò)優(yōu)化提取、提純條件，得到了這種簡(jiǎn)單、易行、高效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的從太湖新鮮藍(lán)藻中提取MC-LR的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以太湖新鮮藍(lán)藻為原材料，從中提取MC-LR的方法。主要包括藍(lán)藻粉的制備，MC-LR的提取及提純?nèi)齻€(gè)部分。采用一種以甲醇溶液為提取液，C18 固相萃取柱為提純工作站的MC-LR提取提純方法，從而得到較高回收率的MC-LR純品。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明以甲醇溶液為提取液，從太湖藍(lán)藻中提取MC-LR，具體過(guò)程如下
1)藻粉的制備方法直接從水面上撈取新鮮藍(lán)藻，用60-100目篩網(wǎng)過(guò)濾后，得到新鮮藻泥，將藻泥置于陽(yáng)光下暴曬干燥后磨碎，用60目篩網(wǎng)分篩得粉狀藻粉，將收集的藻粉密封保存于冰箱中備用。2) MC-LR的提取方法
稱取藻粉加入質(zhì)量濃度為10-80%甲醇溶液中，其中藻粉與甲醇溶液的質(zhì)量與體積比 1 :30-70，磁力攪拌30 min-180 min，使其混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后，在轉(zhuǎn)速 12000 r/ min下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)提取3次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗提液；用稀硫酸調(diào)其PH值至3-4后靜置1 h，在轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心20 min，得到淺黃色上清液或無(wú)色透明液體；上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后加入5%稀氨水，調(diào)其pH值至7-8 ；然后在1 X IO5 Pa條件下滅菌15 min,得到含MC-LR的粗提液。3 ) MC-LR的提純方法
依次用適量100%甲醇和超純水活化C18固相萃取柱，體積比為1:1，接著將含MC-LR 的粗提液以流速4 mL/min經(jīng)C18固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮；然后用10-40%的甲醇溶液淋洗C18固相萃取柱；C18固相萃取柱未干時(shí)再用40-100%甲醇溶液洗脫吸附在固相上的 MC-LR，將洗脫液收集于收集瓶中用氮?dú)獯蹈桑尤ルx子水溶解殘留的固體并稀釋至所需體積；再經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后，即得到MC-LR純品。本發(fā)明的特點(diǎn)解決了傳統(tǒng)研究過(guò)程中MC-LR樣品缺乏，從國(guó)外進(jìn)口價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)室研究成本較高的難題。為從事MC-LR研究提供了一種從太湖新鮮藍(lán)藻中快速、經(jīng)濟(jì)提取MC-LR的方法。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的取1 g藻粉投加到30-70 mL、10%_80%的甲醇溶液中，攪拌30 min-180 min，使其充分混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后在轉(zhuǎn)速 12000 r/min下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)以上步驟2次(共3次)，合并上清液， 同時(shí)棄去殘?jiān)?；然后將上清液?5°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除其中的甲醇，得到含MC-LR的粗提液；用稀硫酸調(diào)其PH值至3-4后靜置1 h，溶液中出現(xiàn)大量絮狀沉淀時(shí)，在轉(zhuǎn)速12000 r/ min下離心20 min，得到淺黃色上清液或無(wú)色透明液；上清液經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾后用5% 稀氨水調(diào)PH值至7-8，在IXlO5 1 條件下滅菌15 min。然后，依次用10 mL 100%甲醇、 超純水活化C18固相萃取柱，將稀釋后的含MC-LR的粗提液以流速4 mL/min經(jīng)C18固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮；再依次用5 mL 20%,30%,40%的甲醇溶液淋洗C18固相萃取柱；萃取柱未干時(shí)用15 mL 40-100%的甲醇溶液洗脫吸附在固相上的MC-LR，將洗脫液收集后用氮?dú)獯蹈?，加去離子水溶解殘留的固體，并稀釋至5 mL ；經(jīng)0.45 μ m濾膜過(guò)濾后，即得到純度為 85%左右的MC-LR。以甲醇與磷酸鹽緩沖溶液的混合液(體積比57 :43)為流動(dòng)相，在色譜柱溫度為40°C，流速1 mL/min，紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器波長(zhǎng)238 nm的條件下，測(cè)定樣品的含量及純度。下面結(jié)合5個(gè)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述 實(shí)施例1
提取液濃度對(duì)MC-LR提取的影響
(1)分別稱取1 g藻粉加入50 mL純水、20%、40%、60%和80%甲醇溶液中，共五組，攪拌120 min，使其充分混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后在轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)以上步驟2次，合并上清液，同時(shí)棄去殘?jiān)?；將上清液?5°C 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除其中的甲醇，得到粗提液；用稀硫酸調(diào)其PH值至3-4后靜置1 h，溶液中出現(xiàn)大量絮狀沉淀時(shí)，在轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心20 min，得到淺黃色上清液或無(wú)色透明液；上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后用5%稀氨水調(diào)pH值至7_8 ；在1 X IO5 Pa條件下滅菌 15 min，得到含MC-LR的粗提液。(2)依次用10 mL 100%甲醇、超純水活化C18固相萃取柱，將稀釋后的粗提液以流速4 mL/min經(jīng)C18固相萃取柱，進(jìn)行富集濃縮；接著用5 mL 20%和30%甲醇溶液依次淋洗C18固相萃取柱，并用氮?dú)獯蹈珊笥? mL 40%甲醇溶液進(jìn)一步淋洗；待萃取柱未干時(shí)用 15 mL 80%的甲醇溶液洗脫吸附在固相上的MC-LR，將洗脫液收集后用氮?dú)獯蹈?，加去離子水溶解殘留的固體并稀釋至5 mL ；再經(jīng)0.45 ym濾膜過(guò)濾后，即得到純度為83%的MC-LR。(3)將甲醇與磷酸鹽緩沖溶液按體積比(57 :43)混合，作為流動(dòng)相，在色譜柱溫度為40°C，流速1 mL/min，紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器波長(zhǎng)238 nm的條件下，測(cè)定5組樣品中MC-LR 的含量。當(dāng)提取液為純水時(shí)，能夠提取出MC-LR為168. 53 μ g/g干藻粉；當(dāng)甲醇濃度為20% 時(shí)，能夠提取出MC-LR為196.02 μ g/g干藻粉；當(dāng)甲醇濃度為40%時(shí)，能夠提取出MC-LR為 237. 58 μ g/g干藻粉；當(dāng)甲醇溶液的濃度為60%時(shí)，MC-LR的提取回收率最大，達(dá)到四3. 89 μ g/g干藻粉；當(dāng)甲醇濃度為80%時(shí)，能夠提取出MC-LR僅為122. 8 μ g/g干藻粉。實(shí)施例2
提取時(shí)間對(duì)MC-LR提取的影響
分別稱取1 g藻粉加入5組相同的50 mL 60%甲醇溶液中，攪拌時(shí)間分別為30 min、 45 min,60 min、120 min和180 min，使其充分混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后在轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)以上步驟2次，合并上清液，棄去殘?jiān)?；以下同?shí)施例1的步驟(2)、(3)。當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，能夠提取出MC-LR為69. 73 μ g/g干藻粉；當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)，能夠提取出MC-LR為106. 13 μ g/g干藻粉；當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，能夠提取出MC-LR為181. 35 μ g/g干藻粉；當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)， MC-LR的提取回收率最大，達(dá)到341. 44 μ g/g干藻粉，且純度達(dá)到88% ；當(dāng)提取時(shí)間為180 min時(shí)，能夠提取出MC-LR為302. 62 μ g/g干藻粉。實(shí)施例3
提取液用量對(duì)MC-LR提取的影響
分別稱取1 g藻粉加入30 mL、40 mL、50 mL、60 mL和70 mL的60%甲醇溶液中，置于磁力攪拌器上攪拌120 min，使其混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后在轉(zhuǎn)速12000 r/min 下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)以上步驟2次，合并上清液，同時(shí)棄去殘?jiān)?；以下同?shí)施例1的步驟(2)、(3)。當(dāng)提取液用量為30 mL時(shí)，能夠提取出MC-LR為210. 32 μ g/g 干藻粉；當(dāng)提取液用量為40 mL時(shí)，能夠提取出MC-LR為304. 99 μ g/g干藻粉；當(dāng)提取液用量為50 mL時(shí)，MC-LR的提取回收率最大，達(dá)到331. 6 μ g/g干藻粉，且純度達(dá)到86% ；當(dāng)提取液用量為60 mL時(shí)，能夠提取出MC-LR為四5. 89 μ g/g干藻粉；當(dāng)提取液用量為70 mL 時(shí)，能夠提取出MC-LR為301. 14 μ g/g干藻粉。實(shí)施例4
淋洗液濃度對(duì)MC-LR提取的影響分別稱取1 g藻粉加入50 mL 60%甲醇溶液中，共5組，置于磁力攪拌器上攪拌120 min，使其混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后在轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)以上步驟2次，合并上清液，同時(shí)棄去殘?jiān)?；以下同?shí)施例1的步驟 (2)。首先依次用10 mL 100%甲醇、10 mL超純水活化C18固相萃取柱，將稀釋后的粗提液以流速4 mL/min流經(jīng)C18固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮；前四組分別用15 mL 20%甲醇溶液、 30%甲醇溶液、40%甲醇溶液、50%甲醇溶液淋洗C18固相萃取柱，第5組依次用5 mL 20%、 30%、40%的甲醇溶液梯度淋洗C18固相萃取柱，以下提純步驟同實(shí)施例1的步驟(3)。當(dāng)使用20%、30%、40%的甲醇溶液梯度淋洗時(shí)，MC-LR的提取回收率最大，達(dá)到323. 75 μ g/g干藻粉，且純度達(dá)到86% ；當(dāng)使用20%的甲醇溶液淋洗固相萃取柱時(shí)，能夠獲得MC-LR為218. 26 μ g/g干藻粉；當(dāng)使用30%的甲醇溶液淋洗固相萃取柱時(shí)，能夠獲得MC-LR為211. 39 μ g/g 干藻粉；當(dāng)使用40%的甲醇溶液淋洗固相萃取柱時(shí)，能夠獲得MC-LR為167. 14 μ g/g干藻粉；當(dāng)使用50%的甲醇溶液淋洗固相萃取柱時(shí)，能夠獲得MC-LR僅為32. 77 μ g/g干藻粉。
實(shí)施例5
洗脫液濃度對(duì)MC-LR提取的影響
分別稱取1 g藻粉加入50 mL 60%甲醇溶液中，共7組，置于磁力攪拌器上攪拌120 min，使其混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后在轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)以上步驟2次，合并上清液，棄去殘?jiān)灰韵虏襟E同實(shí)施例1的步驟 (2)、(3)。待C18固相萃取柱活化后，粗提液的富集濃縮步驟同實(shí)施例1的步驟(2)，然后分別用15 mL 40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫，以下步驟同實(shí)施例1的步驟(3)。當(dāng)洗脫液濃度為40%的甲醇溶液時(shí)，能夠得到MC-LR為80. 97 μ g/g干藻粉；當(dāng)洗脫液濃度為50%的甲醇溶液時(shí)，能夠得到MC-LR為74. 38 μ g/g干藻粉；當(dāng)洗脫液濃度為60%的甲醇溶液時(shí)，能夠得到MC-LR為67. 78 μ g/g干藻粉；當(dāng)洗脫液濃度為70% 的甲醇溶液時(shí)，能夠得到MC-LR為153. 35 μ g/g干藻粉；當(dāng)以80%的甲醇溶液作為洗脫液， MC-LR的提取回收率最大，達(dá)到316. 37 μ g/g干藻粉，且純度達(dá)到85% ；當(dāng)洗脫液濃度為90% 的甲醇溶液時(shí)，能夠得到MC-LR為沈8. 22 μ g/g干藻粉；當(dāng)洗脫液濃度為100%的甲醇溶液時(shí)，能夠得到MC-LR為319. 99 μ g/g干藻粉。
權(quán)利要求
1.從太湖藍(lán)藻中提取微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行1)藻粉的制備方法直接從水面上撈取新鮮藍(lán)藻，用60-100目篩網(wǎng)過(guò)濾后，得到新鮮藻泥，將藻泥置于陽(yáng)光下暴曬干燥后磨碎，用60目篩網(wǎng)分篩得粉狀藻粉，將收集的藻粉密封保存于冰箱中備用；2)MC-LR的提取方法稱取藻粉加入質(zhì)量濃度為10-80%甲醇溶液中，其中藻粉與甲醇溶液的質(zhì)量與體積比 1 :30-70，磁力攪拌30 min-180 min，使其混合成藻漿溶液，經(jīng)超聲振蕩20 min后，在轉(zhuǎn)速 12000 r/ min下離心15 min，取上清液，并將殘?jiān)貜?fù)提取3次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗提液；用稀硫酸調(diào)其PH值至3-4后靜置1 h，在轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心20 min,得到淺黃色上清液或無(wú)色透明液體；上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后加入5%稀氨水，調(diào)其pH值至7-8 ；然后在1 X IO5 Pa條件下滅菌15 min,得到含MC-LR的粗提液；3)MC-LR的提純方法依次用適量100%甲醇和超純水活化C18固相萃取柱，體積比為1:1，接著將含MC-LR 的粗提液以流速4 mL/min經(jīng)C18固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮；然后用10-40%的甲醇溶液淋洗C18固相萃取柱；C18固相萃取柱未干時(shí)再用40-100%甲醇溶液洗脫吸附在固相上的 MC-LR，將洗脫液收集于收集瓶中用氮?dú)獯蹈桑尤ルx子水溶解殘留的固體并稀釋至所需體積；再經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后，即得到MC-LR純品。
全文摘要
本發(fā)明屬于水處理應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種從太湖藍(lán)藻中提取微囊藻毒素-LR的方法。以太湖新鮮藍(lán)藻為原材料，從中提取MC-LR的方法。主要包括藍(lán)藻粉的制備，MC-LR的提取及提純?nèi)齻€(gè)部分。采用一種以甲醇溶液為提取液，C18固相萃取柱為提純工作站的MC-LR提取提純方法，從而得到較高回收率的MC-LR純品。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)研究過(guò)程中MC-LR樣品缺乏，從國(guó)外進(jìn)口價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)室研究成本較高的難題。為從事MC-LR研究提供了一種從太湖新鮮藍(lán)藻中快速、經(jīng)濟(jì)提取MC-LR的方法。
文檔編號(hào)C07K14/405GK102153635SQ201110003498
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者姚立榮, 張文藝, 李秋艷, 范培成, 邱小蘭 申請(qǐng)人:常州大學(xué)