專利名稱：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體融合蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體融合蛋白及其制備和其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康與生命的疾病，腫瘤的治療已經(jīng)成為日益迫切需要解決的重大公共衛(wèi)生問題。近年來盡管抗腫瘤藥物研究已經(jīng)有了很大的發(fā)展，但仍存在著針對(duì)性差，對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生殺傷作用等缺陷，使之應(yīng)用受到很大限制。因此，研制靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的基因工程藥物仍具有重大的社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益。1995 年，Wiley SR 等報(bào)道從人表達(dá)標(biāo)簽序列文庫(EST，expressedsequence tag) 中篩選到一種編碼抗腫瘤蛋白的基因，該基因編碼的蛋白稱為腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體 (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又禾爾 周亡素 2 配體(Apo2L)，屬于腫瘤壞死因子超家族(Wiley SR, et al. , Immunity 3:673-682,1995)。 TRAIL與DR4或DR5受體結(jié)合后，DR4和DR5的死亡結(jié)構(gòu)域傳導(dǎo)凋亡的信號(hào)通過FADD和依賴caspase 8機(jī)制在細(xì)胞內(nèi)途徑和細(xì)胞外途徑實(shí)現(xiàn)的。TRAIL對(duì)于大多數(shù)惡性腫瘤有抑制細(xì)胞生長和細(xì)胞毒效應(yīng)，而人體的正常細(xì)胞則對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡耐受(Ashkenazi A，et al. ,JClin Invest 104 155-162，1999)。因其特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒有顯著細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，因此TRAIL在腫瘤治療中具有良好的前景，自發(fā)現(xiàn)以來一直被作為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。TRAIL雖然在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)以及臨床實(shí)驗(yàn)中均顯示了很顯著的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，但是半衰期比較短，人體內(nèi)半衰期僅有40分鐘，嚴(yán)重影響了 TRAIL蛋白在體內(nèi)的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種TRAIL融合蛋白，此種融合蛋白可以顯著的增加蛋白穩(wěn)定性以及延長在動(dòng)物體內(nèi)半衰期，顯著的提高治療效果。本發(fā)明提供的TRAIL融合蛋白包括(1)包含至少二個(gè)半胱氨酸的交聯(lián)區(qū)；(2)人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域；(3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段。TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體)是一種在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)被熟知的蛋白。TRAIL核苷酸序列GenBank登錄號(hào)NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作為死亡受體 DR4 (TRAIL-RI)和死亡受體DR5 (TRAIL-RII)的配體，與其結(jié)合誘導(dǎo)凋亡或細(xì)胞死亡。人源 TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示，其胞外區(qū)是從N端開始的第41位至第位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示.依照本發(fā)明，一種TRAIL融合蛋白從N端至C端具有如下序列(1)交聯(lián)區(qū)，其中包括至少二個(gè)半胱氨酸可以形成分子間二硫鍵；( 人源亮氨酸拉鏈序列；C3)根據(jù)情況可有一不多于10個(gè)氨基酸的連接區(qū)；(4)人源TRAIL多肽或其胞外區(qū)，可以與死亡受體DR4 (TRAIL-RI)或者死亡受體 DR5 (TRAIL-RII)相結(jié)合?；诒景l(fā)明的目的，融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全長或者部分片段，長度足以與死亡受體DR4 (TRAIL-RI)和死亡受體DR5 (TRAIL-RII)結(jié)合。優(yōu)選的是融合蛋白中的TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外區(qū)，包含天然人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的全長或者部分片段。更加優(yōu)選的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一種TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL蛋白胞外區(qū)的全長或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID NO 3所示氨基酸序列。作為優(yōu)選，所述交聯(lián)區(qū)為不少于3個(gè)但不多于30個(gè)氨基酸的氨基酸序列，更優(yōu)選地，所述交聯(lián)區(qū)含有不多于10個(gè)氨基酸的人源氨基酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，其中所述交聯(lián)區(qū)含有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。作為優(yōu)選，其中所述人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薱-fos，c-jun, c-myc, max、mdxl 或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，其中所述人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域含有如SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列。在一種實(shí)施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。本發(fā)明也提供了包含3個(gè)融合蛋白分子的寡聚體，這種寡聚體的形成是通過融合蛋白中的二硫鍵以及亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域進(jìn)行加強(qiáng)的。本發(fā)明也涵蓋了編碼融合蛋白的DNA分子。在一種實(shí)施方案中，所述DNA分子含有SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，受轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控的編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)的表達(dá)盒以及重組了編碼所述融合蛋白DNA分子的表達(dá)載體。作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體為質(zhì)?；虿《尽４送?，本發(fā)明進(jìn)一步提供了重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子以及表達(dá)所述的融合蛋白的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母或者細(xì)菌。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體提供一種重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的大腸桿菌，所述大腸桿菌于2010年5月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3837。另外，本發(fā)明也提供了所述融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟含有編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)所述融合蛋白以及分離所述融合蛋白。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了所述的融合蛋白的應(yīng)用，即生產(chǎn)用于治療一種疾病的藥物，例如，由不可控制的細(xì)胞生長導(dǎo)致的人類疾病如，腫瘤，銀屑病，自身免疫性疾病寸。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，人源TRAIL蛋白對(duì)照組對(duì)腫瘤的抑制率為80. 34%，而本發(fā)明所述融合蛋白組腫瘤完全消失，且裸鼠狀態(tài)明顯好于給予人源TRAIL蛋白的陽性對(duì)照組，表明與TRAIL相比，本發(fā)明所述融合蛋白毒性更低。另外，本發(fā)明所述融合蛋白的體內(nèi)半衰期為 218分鐘。人源TRAIL蛋白的體內(nèi)半衰期為42分鐘，本發(fā)明所述融合蛋白的體內(nèi)半衰期大約是TRAIL的5倍左右。生物保藏說明分類命名大腸埃希氏菌，Escherichia coli.于2010年5月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3837。


圖1顯示的是融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。A-交聯(lián)區(qū)B-人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域C-連接區(qū)D-TRAIL 胞外區(qū)圖2顯示的是LZ-TRAIL蛋白的表達(dá)與純化的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。泳道1 未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解物；泳道2 ImM IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞裂解物；泳道3 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道4 金屬親和層析純化后的LZ-TRAIL蛋白；泳道5 離子交換層析純化后的LZ-TRAIL蛋白。箭頭所示為目標(biāo)蛋白。圖3顯示乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的腫瘤生長曲線。圖4顯示乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的體重變化曲線。圖5顯示的是人源TRAIL蛋白給藥后小鼠體內(nèi)血藥濃度變化曲線。圖6顯示的是本發(fā)明所述融合蛋白給藥后小鼠體內(nèi)血藥濃度變化曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體融合蛋白、編碼該融合蛋白的 DNA、表達(dá)載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其制備方法和其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明，一種TRAIL融合蛋白從N端至C端具有如下序列(1)交聯(lián)區(qū)，其中包括至少二個(gè)半胱氨酸可以形成分子間二硫鍵；( 人源亮氨酸拉鏈序列；C3)根據(jù)情況可有一不多于10個(gè)氨基酸的連接區(qū)；(4)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL 蛋白胞外區(qū)的片段，可以與死亡受體DR4(TRAIL-RI)或者死亡受體DR5 (TRAIL-RII)相結(jié)
口 O亮氨酸拉鏈(leucine zipper)是一種可以自發(fā)形成多聚體的結(jié)構(gòu)域，存在于多種天然蛋白中。此類結(jié)構(gòu)一般呈卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，通過特征α-螺旋的相互作用自發(fā)形成多聚體。例如 Haudenschild 等人(Haudenschild DR, et al.，J Biol Chem 270 :23150-23154, 1995)描述一種結(jié)締組織蛋白martrilin，又稱為軟骨基質(zhì)蛋白(CMP)，其三個(gè)蛋白分子在C 端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的作用下，形成同源三聚體。分子間二硫鍵的形成可以進(jìn)一步穩(wěn)定這種三聚體的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述融合蛋白中的人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可以來源于任何人源蛋白。在本技術(shù)領(lǐng)域中已為人所熟知的是，在多種天然蛋白中發(fā)現(xiàn)有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的存在。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可以相互作用形成二體或者三體。因此，本發(fā)明所述融合蛋白中包含的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)融合蛋白的寡聚化因而能夠增加穩(wěn)定性。優(yōu)選的是選擇可以促進(jìn)融合蛋白形成三聚體的人源亮氨酸拉鏈。適合的人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域例如人c-f0S，C-jim， C-myC，maX和mdxl蛋白所含有的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的是來自人matrilin蛋白的人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白中的人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域含有如SEQ IDD NO :2所述的氨基酸序列。交聯(lián)區(qū)可以是包括不少于3個(gè)但不多于30個(gè)氨基酸的氨基酸序列。上述氨基酸序列至少含有二個(gè)半胱氨酸可以形成分子間二硫鍵。交聯(lián)區(qū)至少含有二個(gè)半胱氨酸可以形成分子間二硫鍵，這一點(diǎn)對(duì)進(jìn)一步穩(wěn)定本發(fā)明所述融合蛋白的寡聚體，優(yōu)選的是三聚體，是至關(guān)重要的。優(yōu)選的是交聯(lián)區(qū)含有大約3至20個(gè)氨基酸，更加優(yōu)選的是含有大約3至10 個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白交聯(lián)區(qū)含有如SEQ IDD NO :1所述的氨基酸序列。本發(fā)明所述融合蛋白的各部分氨基酸序列可以直接由肽鍵連接到一起。視需要而定，連接區(qū)可以有2至10個(gè)氨基酸連接亮氨酸拉鏈與人源TRAIL多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中， 連接區(qū)有兩個(gè)氨基酸甘氨酸-絲氨酸_。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO 4所述的氨基酸序列。另外，本發(fā)明也提供了包含3個(gè)本發(fā)明所述的融合蛋白結(jié)合形成的寡聚體。寡聚體的形成是依賴人源TRAIL多肽的三聚化，以及通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的分子間相互作用和交聯(lián)區(qū)形成的分子間二硫鍵得到加強(qiáng)。在寡聚體中的融合蛋白的穩(wěn)定性和半衰期都有所加強(qiáng)。本發(fā)明的另一方面也提供了編碼本發(fā)明上述的融合蛋白的DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼含有如SEQ IDD NO :4所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子含有如SEQ IDD NO :5所述的核苷酸序列。為了生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白和寡聚體，編碼融合蛋白的DNA分子被整合至表達(dá)盒中，隨后表達(dá)盒被插入合適的表達(dá)載體。然后，這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動(dòng)物用于重組蛋白表達(dá)。表達(dá)盒至少包括以下幾個(gè)內(nèi)容(1)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，( 編碼本發(fā)明所述融合蛋白的 DNA分子，該轉(zhuǎn)錄是在在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的調(diào)控下進(jìn)行的，以及C3)轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。根據(jù)用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞的不同，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄中止區(qū)可以是天然存在或者人工構(gòu)建的序列， 該序列適合于真核或者原核細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄。此類序列在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄起始序列的DNA片與適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄中止區(qū)的DNA片段與編碼融合蛋白的 DNA片段相連接。這種連接方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知，比如，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切以及連接。表達(dá)盒可以被整合插入表達(dá)載體，隨后這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動(dòng)物。 一般情況下，表達(dá)載體還要包括復(fù)制起始序列，以及篩選標(biāo)記，例如，對(duì)于細(xì)菌的蛋白表達(dá)， 質(zhì)粒是一種很有用途的載體。本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)有很多種為人所熟知的可以用于此目的的質(zhì)粒載體，包括，但是不僅限于，pET25b，pETMb等等。如果通過酵母細(xì)胞來重組表達(dá)融合蛋白， 酵母表達(dá)載體，比如PPIC9，pA0815, pPICZ等等，可以作為表達(dá)載體。如果通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞來進(jìn)行蛋白表達(dá)，也有很多合適的重組蛋白表達(dá)載體。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白的表達(dá)載體包含的DNA序列，需要適合以同源重組方式整合插入宿主細(xì)胞染色體。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，比如PCDNA3. 1，pSI等等。對(duì)于通過動(dòng)物來表達(dá)融合蛋白，用于生產(chǎn)含有表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等)的技術(shù)手段，在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。比如 PBLG等等，可以作為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的載體。獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下表達(dá)出融合蛋白。通過其理化性質(zhì)和其它特性的差別運(yùn)用各種分離方法分離純化融合蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如常規(guī)的變性復(fù)性處理、離心、超聲破碎、超濾膜過濾、金屬親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、透析、高效液相層析等常規(guī)純化方法及這些方法的結(jié)合。下面將結(jié)合最佳實(shí)施例的詳細(xì)描述和附圖，進(jìn)一步說明本發(fā)明前述的和其他的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)。實(shí)施例1.構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體以上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成的亮氨酸拉鏈(LZ，包含交聯(lián)區(qū)與人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域)片段為模板，通過PCR方法擴(kuò)增出所需的DNA片段，所用引物L(fēng)Zl和LZ2 由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。其中引物L(fēng)Z2除含有LZ片段的3’末端序列，還在其3’末端后加入編碼GlySer接頭肽的序列。LZl :5’ CATGCCATGGCCCATATGGAGGAAGACCCGTGTGCLZ2 :5’ CGGGATCCGACAACTGTGTTCTCCAGGATGTRAIL片段是截取TRAIL全序列第95 281位氨基酸，用PCR方法從人胎肝庫 cDNA 文庫(購自 Clontech Lanoratories Inc. USA)擴(kuò)增，所用引物 TRAILl 和 TRAIL2 由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。經(jīng)序列分析，所得DNA序列與GenBank登記的序列 (NM_003810)所顯示的TRAIL編碼序列一致，即獲得了 TRAIL的DNA序列。TRAILl :5’ CGGGATCCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTRAIL2 :5’ GGGAATTCTCATTAGCCAACTAAAAAGGCCCC以NdeI和BamHI酶切LZ片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(工具酶皆購自Takara公司)，以 BamHI和EcoRI酶切TRAIL序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以NdeI和EcoRI酶切pET25b空質(zhì)粒(購自 Novage公司)。上述酶切片段均以瓊脂糖凝膠回收相應(yīng)大小的片段，用T4DNA連接酶連接各片段，所得的重組質(zhì)粒即為TRAIL融合蛋白的表達(dá)載體，命名為pET-LZ-TRAIL。融合蛋白結(jié)構(gòu)如圖1所示。按常規(guī)方法將上述獲得的pET-LZ-TRAIL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，[基因型F-omp T hsd SB (rB-mB-) gal dcm IacYl (DE3) pRARE (argU, argff, ileX, glyT, leuff, proL) (Cmr)](購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，從氨芐抗性菌落中分離質(zhì)粒DNA，酶切鑒定， 測(cè)序確認(rèn)，所得的陽性克隆即為表達(dá)相應(yīng)蛋白的工程菌。實(shí)施例2:制備融合蛋白將重組質(zhì)粒pET-LZ-TRAIL轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Rosetta克隆加在含LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(37°C )，待細(xì)菌密度達(dá)到0D600 0. 8，向培養(yǎng)基中加入ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。約6個(gè)小時(shí)后，以5，000Xg(30分鐘)收獲菌體。將收獲的菌體重懸于Tris緩沖液(ρΗ8. 0)中，超聲破碎菌體。破菌后以10，OOOXg 離心30分鐘收集上清。將如上方法獲得的破碎上清上樣于Ni sepharose 6 Fast flow (GE 公司)進(jìn)行金屬親和層析，40mM咪唑洗脫雜蛋白，再以120mM咪唑洗脫重組蛋白。洗脫液再過Qi^pharose Fast flow (GE公司)進(jìn)行離子交換層析進(jìn)一步純化，即可得到高純度的重組蛋白。結(jié)果見圖2。實(shí)施例3 體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)皮下接種乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231建立裸鼠荷瘤模型，模型建立后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組(人源TRAIL蛋白的胞外區(qū)，其氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示)與試驗(yàn)組(LZ-TRAIL)。每組6只裸鼠，腫瘤組織接種后長至0. Icm3每天皮下給藥，按等摩爾劑量給藥，給藥劑量分別為300ug/只/次(TRAIL)以及450ug/只/次(LZ-TRAIL)， 共給藥14次。停藥后觀察6天，處死裸鼠，剝離腫瘤稱重，計(jì)算每組平均瘤種和抑瘤率。抑瘤率以下式計(jì)算。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，包括(1)包含至少二個(gè)半胱氨酸的交聯(lián)區(qū)；(2)人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域；⑶人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白還包含由不多于10個(gè)氨基酸組成的連接區(qū)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述交聯(lián)區(qū)為不少于3個(gè)但不多于 30個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述交聯(lián)區(qū)含有不多于10個(gè)氨基酸的人源氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述交聯(lián)區(qū)含有如SEQID NO 1的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)槿薱-fos，c-jun，c-myc, max、mdxl或人matrilin蛋白含有的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。
7.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域含有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
9.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述融合蛋白含有如SEQID NO 4的氨基酸序列。
10.一種寡聚體，其特征在于，該寡聚體是由三個(gè)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述融合蛋白形成。
11.編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的DNA序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的DNA序列，其特征在于，含有如SEQID NO 5所示的核苷酸序列。
13.—種表達(dá)盒，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；受轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控的編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的DNA分子；以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。
14.重組了編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白DNA分子的表達(dá)載體。
15.如權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒或病毒。
16.重組了編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的DNA分子的細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母菌或細(xì)菌。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞屬大腸桿菌，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3837。
19.一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其特征在于，轉(zhuǎn)染了編碼權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的 DNA分子且表達(dá)所述融合蛋白。
20.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白的制備方法，包括提供權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)所述細(xì)胞或權(quán)利要求19所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物； 使細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)所述融合蛋白；以及分離所述融合蛋白。
21.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述融合蛋白在制造治療細(xì)胞過度增生導(dǎo)致的疾病或免疫系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
22.如權(quán)利要求21所述的用途，其特征在于，所述疾病為癌癥或自身免疫性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體融合蛋白、編碼該融合蛋白的DNA序列、含有該DNA序列的載體、含該載體的宿主細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、該融合蛋白的制備方法以及該融合蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明所述TRAIL融合蛋白從N端至C端包括交聯(lián)區(qū)、人源亮氨酸拉鏈序列以及人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段，可以顯著增加穩(wěn)定性以及延長在動(dòng)物體內(nèi)半衰期，顯著的提高治療效果，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102250254SQ20101017603
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者周兵, 周宇, 姜靜 申請(qǐng)人:江蘇先聲藥物研究有限公司