專利名稱：一種從老鼠簕中分離出苯并噁唑嗪酮苷類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從老鼠簕"C3/7^WSi"'ci/bh'^L.)中分離出苯并噁唑嗪酮類化合物
的方法，具體來說是涉及一種利用高速逆流色譜技術(shù)從老鼠簕中分離出下述式(1)表示的(2A0 -2-0-》-Z -葡萄糖基_2^1， 4-苯并噁唑嗪-3(4H)-酮和(27 ) -2-0-》-"-葡萄糖基-4-羥 基-2H-1， 4-苯并噁唑嗪-3(4H)-酮。
老鼠簕為多年生草本植物，全株均可入藥，主治淋巴腺炎，肝炎，哮喘等。藥理學(xué)研究 表明，老鼠簕的提取物具有抗病毒、抗癌、抗氧化、抗突變、保肝和消炎活性。目前從老鼠 簕中提取出6種苯并噁唑嗪酮類化合物。這類化合物在植物中主要扮演抵御病蟲害，通過化 感作用和其它植物競爭，以及生長激素的角色。經(jīng)過研究，這些次生代謝產(chǎn)物可以作天然殺 蟲劑。目前主要采用傳統(tǒng)的柱色譜法從老鼠簕中分離苯并噁唑嗪酮類化合物，其中包括下述 式(1)表示的化合物，需要涉及多個柱色譜分離，操作繁瑣(見參考文獻(xiàn)l.WuJ， Zhang S，
XiaoQ， Li Q， Huang J， Long L， Huang L Phenylethanoid and aliphatic alcohol glycosides from Acanthus ilicifolius. Phytochemistry， 2003， 63(4): 491-495.; 2. Kancha卿oom T， KamelMS， Kasai R， Picheansoonthon C， HiragaY， Yamasaki K. Benzoxazinoid glucosides from Acanthus ilicifolius. Phytochemistry, 2001， 58(4): 637-640; 3-Huo C_H， Wang B， Lin W-H ， Zhao Y_Y. Benzoxazinones from Acanthus ilicifolius. Biochemical Systematics and Ecology, 2005， 33(6): 643-645.; 4. Francisco A， MaciasDM， Alberto 0_B, David C， Simonet A M， Jos6 M G M. Isolation and Synthesis of Allelochemicals from Gramineae: Benzoxazinones and Related Compounds. J Agric Food Chem， 2006， 54 (4):
<formula>formula see original document page 3</formula>
其中R表示H或OH。
高速逆流色譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于天然物質(zhì)的分離，該技術(shù)不需要固態(tài)的擔(dān)體，而且過程中溶劑系統(tǒng)的固定相不會產(chǎn)生對樣品的不可逆吸附，因此可用于粗提物的直接分離，并得 到非常高的樣品回收率。但是目前還沒有將高速逆流色譜技術(shù)用于分離老鼠簕中的苯并嗪酮 類化合物的相關(guān)研究見報。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種簡便快捷地從老鼠簕中分離出苯并噁唑嗪酮類化合物的方法。
我們通過將老鼠簕依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取后，將正丁醇萃取物溶解在由 酯類，醇類和水或氨水組成的溶劑系統(tǒng)的上相和下相中，將與上述組成相同的溶劑系統(tǒng)的上 相作為高速逆流色譜儀的固定相，下相作為流動相，以紫外光譜儀檢測(波長254nm)，依據(jù) 色譜峰收集目標(biāo)產(chǎn)物，不但操作簡單，而且分離出來的由式(1)表示的化合物(2們-2-0---" -葡萄糖基-2H-l， 4-苯并噁唑嗪-3(4H)-酮和(2> ) -2-0-,-"-葡萄糖基-4-羥基-2H-1， 4-苯并噁唑嗪-3(祖)-酮的純度均在80%以上，甚至可高達(dá)97%,從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的一種從老鼠簕中分離出苯并噁唑嗪酮苷類化合物的方法，是以溶劑系統(tǒng)的上相 充滿高速逆流色譜儀的管路作為固定相，管路旋轉(zhuǎn)后再將溶劑系統(tǒng)的下相泵入管路，當(dāng)澄清 的流動相從管路尾端流出后，通過進(jìn)樣閥注入樣品溶液，接收管路尾端流出的洗脫液，用紫 外光譜儀檢測，根據(jù)色譜峰收集產(chǎn)物，其特征是所述的溶劑系統(tǒng)由a， b, c三組分按體積比2 5:3 6:5 10組成，其中a組分是乙酸乙酯或乙酸丙酯或乙酸異丙酯，b組分是正丁醇或異 丁醇或戊醇，c組分是水或體積分?jǐn)?shù)0.5% 1.0%氨水溶液，所述的樣品溶液是將老鼠簕用乙 醇提取后，蒸干提取液，將提取物混懸于水中，依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取，將 得到的正丁醇萃取物溶解于與上述管路中的溶劑系統(tǒng)組成相同的溶劑系統(tǒng)中得到，所述的紫 外光譜儀檢測的波長是254nm，所述的產(chǎn)物是式(l)表示的化合物，其中R表示H或OH，當(dāng)所 述溶劑系統(tǒng)的c組分是氨水溶液時，得到的產(chǎn)物是己分離的兩個化合物，其中R:H的化合物 的保留時間是125 145min， R=OH的化合物的保留時間是100 105min;當(dāng)溶劑系統(tǒng)的c組分 是水時，得到的產(chǎn)物是兩個化合物的混合物，保留時間是115 130min，再按上述的步驟重 復(fù)進(jìn)行一次，只是所述溶劑系統(tǒng)的0組分為體積分?jǐn)?shù)0.5% 1.0%氨水，將上述得到的兩個化 合物的混合物溶解在所述溶劑系統(tǒng)中做成樣品溶液，最后收集到已分離的兩個化合物，其中 R=H的化合物的保留時間是130 145min， R=0H的化合物的保留時間是103 112min。以上所 述高速逆流色譜過程操作均在25 35t:溫度下完成。
本發(fā)明所用的高速逆流色譜儀的柱體積可以是250 5000mL。
本發(fā)明中以氨水作為溶劑系統(tǒng)的c組分，可以一步到位地分離出(2R) -2-0-^-D-葡萄 糖基-2H-l， 4-苯并噁唑嗪-3(4H)-酮(又稱HB0A-Glc)和(2R) -2-0-"-D _葡萄糖基_4-羥基-2H-l， 4-苯并噁唑嗪-3(4H)-酮(又稱DIB0A-Glc),分離速度快，消耗溶劑少，所得到的HB0A-Glc純度為90 95%， DIB0A-Glc純度為80 85%。而以水作為溶劑系統(tǒng)的c組分， 雖然要通過兩步才能完全將兩個化合物分離，但是得到的HBOA-Glc的純度可達(dá)95% 97%， DIB0A-Glc的純度可達(dá)93% 95%。與傳統(tǒng)的制備方法相比，本發(fā)明可節(jié)省大量的有機(jī)溶劑， 同時將制備時間從原來的幾天至幾周縮短為3 6小時，而且得到的HB0A-Glc和DIB0A-Glc 純度高，可以直接應(yīng)用于色譜標(biāo)樣、藥理實驗或商業(yè)用途。


圖l:實施例1分離出的式(1)表示的兩個化合物的色譜圖，其中峰1表示HB0A-Glc, 峰2表示DIB0A-Glc。
圖2:實施例2的第1步分離出的式(1)表示的兩個化合物的混合物的色譜圖，其中峰 1表示HBOA-Glc和DIBOA-Glc的混合物。
圖3:實施例2的第2步分離出的式(1)表示的兩個化合物的色譜圖，其中峰1表示 HB0A-Glc，峰2表示DIB0A-Glc。
圖4:用HPLC測定的實施例1和2得到的化合物的純度的色譜圖(梯度洗脫條件洗脫 溶劑由乙腈和水混合組成；0 15分鐘，體積分?jǐn)?shù)10%乙腈；15 35分鐘，10% 70%乙腈； 35 40分鐘，70% 10%乙腈，紫外檢測器波長254nm)，其中峰1為HB0A-Glc，峰2為 DIB0A-Glc; (l)表示老鼠簕乙醇提取物的正丁醇萃取物(未分離樣品)的HPLC分析譜圖(2) 表示實施例1得到的DIB0A-Glc的純度測試結(jié)果；(3)表示實施例1得到的HB0A-Glc的純度 測試結(jié)果；(4)表示實施例2第一步得到的混合物中兩種化合物的HP1X色譜圖；(5)表示實施 例2得到的DIB0A-Glc的純度測試結(jié)果；(6)表示實施例2得到的HB0A-Glc的純度測試結(jié)果。
具體實施例方式
以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
實施例中所采用的有機(jī)試劑均為天津百世公司生產(chǎn)，分析純，HPLC用甲醇、乙腈為默克 公司生產(chǎn)(德國)，氨水(25 28%氨溶液)購自廣州試劑公司。 實施例1:
將老鼠簕地上部分lkg干燥后粉碎，使用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(5000 mL)室溫下提取3次， 提取液蒸干后混懸于水中，加入石油醚萃取，分層后分離有機(jī)相(重復(fù)3次)，在水相中加入 乙酸乙酯萃取，分層后，分離有機(jī)相(重復(fù)3次)，在水相中加入正丁醇萃取，分離有機(jī)相(重 復(fù)3次)，有機(jī)相在真空下蒸去溶劑后得正丁醇萃取物40g儲存于4'C備用，該正丁醇萃取物 的HPLC分析色譜圖見圖4 (1)。
將乙酸乙酯，正丁醇和O. 5%氨水按體積比2:3:5混合，得到溶劑系統(tǒng)1000mL，溶劑在混 合后在室溫下充分平衡，兩相在使用前分離。取100mg正丁醇萃取物樣品溶解于8mL上述溶 劑系統(tǒng)中，上下相各4mL，制成樣品溶液。將剩余的溶劑系統(tǒng)的上相充滿TBE-300A型高速逆流色譜儀(同田生化)的自平衡的螺旋 管路(管路的聚四氟乙烯管路的內(nèi)徑為2mm，柱體積為250raL,管路的自轉(zhuǎn)軸與公轉(zhuǎn)軸之間的距 離(y )為9.5cm,色譜儀的》值從管路內(nèi)層的0.46到管路外層的0.73，》=r/《r為管路 到自轉(zhuǎn)軸的距離。系統(tǒng)還配備一臺TBP-50型恒流泵(同田生化)， 一臺LC757UV型紫外檢測 器和流通池(上海匯興儀器公司)，HX-1050型恒溫控制器(北京德天友儀器公司)，和N2010 色譜工作站(浙江大學(xué))。
當(dāng)螺旋管路旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到850 r/min后，從螺旋管路的首端以2. OmL/min的流速泵注入 剩余的溶劑系統(tǒng)的下相。當(dāng)澄清的流動相從尾端流出，標(biāo)志達(dá)到流體力學(xué)平衡后，通過進(jìn)樣 闊從螺旋管路首端注入樣品。尾端流出的洗脫液用紫外光譜儀在254nm的波長檢測，在保留 時間125 145min收集到化合物(1)6. 3mg，純度92%,保留時間100 105min.收集到化合物 (2) 6. 8mg,純度80%。經(jīng)檢測化合物波譜數(shù)據(jù)如下
化合物(1) : UV (MeOH) Amax 251. 1 nm; , (500 MHz， MeOH-oQ : ". 77 ( s， H-2), 6.95 (m, H-5)， 7.05 (m, H—6, 7)， 7.11 (m， H-8), 3.21 ( dd, ,8.2， 8.3 Hz, H—2')， 3.32—3.40 (m, H—3'，4',5, )， 3.87 (dd, ,12.0, 2. 5 Hz， H—6'), 3.70 (dd, ,11.9， 4.7 Hz' H-6'); "C醒R (125 MHz' MeOH-oQ : ^ 96. 5 (C-2)， 163.2 (C-3)， 116.9 (C-5), 125.1 (C—6)， 124.2 (C—7)， 119.1 (C—8)， 142.2 (C-9)， 127.2 (C—10)， 104.0 (C-1'), 74.9 (C—2')， 78.5 (C-3')， 71.2 (C-4')， 78.0 (C-5，)， 62.4 (C-6');
化合物(2) : UV (Me0H) Jraax 254.6 run; 'H剛R (500 MHz, MeOH-必)tf 5. 96 ( s， H_2), 7.38 (m， H—5), 709-7.16 (m， H_6， 7， 8)， 3.20 ( dd， ,8.2， 8.2 Hz, H—2'), 3.32-3.40 (m， H-3',4',5'),3.87 (dd,戶12. 0, 2. 5 Hz， H-6'), 3.69 (dd， ,11.9, 4. 7 Hz， H-6'); 13C NMR (125 MHz, MeOH-^ ): J 97.8 (C-2), 158.3 (C-3), 114.3 (C_5), 125.8 (C-6)， 124.3 (C-7)， 118.7 (C-8)， 142.5 (C-9)， 129.3 (C—10), 103.8 (C—1')， 74.9 (C—2')， 78.6 (C-3'), 71.1 (C-4')， 78.0 (C-5，)， 62.6 (C-6')。
上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道相符，可確認(rèn)產(chǎn)物化合物l為式(l)表示的化合物，其中R表示H， 即(2W) -2-0--葡萄糖基-2H-l， 4-苯并噁唑嗪-3(4H)-酮(HB0A-Glc)和化合物2為 式(l)表示的化合物，其中R表示0H， g卩葡萄糖基-4-羥基-2H-1， 4-苯并 噁唑嗪-3(4H)-酮(DIB0A-Glc)。上述分離過程記錄的高速逆流色譜圖見圖3，分析化合物(l) 和(2)純度的HPLC譜圖見分別見圖4 (3)和(2)。
實施例2:
將老鼠簕地上部分lkg干燥后粉碎，使用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(5000 mL)室溫下提取3次, 提取液蒸干后混懸于水中，加入石油醚萃取，分層后分離有機(jī)相(重復(fù)3次)，在水相中加入 乙酸乙酯萃取，分層后，分離有機(jī)相(重復(fù)3次)，在水相中加入正丁醇萃取，分離有機(jī)相(重復(fù)3次)，有機(jī)相在真空下蒸去溶劑后得正丁醇萃取物40g儲存于4'C備用，該正丁醇萃取物 的HPLC分析圖見圖4 (1)。
第一步:將乙酸乙酯，正丁醇和水按體積比2:3:5混合，得到溶劑系統(tǒng)10000mL，溶劑在 混合后在室溫下充分平衡，兩相在使用前分離。取160(kg正丁醇萃取物樣品溶解于120mL溶 劑系統(tǒng)中，上下相各60mL，制成樣品溶液。
將剩余的溶劑系統(tǒng)的上相充滿TBE-5000A型高速逆流色譜儀(同田生化)的自平衡的螺 旋管路(總柱體積為5000mL，最大進(jìn)樣量為200mL)。系統(tǒng)還配備一臺TBP-50型恒流泵(同田 生化)， 一臺LC757UV型紫外檢測器和流通池(上海匯興儀器公司)，HX-1050型恒溫控制器 (北京德天友儀器公司)，和N2010色譜工作站(浙江大學(xué))。
當(dāng)螺旋管路旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到550rpm后，從螺旋管路的首端以20. OmL/min的流速泵注入剩 余的溶劑系統(tǒng)的下相。當(dāng)澄清的流動相從尾端流出，標(biāo)志達(dá)到流體力學(xué)平衡后，通過進(jìn)樣閥 注入樣品。尾端流出的洗脫液用紫外光譜儀在254nm的波長檢測，在115 130min收集目標(biāo) 流分，得到化合物1和化合物2的混合物，上述分離過程記錄的高速逆流色譜圖見圖2，所 得兩個化合物的混合物的HPLC分析圖譜見圖4 (4)。
第二步:將乙酸乙酯，正丁醇和iy。氨水溶液按體積比5:6:10混合，得到溶劑系統(tǒng)10000mL， 溶劑在混合后在室溫下充分平衡，兩相在使用前分離。將第一步得到的混合物蒸干后溶解于 120mL溶劑系統(tǒng),上下相各60mL，制成樣品溶液。
將剩余的溶劑系統(tǒng)的上相充滿高速逆流色譜儀的自平衡的螺旋管路，當(dāng)螺旋管路旋轉(zhuǎn)速 度達(dá)到850 r/min后，從螺旋管路的首端以20. OmL/min的流速泵注入剩余的溶劑系統(tǒng)的下相。 當(dāng)澄清的流動相從尾端流出，標(biāo)志達(dá)到流體力學(xué)平衡后，通過進(jìn)樣闊注入樣品。尾端流出的 洗脫液用紫外光譜儀在254nm的波長檢測，在保留時間130 145min收集得到化合物1 116mg， 純度97. 1%，保留時間103 112min收集到化合物2， 86mg,純度94. 8%。經(jīng)檢測化合物波譜 數(shù)據(jù)同實施例l，確認(rèn)產(chǎn)物化合物l為式(l)表示的化合物，其中R表示H，化合物2為式(1) 表示的化合物，其中R表示OH。上述分離過程記錄的高速逆流色譜圖見圖3，分析化合物(1) 和(2)純度的HPLC譜圖分別見圖4 (6)和(5)。
權(quán)利要求
1.一種從老鼠簕(Acanthus ilicifolius L.)中分離出下述式(1)表示的化合物的方法式(1)式中R表示H或OH，是以溶劑系統(tǒng)的上相充滿高速逆流色譜儀的管路，管路旋轉(zhuǎn)后再將溶劑系統(tǒng)的下相泵入管路，當(dāng)澄清的流動相從管路尾端流出后，通過進(jìn)樣閥注入樣品溶液，接收管路尾端流出的洗脫液，用紫外光譜儀檢測，根據(jù)色譜峰收集產(chǎn)物，其特征是所述的溶劑系統(tǒng)由a，b，c三組分按體積比2～5∶3～6∶5～10組成，其中a組分是乙酸乙酯或乙酸丙酯或乙酸異丙酯，b組分是正丁醇或異丁醇或戊醇，c組分是水或體積分?jǐn)?shù)0.5％～1.0％氨水溶液，所述的樣品溶液是將老鼠簕用乙醇提取后，真空條件下蒸干提取液，將提取物混懸于水中，依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取，將得到的正丁醇萃取物溶解于與上述管路中的溶劑系統(tǒng)組成相同的溶劑系統(tǒng)中得到，所述的紫外光譜儀檢測的波長是254nm，所述的產(chǎn)物是式(1)表示的化合物，其中R表示H或OH，當(dāng)所述溶劑系統(tǒng)的c組分是氨水溶液時，得到的產(chǎn)物是已分離的兩個化合物，其中R＝H的化合物的保留時間是125～145min，R＝OH的化合物的保留時間是100～105min；當(dāng)溶劑系統(tǒng)的c組分是水時，得到的產(chǎn)物是兩個化合物的混合物，保留時間是115～130min，再按上述的步驟重復(fù)進(jìn)行一次，只是所述溶劑系統(tǒng)的c組分為體積分?jǐn)?shù)0.5％～1.0％氨水，將上述得到的兩個化合物的混合物溶解在所述溶劑系統(tǒng)中做成樣品溶液，最后收集到已分離的兩個化合物，其中R＝H的化合物的保留時間是130～145min，R＝OH的化合物的保留時間是103～112min。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種從老鼠簕中分離出苯并噁唑嗪酮苷類化合物的方法，其特 征是所述的高速逆流色譜儀的柱體積是250 5000mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從老鼠簕(Acanthus ilicifolius L.)中分離出式(1)表示的苯并噁唑嗪酮類化合物(R為H或OH)的方法，其特征是將由a，b，c三組分按體積比2～5∶3～6∶5～10組成的溶劑系統(tǒng)的上相作為固定相，下相作為流動相，其中a組分是乙酸乙酯或乙酸丙酯或乙酸異丙酯，b組分是正丁醇或異丁醇或戊醇，c組分是水或氨水溶液，將老鼠簕的正丁醇萃取物溶解在上述溶劑系統(tǒng)中做成樣品溶液，通過高速逆流色譜儀，以紫外光譜儀檢測，按色譜峰收集流分，得到式(1)的化合物，其中R表示H或OH。本發(fā)明可節(jié)省大量的有機(jī)溶劑，并且分離過程只需3～6小時，但得到的化合物純度都在80％以上，產(chǎn)物可直接應(yīng)用于色譜標(biāo)樣、藥理實驗或商業(yè)用途。
文檔編號C07H1/08GK101318981SQ20081002953
公開日2008年12月10日 申請日期2008年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月17日
發(fā)明者浩 尹, 偲 張, 李慶欣, 羅雄明 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所