專利名稱：殼囊孢菌素b在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于紅樹植物內(nèi)生真菌-小穴殼菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3)的殼囊孢菌素B化合物在制備抗腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅樹林是生長在港灣河口地區(qū)的淤泥灘涂上的木本植物群落，作為獨(dú)特的海陸邊緣生態(tài)系統(tǒng)在自然生態(tài)平衡中起著特殊的作用。紅樹林植物不僅是重要的經(jīng)濟(jì)植物，也是民間常用的藥用植物，如紅樹植物老鼠簕(Acanthus ilicifolius)的樹皮熬汁可以用于治血尿；角果木(Ceriops tagal)的樹皮搗碎可以止血、通便和治療惡瘡，種子榨油可以止癢和治療癬，還可治療凍瘡等。
紅樹植物中存在著豐富的內(nèi)生真菌，有報(bào)道認(rèn)為紅樹植物的藥用成分都是由其內(nèi)生真菌產(chǎn)生的，不多的文獻(xiàn)(1、Brady，S.，Wagenaar，M.W.，Singh，M.，et al.The cytosporonesisolated from an endophytic fungus.Org.Lett.2000，2(25)4043-4046；2、Bandaranayake，W.M..Traditional and medicinal uses of mangroves.Mangroves and Salt Marshes，1998，2133-148；3、Bandaranayake，W.M..Bioactivities，bioactive compounds and chemicalconstituents of mangrove plants.Wetland Ecology and Management，2002，10421-452；4、Lin Y.，Wu X.，Deng z.，et al.The metabolites of the mangrove fungus Verruculina enalia No.2606 from a salt lake in the Bahamas.Phytochemistry，2002，59469-471)報(bào)道也已證明紅樹植物的內(nèi)生真菌確實(shí)可以產(chǎn)生具有新結(jié)構(gòu)和強(qiáng)的生理活性的化合物。但目前國內(nèi)外在這方面的工作才剛剛開始，為此其研究具有較高的理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于紅樹植物內(nèi)生真菌(cytosporone B)的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所用的紅樹植物內(nèi)生真菌-小穴殼菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號為CCTCC NOM203067，保藏日期為2003年8月29日。
本發(fā)明所說的殼囊孢菌素B(cytosporone B)化合物的結(jié)構(gòu)式為 (3，5-二羥基-2-辛酮基)-苯乙酸乙酯所說的殼囊孢菌素B化合物可采用以下的制備方法1)內(nèi)生真菌(Dothiorella sp.HTF3)的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基以g為單位，馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，在過濾后的濾液中加葡萄糖1～3，瓊脂1.5～2.0，海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，室溫下培養(yǎng)5～15天；2)內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以g為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，在過濾后的濾液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫下培養(yǎng)5～15天；3)將上述發(fā)酵培養(yǎng)液過濾除去發(fā)酵液后得到菌體；4)菌體烘干，用乙酸乙酯反復(fù)浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進(jìn)行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時(shí)的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
所得該化合物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為無色油狀物；EMSm/z(rel.int.)323.3[M+H]+(100)，345.3[M+Na]+(11.4)，361.2[M+K]+(4.2)；1H NMR和13C NMR(400MHz，CDCl3，ppm)見表1。
本發(fā)明所說的一類來源于紅樹林內(nèi)生真菌的殼囊孢菌素B化合物對多種人體腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的抑制作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
表1.殼囊孢菌素B的NMR數(shù)據(jù)

具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例給出所說的殼囊孢菌素B化合物的制備方法。
1)內(nèi)生真菌的種子培養(yǎng)將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖1g，瓊脂1.6g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，25℃下培養(yǎng)10天；2)內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖1.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃下培養(yǎng)8天；3)將上述發(fā)酵培養(yǎng)液過濾除去發(fā)酵液后得到菌體；4)菌體烘干，用乙酸乙酯反復(fù)浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進(jìn)行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時(shí)的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
本發(fā)明所說的殼囊孢菌素B化合物可用于制備抗腫瘤藥物，其抗腫瘤活性檢測實(shí)驗(yàn)如下1)腫瘤細(xì)胞株人B淋巴瘤Raji細(xì)胞、人口腔皮樣癌KB細(xì)胞、入成骨肉瘤MG-63細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人宮頸癌hela細(xì)胞等。
2)材料a MTT(噻唑藍(lán))用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到終濃度5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃避光保存；b SDS裂解液100g十二烷基磺酸鈉(SDS)，1N HCL10ml，加熱溶解，蒸餾水定容至1000ml。
c細(xì)胞培養(yǎng)基(全培)一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)細(xì)胞培養(yǎng)基溶于1L雙蒸水中；加入2gNaHCO3攪勻溶解后封口，置于4℃過夜，以自然沉淀除去雜質(zhì)；次日加入10％-15％已滅活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混勻后用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。
3)化合物cytosporone B的配置取一定量的殼囊孢菌素B，用甲醇溶解并調(diào)整濃度為5mg/ml，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)a細(xì)胞活化取一干凈燒杯，裝入干凈溫水，水溫調(diào)至37～40℃；將凍存管從液氮中取出迅速投入溫水解凍，并將凍存細(xì)胞接入預(yù)裝有細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液、分瓶。
b細(xì)胞計(jì)數(shù)選對數(shù)生成期細(xì)胞，胰酶消化，移入離心管中，加全培至10ml，取一滴滴入計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽中，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml。
c活性檢測①96孔板在超凈工作臺內(nèi)紫外光下照射1h；②在各孔中加入細(xì)胞懸液80μl，37℃、5％ CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)24h；③加入20μl用全培梯度稀釋成一系列濃度的溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h；④每孔加入MTT溶液10μl，輕輕震搖使顆粒溶解，37℃放置3h；⑤取出培養(yǎng)板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解過夜；⑥用酶聯(lián)反應(yīng)儀570nm測定各孔吸光值(參比波長為655nm)，按下列公式計(jì)算抑制率
抑制率＝(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對照組OD值×100％⑦以抑制率為縱坐標(biāo)，受試樣品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，求出抑制率為50％時(shí)的濃度即為IC50。
d試驗(yàn)結(jié)果Cytosporone B對人B淋巴瘤Raji細(xì)胞、人口腔皮樣癌KB細(xì)胞、人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人宮頸癌hela細(xì)胞的IC50分別是62.5ng/ml、4μg/ml、1μg/ml、4μg/ml和1μg/ml。
權(quán)利要求
1.殼囊孢菌素B化合物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
涉及一種來源于紅樹植物內(nèi)生真菌—小穴殼菌HTF
文檔編號A61P35/00GK1720910SQ20051008567
公開日2006年1月18日 申請日期2003年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月8日
發(fā)明者徐慶妍, 黃耀堅(jiān), 鄭忠輝, 宋思揚(yáng), 蘇文金 申請人:廈門大學(xué)