專(zhuān)利名稱(chēng)：獲得純化的生物活性異源蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離和/或純化雜質(zhì)，產(chǎn)生不含相關(guān)雜質(zhì)或僅含實(shí)質(zhì)上最低限度量 的糖基化雜質(zhì)的純化的異源蛋白產(chǎn)品的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及胰島素類(lèi)似物例 如甘精胰島素糖基化形式雜質(zhì)的鑒別，其特征為在基于酵母的系統(tǒng)例如畢赤酵母屬中表 達(dá)后鑒別。本發(fā)明還涉及克隆編碼蛋白甘精胰島素的基因，將相關(guān)基因插入到適當(dāng)?shù)慕?母宿主中；產(chǎn)生重組菌株的培養(yǎng)物，刺激異源多肽的表達(dá)、分泌和發(fā)酵后的純化，以及 有關(guān)的酶轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
重組形式的胰島素、胰島素類(lèi)似物和/或衍生物已在多種微生物表達(dá)系統(tǒng)中生 產(chǎn)。當(dāng)前的生物體例如大腸桿菌、釀酒酵母已被用于重組人胰島素或其衍生物的商業(yè)化 生產(chǎn)。由于這些系統(tǒng)的某些缺點(diǎn)，例如低表達(dá)水平、下游純化的困難等，使用甲醇營(yíng)養(yǎng) 型酵母巴斯德畢赤酵母作為蛋白表達(dá)系統(tǒng)是有利的，該表達(dá)系統(tǒng)具有某些優(yōu)點(diǎn)，例如高 表達(dá)、簡(jiǎn)單加工、低生產(chǎn)成本、高密度培養(yǎng)(US6800606)。酵母表達(dá)系統(tǒng)是普遍使用的，因?yàn)槠湟子谏L(zhǎng)，快速并且是大小可變的。然 而，某些酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生不一致的結(jié)果，并且有時(shí)難以獲得高產(chǎn)率。一種顯示最有希 望的酵母表達(dá)系統(tǒng)是甲醇營(yíng)養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母。與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母 具有許多優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠錄](méi)有與細(xì)菌相關(guān)的內(nèi)毒素問(wèn)題或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)蛋白的病 毒污染問(wèn)題(Cino，Am Biotech Lab, May 1999)。畢赤酵母的高生長(zhǎng)速率使其易于放大 至大規(guī)模生產(chǎn)，盡管擴(kuò)大規(guī)模的挑戰(zhàn)包括pH控制、氧限制、營(yíng)養(yǎng)限制、溫度波動(dòng)和其他 安全性考慮(Gottschalk，2003，BioProcess Intl 1 (4) 54-61 ； Cino Am Biotech Lab, May 1999)。雖然基于酵母的表達(dá)系統(tǒng)例如巴斯德畢赤酵母有很多優(yōu)點(diǎn)，但該系統(tǒng)的一 個(gè)主要缺點(diǎn)是所得蛋白的翻譯后修飾，其后作為雜質(zhì)存在于最終產(chǎn)品中并且難以純 化。盡管已知許多蛋白的翻譯后修飾，最常見(jiàn)翻譯后修飾的形式是糖基化(Hart G.W， Glycosylation，Curr.Opin.Cell.Biol 1992 ； 4 1017)。糖基化可以是 N 連接或 O 連接的， 取決于表達(dá)系統(tǒng)(Gemmill TR 等，Overview of N- and 0~ linked oligosaccharide structures found in various yeast species, Biochemica et Biophysica Acta, 1999 ； 1426 227)。 糖 基化影響蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性、免疫原性、清除率、蛋白水解的保護(hù)，并且改善蛋白的溶 角軍性(Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006; 24: 769)。盡管在生物技術(shù)制造業(yè)改進(jìn)方面已經(jīng)有了很大發(fā)展，還沒(méi)有對(duì)每種蛋白通用的 解決方案。為了解決對(duì)該蛋白或蛋白家族特異性的問(wèn)題，特定的治療性蛋白的制備方法 需要新穎的和創(chuàng)新的方案。同樣，成功的商業(yè)化應(yīng)用通常依賴(lài)于蛋白或蛋白家族的特性 組合，以及用于將該蛋白或蛋白家族制備成藥品的生產(chǎn)方法。本發(fā)明涉及胰島素類(lèi)似物、更具體為甘精胰島素不同糖基化形式的鑒定，其通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)偶聯(lián)的化學(xué)方法(例如電噴霧和基質(zhì)輔助激光解析電離)鑒定。對(duì)最終產(chǎn)品 中雜質(zhì)性質(zhì)的更好了解使本發(fā)明能夠通過(guò)優(yōu)化的下游純化方法從上述雜質(zhì)中選擇性純化 產(chǎn)品，由此純化的終產(chǎn)品將基本不含本發(fā)明所述的雜質(zhì)。US 4,444,683及其相關(guān)申請(qǐng)要求保護(hù)糖基化的胰島素，其中葡萄糖或甘露糖通過(guò) 衍生自二羧酸、酸酐或苯胺或其組合的空間基團(tuán)與胰島素偶聯(lián)。WO 90/10645特別要求保護(hù)含有一個(gè)或多個(gè)單糖基團(tuán)或一個(gè)或多個(gè)具有多達(dá)3 個(gè)糖單元的寡糖基團(tuán)的糖基化胰島素。單糖基化或三糖基化胰島素位點(diǎn)為Al、Bl或 B29。WO 99/52934要求保護(hù)從非糖基化的蛋白中分離糖基化蛋白的方法，其通過(guò)使 用含Ca++的洗脫液色譜分離包含糖基化和非糖基化蛋白的溶液，獲得包含非糖基化蛋白 的組分，所述組分基本上不含糖基化蛋白。甘精胰島素的糖形式未公開(kāi)于任何前述現(xiàn)有技術(shù)中。本發(fā)明討論了通過(guò)基于酵 母的表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵后，純化具有少量所述特征性糖基化雜質(zhì)的胰島素類(lèi)似物例如甘精胰 島素以獲得100%純的甘精胰島素產(chǎn)品的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是開(kāi)發(fā)獲得在酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)的純化的、生物活性 的異源蛋白的方法，其特征在于所述純化的蛋白不含或含有實(shí)質(zhì)上最低限度量的糖基化 副產(chǎn)物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)獲得在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的純化的、生物活性的 異源蛋白的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)生產(chǎn)純化的、生物活性的異源蛋白的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是獲得純化的、生物活性的異源蛋白產(chǎn)品，其純度至少為 96%。本發(fā)明的再一個(gè)目的是獲得純化的、生物活性的異源蛋白產(chǎn)品，其純度在 97-100%之間。本發(fā)明的另一個(gè)目的是獲得純化的甘精胰島素，其純度至少為96%。本發(fā)明的又一個(gè)目的是獲得純化的甘精胰島素，其含有低于的糖基化雜質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是獲得不含糖基化雜質(zhì)的純化的甘精胰島素。本發(fā)明的另一個(gè)目的是獲得不含糖基化雜質(zhì)的純化的甘精胰島素，其中所述蛋 白的糖基化形式可以是單糖基化、三糖基化或多糖基化。因此，本發(fā)明涉及獲得在酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)的、純化的生物活性的異源 蛋白的方法，其特征在于所述蛋白不含或含有實(shí)質(zhì)上最低限度量的糖基化副產(chǎn)物；獲得 在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，該方法包括下列步驟 a)在適于該蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)用含有式I定義的編碼該異源蛋白的DNA序列的載 體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；b)收集表達(dá)的蛋白，包括從宿主細(xì)胞分離所述蛋白，產(chǎn)生收集的蛋 白；c)使步驟(b)中收集的蛋白結(jié)晶的步驟；d)在胰蛋白酶或類(lèi)胰蛋白酶存在下進(jìn)行酶 轉(zhuǎn)化的步驟；e)純化含有至少一種相關(guān)雜質(zhì)的所述蛋白，包括使所述蛋白混合物與色譜 基質(zhì)接觸，其中使用極性有機(jī)溶劑，在含有有機(jī)酸緩沖液的水相中純化；以及f)沉淀洗
5脫的蛋白；產(chǎn)生權(quán)利要求9的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，其包括a)用包含 指導(dǎo)所述蛋白表達(dá)的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化酵母株接種水性發(fā)酵培養(yǎng)基；以及b)在有效表達(dá)所 述蛋白的條件下，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化株；純化的、生物活性的異源蛋白，其 純度至少為96%;純化的、生物活性的異源蛋白，其純度范圍為97-100% ；純化的甘精 胰島素，其純度至少為96%;純化的甘精胰島素，其含有低于的糖基化雜質(zhì)；不含 糖基化雜質(zhì)的純化的甘精胰島素；以及純化的甘精胰島素，其中所述蛋白的糖基化形式 可以是單糖基化、三糖基化或多糖基化。


圖1 胰蛋白酶化的甘精胰島素的產(chǎn)率-時(shí)間(小時(shí))圖和不同濃度下的反應(yīng)。圖2:酶處理前后不同時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)分析色譜圖。圖3 胰島素-甘精胰島素的HPLC圖譜。圖4:分離雜質(zhì)與最終產(chǎn)品的保留時(shí)間比較。圖5 胰島素-甘精胰島素最終產(chǎn)品的RP-HPLC圖譜。圖6 胰島素-甘精胰島素最終產(chǎn)品的SEC-HPLC圖譜。圖7 甘精胰島素、單糖基化甘精胰島素(mGIG)和三糖基化甘精胰島素(tGIG) 的電噴霧離子化質(zhì)譜。圖8 單糖基化甘精胰島素(mGIG)的基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜。圖9 三糖基化甘精胰島素(tGIG)的基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及獲得在酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)的、純化的生物活性的異源蛋白的 方法，其特征在于所述蛋白不含或含有實(shí)質(zhì)上最低限度量的糖基化副產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA編碼異源性蛋白用式I表示X-B-Y-A其中X是包含至少一個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽序列；B是胰島素分子的B鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物；Y是包含至少兩個(gè)氨基酸的連接肽；A是胰島素分子的A鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物，并且A和B鏈可通過(guò) 氨基酸取代、缺失或添加進(jìn)行修飾。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接肽可以是包含至少兩個(gè)氨基酸的任何 序列，條件是開(kāi)頭兩個(gè)氨基酸為“RR”。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白由SEQID : 1或SEQ ID: 2定義。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，酵母表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞選自畢赤酵母屬。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，酵母表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞選自巴斯德畢赤酵 母、甲醇畢赤酵母、釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形漢森酵母、乳酸克 魯維酵母。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白的糖基化形式可以是單糖基化、三糖基化或多糖基化。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述純化的蛋白含有低于的糖基化雜質(zhì)。本發(fā)明還涉及獲得在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的純化的、生物活性的異源蛋白的方 法，該方法包括下列步驟a)在適于該蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)用含有式I定義的編碼該異源蛋白的DNA序 列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；b)收集表達(dá)的蛋白，包括從宿主細(xì)胞分離所述蛋白，產(chǎn)生收集的蛋白；c)使步驟(b)中收集的蛋白結(jié)晶的步驟；d)在胰蛋白酶或類(lèi)胰蛋白酶存在下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化的步驟；e)純化含有至少一種相關(guān)雜質(zhì)的所述蛋白，包括使所述蛋白混合物與色譜基質(zhì) 接觸，其中使用極性有機(jī)溶劑，在含有有機(jī)酸緩沖液的水相中純化；以及f)沉淀洗脫的蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA編碼異源性蛋白用式I表示X-B-Y-A其中X是包含至少一個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽序列；B是胰島素分子的B鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物；Y是包含至少兩個(gè)氨基酸的連接肽；A是胰島素分子的A鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物，并且A和B鏈可通過(guò) 氨基酸取代、缺失或添加進(jìn)行修飾。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接肽可以是包含至少兩個(gè)氨基酸的任何 序列，條件是開(kāi)頭兩個(gè)氨基酸為“RR”。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID: 1或2定義的基因與信號(hào)肽在框內(nèi)克隆。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID: 1或2定義的基因與mat-α-信號(hào)肽在 框內(nèi)克隆。 在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，酵母表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞選自畢赤酵母屬。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤 酵母、釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主菌株是GS115。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生純化的、生物活性的異源蛋白的方法，其包括a)用包含指導(dǎo)所述蛋白表達(dá)的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化酵母株接種水性發(fā)酵培養(yǎng)基；以 及b)在有效表達(dá)所述蛋白的條件下，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化株；本發(fā)明還涉及產(chǎn)生純化的、生物活性的異源蛋白的方法，其中使用離子交換色 譜從發(fā)酵液中捕獲表達(dá)的該蛋白。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括添加氯化鋅和苯酚結(jié)晶蛋白的步驟。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生純化的、生物活性的異源蛋白的方法，所述方法包括在胰蛋 白酶存在下在水可混溶有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶轉(zhuǎn)化步驟。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述水可混溶有機(jī)溶劑選自DMSO、DMF、乙
醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括含有至少一種相關(guān)雜質(zhì)的蛋白混 合物的RP-HPLC純化步驟，其通過(guò)使所述蛋白混合物與色譜樹(shù)脂基質(zhì)接觸進(jìn)行，其中使 用極性有機(jī)緩沖溶劑，在含有有機(jī)酸緩沖液的水相中純化。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述極性緩沖溶劑是乙腈。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸緩沖液選自檸檬酸、乙酸、硼酸、 甲酸、鹽酸和磷酸。本發(fā)明還涉及根據(jù)任一前述權(quán)利要求獲得的純化的、生物活性的異源蛋白產(chǎn) 品，其純度至少為96%。本發(fā)明還涉及純化的、生物活性的異源蛋白，其純度在97-100%之間。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，純化的甘精胰島素的純度至少為96%。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，純化的甘精胰島素含有低于的糖基化雜質(zhì)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，純化的甘精胰島素不含糖基化雜質(zhì)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，純化的甘精胰島素，其中所述蛋白的糖基化形 式可以是單糖基化、三糖基化或多糖基化。現(xiàn)在將對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)參考，與下述實(shí)施例一起，用于詮釋 本發(fā)明的原理。下述實(shí)施例用于幫助理解本發(fā)明，但不意味著以任何方式限制其范圍。實(shí)施例 不包括用于構(gòu)建載體、在所述載體中插入編碼多肽的基因或?qū)⑺觅|(zhì)粒導(dǎo)入宿主的常規(guī) 方法詳細(xì)描述。實(shí)施例也不包括用于測(cè)定由所述宿主載體系統(tǒng)產(chǎn)生的多肽的常規(guī)方法的 詳細(xì)描述。這些方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，描述于包括實(shí)施例方式的多 種出版物中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，獲得在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的純化的、生物活性的異 源蛋白的方法包括下列步驟a)在適于該蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)用含有SEQ ID 1或2定義的編碼該異源蛋白 的DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；b)收集表達(dá)的蛋白，包括從宿主細(xì)胞分離所述蛋白，產(chǎn)生收集的蛋白；c)使步驟(b)中收集的蛋白結(jié)晶的步驟；d)在胰蛋白酶或類(lèi)胰蛋白酶存在下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化的步驟；e)純化含有至少一種相關(guān)雜質(zhì)的所述蛋白，包括使所述蛋白混合物與色譜基質(zhì) 接觸，其中使用極性有機(jī)溶劑，在含有有機(jī)酸緩沖液的水相中純化；以及f)沉淀洗脫的蛋白。定義“細(xì)胞”或“細(xì)胞培養(yǎng)物”或“重組宿主細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”通常在根據(jù)上 下文清楚的情況下可交換地使用。這些術(shù)語(yǔ)包括表達(dá)本發(fā)明所需蛋白的直接對(duì)象細(xì)胞， 以及其子代。應(yīng)當(dāng)理解，由于偶然突變或環(huán)境差異，并非所有子代均確切地等同于母細(xì)胞。然而，所述改變的子代也包括在這些術(shù)語(yǔ)內(nèi)，只要該子代保留了原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞所具 有的相關(guān)性質(zhì)。本文所用術(shù)語(yǔ)“載體”是指能轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸分子的核酸分子。術(shù)語(yǔ) “表達(dá)載體”包括能合成由所述載體各自攜帶的重組基因編碼的對(duì)象蛋白的質(zhì)粒、粘粒
或噬菌體。優(yōu)選的載體是能自主復(fù)制和/表達(dá)其連接的核酸的那些。在本申請(qǐng)中，“質(zhì) ?！焙汀拜d體”可交換地使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。而且，本發(fā)明意圖包括 起等價(jià)功能的其他形式的表達(dá)載體，其在本領(lǐng)域中是已知的。本文所指具有甘精胰島素活性的多肽，例如甘精胰島素應(yīng)當(dāng)理解為具有通過(guò)重 組DNA技術(shù)產(chǎn)生的人胰島素結(jié)構(gòu)兩處變化的氨基酸序列在人胰島素A鏈的A21位的天 然天冬氨酸被甘氨酸取代，以及在人胰島素B鏈的NH2末端添加2個(gè)精氨酸分子。任何 胰島素，包括甘精胰島素的主要功能是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。胰島素及其類(lèi)似物通過(guò)刺激外 周、尤其是骨骼肌和脂肪內(nèi)葡萄糖攝取以及抑制肝葡萄糖生成降低血糖水平。DNA編碼異源性蛋白用式I表示X-B-Y-A其中X是包含至少一個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽序列；B是胰島素分子的B鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物；Y是包含至少兩個(gè)氨基酸的連接肽；A是胰島素分子的A鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物，并且A和B鏈可通過(guò) 氨基酸取代、缺失或添加進(jìn)行修飾。本文所用術(shù)語(yǔ)“C-肽”或“連接肽”包括了所有形式的胰島素C-肽，包括天 然或合成肽。所述胰島素C-肽可以是人肽，或可來(lái)自其他動(dòng)物種屬，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。因 此天然胰島素C-肽的變體和修飾也包括在內(nèi)，只要它們保留了胰島素C-肽的活性。修 飾蛋白或多肽序列的同時(shí)保留其有用的活性是本領(lǐng)域已知的，其可以通過(guò)使用作為本領(lǐng) 域標(biāo)準(zhǔn)或在文獻(xiàn)中廣泛描述的技術(shù)完成，例如隨機(jī)或定向誘變、核酸的切割和連接等。 因此，天然胰島素C-肽序列的功能性等價(jià)變體或衍生物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)方便地 制備，包括具有天然胰島素C-肽功能性，例如生物學(xué)活性的肽序列。所有這些胰島素 C-肽類(lèi)似物、變體、衍生物或片段均特別包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，并包含在術(shù)語(yǔ)“胰島素 C-肽”中。連接序列可以是任何具有至少2個(gè)氨基酸的序列。盡管長(zhǎng)度不是關(guān)鍵的，可方 便或根據(jù)需要選取，連接區(qū)域可包含2到25、2到15、2到12或2到10個(gè)氨基殘基。連接肽可以是包含至少2個(gè)氨基酸的任何序列，條件是開(kāi)頭兩個(gè)氨基酸為 “RR”。此外，通常應(yīng)當(dāng)理解，在某些情況下，提供同源形式的甘精胰島素蛋白是有利 的，其僅是所述蛋白某個(gè)亞型生物活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。因此，特定的生物學(xué)效應(yīng)可 通過(guò)使用限制功能的同源物引發(fā)，其具有較少的副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸編碼這樣的多肽其是人甘精胰島素蛋白的 激動(dòng)劑或拮抗劑，包括SEQ ID No: 2所示的氨基酸序列。優(yōu)選的核酸編碼具有甘精胰島 素蛋白活性和具有與SEQ ID No: 2所示氨基酸序列至少90%同源性的肽，更優(yōu)選95%同 源性和最優(yōu)選97%同源性。編碼與SEQ ID No 2所示序列具有至少約98-99%同源性的甘精胰島素蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑形式的核酸也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。優(yōu)選地， 所述核酸是包含至少部分編碼SEQ ID Nal所示甘精胰島素蛋白的核苷酸序列的cDNA分子。本文所討論的“操作元件”包括至少一個(gè)啟動(dòng)子、至少一個(gè)操縱子、至少一個(gè) 前導(dǎo)序列、至少一個(gè)S-D序列，至少一個(gè)終止密碼子以及其他對(duì)適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和隨后翻譯載 體DNA需要和優(yōu)選的任何DNA序列。具體而言，應(yīng)當(dāng)理解這些載體將含有至少一個(gè)宿 主微生物識(shí)別的復(fù)制起始位點(diǎn)和至少一個(gè)可選擇標(biāo)記物以及至少一個(gè)能起始合成DNA序 列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體還優(yōu)選含有能作為調(diào)節(jié)器起作用的 特定DNA序列，以及能編碼調(diào)節(jié)器蛋白的其他DNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些 調(diào)節(jié)器用于防止DNA序列在特定環(huán)境條件下表達(dá)，以及在其他環(huán)境條件下允許轉(zhuǎn)錄和該 DNA序列編碼蛋白的隨后表達(dá)。此外，優(yōu)選在載體內(nèi)或DNA序列的5’端具有適當(dāng)?shù)姆置谇皩?dǎo)序列。該前導(dǎo)序 列具有這樣的位置其允許前導(dǎo)序列與能指導(dǎo)所需蛋白抑制劑表達(dá)的核苷酸序列起始部 分直接相鄰而不干擾翻譯終止信號(hào)。前導(dǎo)序列的存在部分緣于下列一個(gè)或多個(gè)因素1)前導(dǎo)序列的存在可幫助宿主將起始產(chǎn)品加工為成熟重組蛋白產(chǎn)品；2)前導(dǎo)序列的存在可通過(guò)將蛋白酶抑制劑導(dǎo)出胞漿外幫助純化重組蛋白產(chǎn)品；3)前導(dǎo)序列可通過(guò)將蛋白導(dǎo)出胞漿影響重組蛋白折疊成其活性結(jié)構(gòu)的能力?！稗D(zhuǎn)錄調(diào)控序列”是貫穿說(shuō)明書(shū)使用的通用術(shù)語(yǔ)，其表示這樣的DNA序列，例 如起始信號(hào)、增強(qiáng)子以及誘導(dǎo)或控制與之可操作連接的蛋白編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組甘精胰島素基因的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子序列(或其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列)控 制下進(jìn)行，其控制重組基因在預(yù)期表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)。“控制序列”是指在特定的宿主有機(jī)體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所需要的 DNA序列。適于原核生物的控制序列例如包括啟動(dòng)子、任選的操縱子序列、核糖體結(jié)合 位點(diǎn)，以及可能的其他仍難以理解的序列。已知真核細(xì)胞能利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信 號(hào)和增強(qiáng)子?！稗D(zhuǎn)化”表示將DNA導(dǎo)入有機(jī)體內(nèi)，由此該DNA可作為染色體外元件或通過(guò)染 色體整合進(jìn)行復(fù)制。依賴(lài)于使用的宿主細(xì)胞，使用適于此類(lèi)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般性模式由Axel描述于1983年8月16日授權(quán)的U.S.專(zhuān) 利4,399,216中。酵母中的轉(zhuǎn)化通常按照Van Solingen, P等的方法進(jìn)行，Van Solingen, P.,等.，J.Bact.，130 946 (1977) and Hsiao, C.L.,等，Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 76 3829(1979)。重組表達(dá)系統(tǒng)選自原核和真核宿主。真核宿主包括酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母或 巴斯德畢赤酵母)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。細(xì)菌和真核細(xì)胞可從多種來(lái)源獲得，包括 本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的商業(yè)來(lái)源，例如美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)(ATCC ； Rockville，Md.)。用于重 組蛋白表達(dá)的商用細(xì)胞來(lái)源同時(shí)提供了細(xì)胞的使用說(shuō)明書(shū)。表達(dá)系統(tǒng)的選擇依賴(lài)于要表 達(dá)多肽需要的特征。因此，本發(fā)明的主題是在衍生自酵母的細(xì)胞內(nèi)具有功能性的表達(dá)系統(tǒng)或表達(dá) 盒，所述酵母選自畢赤酵母株，尤其選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和栗酒裂殖酵 母，允許其需要的多肽編碼蛋白片段的部分表達(dá)，位于其表達(dá)所需要的元件控制的位點(diǎn)ο本文用于描述蛋白或多肽的術(shù)語(yǔ)“重組”表示通過(guò)表達(dá)重組多核苷酸產(chǎn)生的多 肽。本文用于描述細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“重組”表示細(xì)胞可被或已經(jīng)被用作重組載體或其他轉(zhuǎn)化 DNA的受體，包括被轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的子代。應(yīng)當(dāng)理解，由于偶然或故意的突變，單個(gè) 母細(xì)胞的子代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA元件方面與原始母細(xì)胞可能并不完全相同。通 過(guò)相關(guān)性質(zhì)鑒別與母細(xì)胞足夠相似的母細(xì)胞的子代，例如存在編碼所需多肽的核苷酸序 列，也是考慮的子代?！坝嘘P(guān)基因”(GOI)是任何需要增加轉(zhuǎn)錄表達(dá)的核酸序列。GOI可編碼功能性的 核酸分子(例如RNA，例如反義RNA分子)，或更典型的編碼需要增加產(chǎn)量的肽、多肽 或蛋白。本發(fā)明的載體可用于表達(dá)“異源”蛋白。本文所用術(shù)語(yǔ)“異源”表示來(lái)源于 外來(lái)種屬的核酸序列或多肽，或如果來(lái)源于同一種屬，其相對(duì)于原始形式具有實(shí)質(zhì)性改 變。此外，在細(xì)胞中非正常表達(dá)的修飾或未修飾的核酸序列或多肽被認(rèn)為是異源性的。 本發(fā)明的載體具有在同一或不同插入位點(diǎn)插入的一個(gè)或多個(gè)GOI，其中各個(gè)GOI與調(diào)控 核酸序列可操作地連接，后者允許GOI的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)從包含肽和一種或多種污染物的組合物中“純化”肽，由此通過(guò)減少至少 一種污染物在肽組合物中的量來(lái)增加所述肽在組合物中的純度。更具體而言，本發(fā)明的 純化方法產(chǎn)生在酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)的生物活性異源蛋白，其特征在于所述純化的 蛋白不含或含有實(shí)質(zhì)上最低限度量的糖基化副產(chǎn)物。除糖基化形式外，存在的非極性雜質(zhì)可通過(guò)MALDI確認(rèn)(m/Z: 6089)。該非 極性雜質(zhì)在最終產(chǎn)品中的含量為0-0.5%，其在加工甘精胰島素的過(guò)程中產(chǎn)生。甘精胰島 素(m/z 6063)和非極性雜質(zhì)(m/z 6089)的質(zhì)量數(shù)差異為26個(gè)單位。基于分子量的 化學(xué)同一性表明氨基酸中水的缺失和?；目赡?。術(shù)語(yǔ)“色譜”是指由于在一定流動(dòng)相影響下，混合物中的各溶質(zhì)通過(guò)固相介質(zhì) 的速率不同，或者在結(jié)合和洗脫過(guò)程中從混合物中的其他溶質(zhì)中分離混合物中有關(guān)溶質(zhì) 的方法。本文所用術(shù)語(yǔ)“高效液相色譜”是指這樣的色譜方法，其中用于填充柱的介質(zhì) (固定相)小(3和50微米之間)且規(guī)則，相對(duì)于選定的尺寸幾乎沒(méi)有差異。該色譜通常 可采用相對(duì)較高的進(jìn)氣壓力(約500-3500psi)。選擇宿主生物體后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將載體轉(zhuǎn)移至宿主生物體 內(nèi)。所述方法的實(shí)例可參見(jiàn) R.W.Davis 等人的 Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1980)，其特別引入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)
施方案中，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)化在低溫下進(jìn)行，溫度調(diào)節(jié)被認(rèn)為是通過(guò)使用之前所述的元件調(diào) 節(jié)基因表達(dá)的方法。在適于甘精胰島素前體表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主微生物。這些條件通常是宿 主特異性的，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)關(guān)于此類(lèi)有機(jī)體生長(zhǎng)條件的出版文獻(xiàn)方便地確 定，例如 Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology,第 8 版，Williams & Wilkins Company, Baltimore, Md.，其特別引入本文作為參考。因此，編碼序列與控制序列“可操作地連接”是指這樣的結(jié)構(gòu)，其中編碼序列 可在這些序列的控制下表達(dá)，并且其中所連接的DNA序列是連續(xù)的，在分泌前導(dǎo)物的情況下，是連續(xù)的并位于閱讀相內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，式X-甘精胰島素B鏈[B1-B30]_Y-甘精胰島素A鏈 [A1-A21]的甘精胰島素前體，其中X是前導(dǎo)序列，B鏈?zhǔn)歉示葝u素B鏈序列B1-B30， Y是B鏈和A鏈之間的連接肽序列，A鏈?zhǔn)歉示葝u素的A鏈。該GIP-A前體可以通過(guò) 在宿主表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)生，所述系統(tǒng)包括除大腸桿菌外的細(xì)菌，酵母例如釀酒酵母和 克魯維酵母，其方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(MethodsinEnzymology vol.194)；以及真 菌，例如曲霉、鏈孢霉和木霉屬，其方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如描述于Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, Caten, Ogden, and Bennett, eds. (Cambridge University Press, N.Y.1991)，其中許多能從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)獲得，Rockville，Md.，其由本 領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用。優(yōu)選地，宿主菌株選自酵母例如釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、解 脂耶氏酵母、多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母、甲醇畢赤酵母和巴斯德畢赤酵母，其能 夠表達(dá)高水平的重組蛋白。甚至更優(yōu)選地，宿主菌株是巴斯德畢赤酵母。特別地，本發(fā)明提供了制備甘精胰島素蛋白的方法，包括發(fā)酵過(guò)程、回收過(guò)程 以及純化過(guò)程。本文提供的方法包括發(fā)酵過(guò)程，其中上述蛋白在具有至少一種編碼所述 蛋白的序列整合到基因組中的巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生，其中發(fā)酵過(guò)程包括種子發(fā)酵以生 長(zhǎng)宿主細(xì)胞至需要的細(xì)胞密度，以及包括甘油分批發(fā)酵、甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵和最終生產(chǎn)的生 產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程。隨后使用陽(yáng)離子交換色譜從發(fā)酵液中捕獲甘精胰島素前體，本文提供的回收過(guò) 程能捕獲甘精胰島素前體并除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片，其中本文提供的回收過(guò)程提供了 95% 的產(chǎn)率?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可檢測(cè)和評(píng)價(jià)備選的方法以捕獲需要的蛋白產(chǎn)品并除去 細(xì)胞和細(xì)胞碎片，其包括但不限于多種其他色譜方法、離心、過(guò)濾、示差沉淀以及其他 要確定的方法。從發(fā)酵液捕獲的甘精胰島素前體進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)晶以除色并保存。晶體形式的甘 精胰島素前體在PH3.0-8.0、優(yōu)選4.0-6.0、最優(yōu)選4.0-5.0的水性載體中適當(dāng)?shù)爻恋?，?性載體中的蛋白濃度在l-80g/L，優(yōu)選2-50g/L，最優(yōu)選8-14g/L。結(jié)晶過(guò)程可以在溫度 2-30°C進(jìn)行。所述前體晶體可通過(guò)離心、傾瀉或過(guò)濾從上清液中分離出來(lái)。甘精胰島素前體GIP-A的結(jié)晶除去了發(fā)酵液到陽(yáng)離子洗脫中形成的雜質(zhì)和用于 將產(chǎn)品從色譜柱上洗脫下來(lái)的乙酸銨鹽。純的晶態(tài)前體還有助于降低后續(xù)步驟的成本和 提高反應(yīng)的效率。晶體形式可冷凍儲(chǔ)存，其儲(chǔ)存在-20°C時(shí)可長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定?？赏ㄟ^(guò)酶轉(zhuǎn)化從甘精胰島素前體制備甘精胰島素。該轉(zhuǎn)化使用胰蛋白酶或 植物、動(dòng)物或微生物來(lái)源的類(lèi)胰蛋白酶進(jìn)行。反應(yīng)優(yōu)選在水可混溶性有機(jī)溶劑例如 DMSO(二甲亞砜)、DMF( 二甲基甲酰胺)、乙醇、丙酮、乙腈或乙酸乙酯，尤其是 DMF和DMSO存在下進(jìn)行，優(yōu)選的有機(jī)溶劑占反應(yīng)混合物的比例約為0-65%，尤其是約 40-60%。通過(guò)用胰蛋白酶處理前體GIP-A產(chǎn)生甘精胰島素。前導(dǎo)物(如果存在)將被胰 蛋白酶從前體上切割下來(lái)。胰蛋白酶反應(yīng)以這樣的方式控制，使得C末端“RR” C-肽 的切割最大化。但該反應(yīng)不能消除胰蛋白酶在其他胰蛋白酶切割位點(diǎn)的不需要的切割。 可能的其他胰蛋白酶切割位點(diǎn)在“RR”之間和B-22 (Arg)的C末端之間。有機(jī)溶劑的使用根據(jù)原材料的溶解性、酶變性的傾向及其水解活性而定，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，也可使用有機(jī)溶劑混合物。加入有機(jī)溶劑降低了反應(yīng)混合物的水濃 度從而預(yù)防了產(chǎn)品的水解，還顯著提高了產(chǎn)品的溶解性。前體的濃度通常為約5_50g/L，反應(yīng)在約pH 5-12進(jìn)行，優(yōu)選約pH8_10。反應(yīng) 溫度約為0-40°C，優(yōu)選約2-25°C?？墒褂貌煌x子強(qiáng)度的三羥甲基氨基甲烷(TRIS)或 其他緩沖系統(tǒng)以維持需要的pH。反應(yīng)時(shí)間是可變的，受其他反應(yīng)條件的影響。反應(yīng)可 持續(xù)進(jìn)行，直到產(chǎn)物濃度由于產(chǎn)物水解開(kāi)始下降。需要約30分鐘至24小時(shí)，大多數(shù)情 況下需要約4-10小時(shí)。酶的濃度依賴(lài)于底物濃度和酶活性而定。例如，商用晶體胰蛋白酶優(yōu)選以約 10-100mg/L反應(yīng)混合物的濃度使用。所述純化方法包括使所述甘精胰島素樣品在足以獲得幾乎98-99%純度、優(yōu)選 100%純度的所述肽色譜條件下，通過(guò)包括基于聚合物的樹(shù)脂基質(zhì)的反相色譜純化的步驟。由此形成不需要的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，在連續(xù)的反相色譜法中純化以產(chǎn)生純的甘精 胰島素。糖基化的(單或三)雜質(zhì)僅在第一步純化后檢測(cè)到，因此，在第二步RP-HPLC 純化步驟中特別注意純化糖基化的雜質(zhì)。發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的糖基化雜質(zhì)被完全特征化， 最終從終產(chǎn)品終純化至最大限度。在一個(gè)重要方面，發(fā)明特征是純化蛋白的方法，該方法包括將所述蛋白加載到 反相HPLC柱上，用有機(jī)溶劑在允許化合物與樹(shù)脂結(jié)合的條件下洗脫包括肽的樣品，以 及用水性緩沖溶液將有機(jī)溶劑從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)的步驟。本發(fā)明的有效性需要所使用色 譜基質(zhì)、pH值和緩沖液離子強(qiáng)度的正確組合，以進(jìn)行有效的純化。色譜方法的每個(gè)屬性在獲得需要的蛋白產(chǎn)品中都具有重要作用。色譜柱中使用 的適當(dāng)基質(zhì)是C8 Daisogel。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，純化的甘精胰島素的產(chǎn)率是75%-80%，根據(jù)本發(fā)明 的另一個(gè)方面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品的產(chǎn)率是80%-85%，根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方 面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品的產(chǎn)率是85%-90%，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，純化的甘 精胰島素產(chǎn)品的產(chǎn)率是90%-95%，根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品 的產(chǎn)率是95% -100%。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品不含或含有實(shí)質(zhì)上最低限度量 的糖基化副產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品純度至少是96%，根 據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品純度至少是97%，根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè) 方面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品純度至少是98%，根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，純化的甘精 胰島素產(chǎn)品純度至少是99%，根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，純化的甘精胰島素產(chǎn)品產(chǎn)率是 100%。本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。然而，這些實(shí)施例不應(yīng)認(rèn)為限制本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1 GIP-A代表式X_[甘精胰島素B鏈(B1-B30) ]-Y_[甘精胰島素A鏈(Α1-Α21)] 的甘精胰島素前體，其中X是前導(dǎo)序列，B鏈?zhǔn)歉示葝u素B鏈序列Β1-Β30，Y是B鏈和A鏈之間的連接肽序列，A鏈?zhǔn)歉示葝u素的A鏈。該序列可以不含前導(dǎo)或其他前導(dǎo) 肽。連接肽Y可以是RR、RRDADDR中任一個(gè)。所述GIP-A前體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)?表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生，例如大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、CHO細(xì)胞等。所述GIP-A前體與Mat-alfa信號(hào)肽在框內(nèi)克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中， 用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主菌株GS115，獲得克隆表達(dá)甘精胰島素前體。 分泌的前體用胰蛋白酶處理以制備甘精胰島素和其他相關(guān)雜質(zhì)。使用反相色譜純化甘精 胰島素。SEQ ID 1代表甘精胰島素前體的序列，預(yù)測(cè)分子量為6045Da，估計(jì)的pi值為 6.88。該序列具有159個(gè)核苷酸和53個(gè)氨基酸。SEQ ID 2代表用于再巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的序列，其預(yù)測(cè)分子量為 6428.4da，估計(jì)的pi值為7.78。該序列具有171個(gè)核苷酸和57個(gè)氨基酸。甘精胰島素前體GIP-A由巴斯德畢赤酵母分泌至培養(yǎng)基中。離心發(fā)酵液，從上 清分離細(xì)胞。包括離子交換色譜和疏水色譜在內(nèi)的數(shù)種方法可用于捕獲前體GIP-A，本 發(fā)明使用陽(yáng)離子交換色譜和HIC捕獲GIP-A。實(shí)施例2:構(gòu)建攜帶甘精胰島素前體基因的重組載體將甘精胰島素前體(GIP-A)與mat α -信號(hào)肽在框內(nèi)克隆至巴斯德畢赤酵母表達(dá) 載體pPIC9K中。用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母宿主菌株GS115，分泌的GIP-A 即為甘精胰島素前體，其將進(jìn)行下游純化過(guò)程以制備最終產(chǎn)品。用攜帶甘精胰島素前體基因的重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主用8苗11消化具有重組質(zhì)粒0^的卩 忙9尺/^^-八克隆，用于轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤 酵母GS115(his4)宿主的電感受態(tài)細(xì)胞。Invitrogen手冊(cè)提供了轉(zhuǎn)化方法的詳細(xì)方案。篩選多拷貝整合體在適當(dāng)?shù)目刂葡?，將約2000個(gè)轉(zhuǎn)化體在384孔微量滴定板中用YPD培養(yǎng)基孵 育，將板在30°C下孵育24小時(shí)，隨后壓至含0.5mg/mL Geniticin(G418)的YPD瓊脂平 板上。選擇49個(gè)克隆進(jìn)一步壓制到平板1、2和3mg/mLG418上進(jìn)行第二輪篩選。最 后選擇7個(gè)對(duì)l-3mgl/ml G418耐藥的克隆用于表達(dá)研究。通過(guò)PCR確認(rèn)基因整合到基因組中使用基因特異性引物對(duì)來(lái)自選定重組畢赤酵母克隆的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，以確認(rèn)GIP-A整合到基因組內(nèi)。巴斯德畢赤酵母中的小規(guī)模表達(dá)研究按照Invitrogen手冊(cè)中給出的方案進(jìn)行巴斯德畢赤酵母內(nèi)的小規(guī)模表達(dá)研究。簡(jiǎn) 言之，將克隆在BMGY中于30°C下生長(zhǎng)，隨后在BMMY中用甲醇在24°C誘導(dǎo)。甲醇誘 導(dǎo)共進(jìn)行3天。實(shí)施例3:發(fā)酵程序重組甘精胰島素的發(fā)酵過(guò)程在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模優(yōu)化。下面是該過(guò)程的簡(jiǎn)要敘述。種子制備種子培養(yǎng)基含有下列成分酵母氮堿基、硫酸銨、甘油、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以及D-生物素。使用從冷凍箱中取出的單個(gè)小瓶接種種子燒瓶。小瓶解凍至環(huán)境溫度后在無(wú)菌 條件下接種。接種物以無(wú)菌的方式分散于最小甘油(MGY)培養(yǎng)基中。確定每個(gè)燒瓶中加入的量，使得接種前燒瓶中起始OD600為0.1-0.2。燒瓶隨后 在搖床上于30°C孵育20-24小時(shí)，速度為230RPM。發(fā)酵罐批式條件發(fā)酵過(guò)程包括兩個(gè)階段，生長(zhǎng)期(產(chǎn)生生物菌體)和隨后的誘導(dǎo)期。在甲醇批 式培養(yǎng)期間，產(chǎn)品分泌至發(fā)酵液中。在原位滅菌發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基包括正 磷酸、硫酸鉀、氫氧化鉀、硫酸鎂、硫酸鈣和甘油。將這些化學(xué)物在發(fā)酵罐中溶于飲用 水中，在設(shè)定的121°C滅菌特定的時(shí)間。單獨(dú)制備痕量鹽和生物素的儲(chǔ)備液，無(wú)菌過(guò)濾， 培養(yǎng)基滅菌，用氫氧化銨將pH調(diào)節(jié)到5.0后無(wú)菌加入到發(fā)酵罐中。采用生產(chǎn)/發(fā)酵程序。發(fā)酵罐用來(lái)自種子搖瓶的5%種子接種物接種，發(fā)酵開(kāi)始 時(shí)設(shè)定以下參數(shù)pH: 5.0，溫度30°C，D02 30%。實(shí)施例4:有關(guān)的轉(zhuǎn)化和純化方法純化巴斯德畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的甘精胰島素前體，純化過(guò)程的步驟如下用5OmM 乙酸平衡 SP Sepharose fast flow 基質(zhì)(GE Biosciences)填充的柱。將無(wú)
細(xì)胞上清液用正磷酸調(diào)節(jié)至PH3.8，加載到陽(yáng)離子交換柱上。柱上樣量<50g/L。使用 乙酸銨洗脫。該步驟在< 50g/L上樣量的情況下回收率為95%。前體結(jié)晶將使用陽(yáng)離子交換色譜步驟從發(fā)酵液中捕獲的甘精胰島素前體結(jié)晶以除色并儲(chǔ) 存。結(jié)晶開(kāi)始時(shí)的前體濃度為約2-20g/L，優(yōu)選8-14g/L。加入ZnC12 &苯酚，隨后調(diào) 節(jié)pH至3.0-8.0，優(yōu)選3.5-5.5進(jìn)行結(jié)晶。苯酚以0.1-0.5% CIEX洗脫液體積加入，以 3-15% CIEX洗脫液體積加入4%的4% ZnC12溶液。pH可使用任何堿調(diào)節(jié)，優(yōu)選NaOH 或TRIS。結(jié)晶過(guò)程在溫度2-30°C之間進(jìn)行，漿液儲(chǔ)存一段時(shí)間，以使得晶體完全形成。 通過(guò)離心或傾瀉將前體晶體從上清液中分離出來(lái)。實(shí)施例4a 取463ml洗脫液(前體濃度13.8g/L)，適當(dāng)解凍后加入2.315ml苯 酚(0.5% EP體積)。隨后添加57.875ml 4% ZnC12溶液(12.5% EP體積)。此時(shí)pH為 4.08，通過(guò)加入420ml 2.5N的NaOH將其調(diào)節(jié)為4.8。母液在緩慢攪拌的條件下保存15 分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至冷庫(kù)中(2-8°C )，保存過(guò)夜。隨后將全部混合物在Beckman Coulter Avanti J-26XP離心機(jī)中以5000rpm離心20分鐘。上清液損失為1.55%。實(shí)施例4b 取500ml洗脫液(前體濃度2.9g/L)，適當(dāng)解凍后加入0.625ml苯酚 (0.125% EP體積)。隨后添加15.625ml 4% ZnC12溶液(3.125% EP體積)。此時(shí)pH為 4.08，通過(guò)加入315ml 2.5N的NaOH將其調(diào)節(jié)為4.8。母液在緩慢攪拌的條件下保存15 分鐘，隨后轉(zhuǎn)移至冷庫(kù)中(2_8°C)，保存5小時(shí)。隨后通過(guò)離心分離上清液。上清液損 失為4%。產(chǎn)率優(yōu)化的前體結(jié)晶條件將SP-Sepharose洗脫收集液冷卻至20° +5°C，每升洗脫液加入5mL(0.5% V/V) 苯酚。將需要量的苯酚加入到等分洗脫液中，最后加入到主池中進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑偃芙?。加入苯酚繼續(xù)攪拌一段時(shí)間后添加下一種試劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑偃芙狻，F(xiàn)在加入12.5體積％的 40g/L氯化鋅(4% w/v)以誘導(dǎo)結(jié)晶。隨后用2.5NNaOH(約85-90% SP-EP體積)調(diào)節(jié) pH至4.8+0.1。攪拌該整體混合物30分鐘以保證均一性，隨后在2-8°C保留至少8小時(shí) 后離心。基于上清液的損失，該步驟產(chǎn)率約為90%。實(shí)施例5:胰蛋白酶消化通過(guò)酶轉(zhuǎn)化從甘精胰島素前體制備甘精胰島素。該轉(zhuǎn)化使用胰蛋白酶或植物、 動(dòng)物或微生物來(lái)源的類(lèi)胰蛋白酶進(jìn)行。反應(yīng)優(yōu)選在水可混溶性有機(jī)溶劑例如DMSO、 DMF、乙醇、丙酮、乙腈或乙酸乙酯，尤其是DMF和DMSO存在下進(jìn)行，優(yōu)選的有機(jī)溶 劑占反應(yīng)混合物比例約為0-65 %，尤其是約40-60 %。有機(jī)溶劑的比例根據(jù)原材料的溶解性、酶變性的傾向及其水解活性而定，也可 使用有機(jī)溶劑混合物。加入有機(jī)溶劑降低了反應(yīng)混合物的水濃度從而預(yù)防了產(chǎn)品的水 解，還顯著提高了產(chǎn)品的溶解性。前體的濃度通常為約5_50g/L，反應(yīng)在約pH 5-12進(jìn)行，優(yōu)選約pH8_10。反應(yīng) 溫度約為0-40°C，優(yōu)選約2-25°C?？墒褂貌煌x子強(qiáng)度的三羥甲基氨基甲烷(TRIS)或 其他緩沖系統(tǒng)以維持需要的pH。反應(yīng)時(shí)間是可變的，受其他反應(yīng)條件的影響。反應(yīng)可 持續(xù)進(jìn)行，直到產(chǎn)物濃度由于產(chǎn)物水解開(kāi)始下降。通常需要約30分鐘至24小時(shí)，大多 數(shù)情況下需要約4-10小時(shí)。酶的濃度依賴(lài)于底物濃度和酶活性而定。例如，商用晶體胰蛋白酶優(yōu)選以約 10-100mg/L的濃度使用。實(shí)施例5a 將Ig甘精胰島素前體溶于1.5ml IM TRIS溶液中。各取Iml該溶 液置于2支試管中，標(biāo)記為樣品A和樣品B。向樣品A中加入3ml水和166.6mg TRIS0 向樣品B中加入2ml DMF、Iml水和166.6mg TRISo 各樣品分成4份，調(diào)節(jié)pH至4個(gè) 不同的pH。在所有樣品中加入濃度為50 μ g/ml的牛胰蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)。采用的條件如 下表權(quán)利要求
1.一種獲得在酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，其 特征在于所述純化的蛋白不含或含有實(shí)質(zhì)上最低限度量的糖基化副產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于DNA編碼異源性蛋白用式I表示 X-B-Y-A其中X是包含至少一個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽序列； B是胰島素分子的B鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物； Y是包含至少兩個(gè)氨基酸的連接肽；A是胰島素分子的A鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物，并且A和B鏈可通過(guò)氨基 酸取代、缺失和/或添加進(jìn)行修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述連接肽可以是包含至少兩個(gè)氨基酸的任何 序列，條件是開(kāi)頭兩個(gè)氨基酸為“RR”。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述蛋白由SEQID: 1或SEQ ID: 2定義。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于酵母表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞選自畢赤酵母屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于酵母表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞選自巴斯德畢赤酵 母、甲醇畢赤酵母、釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形漢森酵母、乳酸克 魯維酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于蛋白的糖基化形式可以是單糖基化、三糖基化或多糖基化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述純化的蛋白含有低于的糖基化雜質(zhì)。
9.獲得在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，該方法包括 下列步驟a)在適于該蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)用含有式I定義的編碼該異源蛋白的DNA序列的 載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；b)收集表達(dá)的蛋白，包括從宿主細(xì)胞分離所述蛋白，產(chǎn)生收集的蛋白；c)使步驟(b)中收集的蛋白結(jié)晶的步驟；d)在胰蛋白酶或類(lèi)胰蛋白酶存在下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化的步驟；e)純化含有至少一種相關(guān)雜質(zhì)的所述蛋白，包括使所述蛋白混合物與色譜基質(zhì)接 觸，其特征在于使用極性有機(jī)溶劑，在含有有機(jī)酸緩沖液的水相中純化；以及f)沉淀洗脫的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于DNA編碼異源性蛋白用式I表示 X-B-Y-A其中X是包含至少一個(gè)氨基酸的先導(dǎo)肽序列； B是胰島素分子的B鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物； Y是包含至少兩個(gè)氨基酸的連接肽；A是胰島素分子的A鏈氨基酸序列，其衍生物或類(lèi)似物，并且A和B鏈可通過(guò)氨基 酸取代、缺失和/或添加進(jìn)行修飾。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于連接肽可以是包含至少兩個(gè)氨基酸的任何序列，條件是開(kāi)頭兩個(gè)氨基酸為“RR”。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于SEQID: 1或2定義的基因與信號(hào)肽在框內(nèi)克隆。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于SEQID: 1或2定義的基因與mat-α -信 號(hào)肽在框內(nèi)克隆。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于宿主細(xì)胞選自畢赤酵母屬。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于宿主細(xì)胞選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵 母、釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于宿主菌株是GS115。
18.產(chǎn)生權(quán)利要求9的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，其包括a)用包含指導(dǎo)所述蛋白表達(dá)的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化酵母株接種水性發(fā)酵培養(yǎng)基；以及b)在有效表達(dá)所述蛋白的條件下，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化株。
19.產(chǎn)生權(quán)利要求18的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，其特征在于該表達(dá)的蛋 白使用離子交換色譜從發(fā)酵液中捕獲。
20.產(chǎn)生權(quán)利要求9的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，所述方法包括添加氯化 鋅和苯酚結(jié)晶蛋白的步驟。
21.產(chǎn)生權(quán)利要求9的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，所述方法包括在胰蛋白 酶存在下在水可混溶有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶轉(zhuǎn)化步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于水可混溶有機(jī)溶劑選自DMSO、DMF、乙 醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物。
23.產(chǎn)生權(quán)利要求9的純化的、生物活性的異源蛋白的方法，所述方法包括含有至少 一種相關(guān)雜質(zhì)的蛋白混合物的RP-HPLC純化步驟，其通過(guò)使所述蛋白混合物與色譜樹(shù) 脂基質(zhì)接觸進(jìn)行，其特征在于使用極性有機(jī)緩沖溶劑，在含有有機(jī)酸緩沖液的水相中純 化。
24.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于極性緩沖溶劑是乙腈。
25.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于有機(jī)酸緩沖液選自檸檬酸、乙酸、硼酸、甲 酸、鹽酸和磷酸。
26.根據(jù)前述任一權(quán)利要求獲得的純化的、生物活性的異源蛋白產(chǎn)品，其純度至少為 96%。
27.根據(jù)前述任一權(quán)利要求獲得的純化的、生物活性的異源蛋白產(chǎn)品，其純度在 97-100%之間。
28.純度至少為96%的純化的甘精胰島素。
29.含有低于的糖基化雜質(zhì)的純化的甘精胰島素。
30.不含糖基化雜質(zhì)的純化的甘精胰島素。
31.根據(jù)權(quán)利要求的純化的甘精胰島素，其特征在于所述蛋白的糖基化形式可以是單糖基化、三糖基化或多糖基化。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離和/或純化雜質(zhì)，產(chǎn)生不含相關(guān)雜質(zhì)或僅含實(shí)質(zhì)上最低限度量的糖基化雜質(zhì)的純化的異源蛋白產(chǎn)品的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及胰島素類(lèi)似物例如甘精胰島素糖基化形式雜質(zhì)的鑒別，其特征為在基于酵母的系統(tǒng)例如畢赤酵母屬中表達(dá)后鑒定。本發(fā)明還涉及克隆編碼蛋白甘精胰島素的基因，將相關(guān)基因插入到適當(dāng)?shù)慕湍杆拗髦?；產(chǎn)生重組菌株的培養(yǎng)物，刺激異源多肽的表達(dá)、分泌和發(fā)酵后的純化，以及有關(guān)的酶轉(zhuǎn)化的方法。
文檔編號(hào)C07K14/62GK102015762SQ200880127098
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月19日
發(fā)明者克里斯娜莫西·維克特桑, 妮塔·羅伊, 安普·維蘇德瓦, 尼特斯·戴夫, 帕莎·海澤瑞, 戈迪·撒切德威, 桑杰·緹瓦瑞, 海瑞斯·伊爾, 繆科施·巴布帕·帕特勒, 薇薇柯南丹·柯南, 阿努依·戈?duì)? 阿努帕瑪·賈格迪什 申請(qǐng)人:百康有限公司