專利名稱：：先天免疫的效應(yīng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及肽.更具體地，涉及作為治療有效的肽，和有效地用于與微生物感染引起的病理相關(guān)的藥物丌發(fā)和有效地調(diào)節(jié)先天免疫或抗炎活性的肽。
背景技術(shù)：
：感染性疾病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因。根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織的研究，每年有超過(guò)1.3千萬(wàn)人死于感染性疾病。在北美，感染性疾病是導(dǎo)致死亡的第三大禍?zhǔn)?，每年?0%的死亡歸咎于感染性疾病，而且自1980年以來(lái)它就以50%的速度遞增。許多藥物治療和手術(shù)治療成功的關(guān)鍵也都在于對(duì)感染性疾病的控制。抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用己經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重大成就之一。沒(méi)有抗生素，醫(yī)生就無(wú)法開(kāi)展復(fù)雜的手術(shù)、化療和大多數(shù)醫(yī)學(xué)干預(yù)，例如導(dǎo)管插入術(shù)(catheterization)。目前，抗生素在世界范圍內(nèi)的銷售量為260億美元。然而，抗生素的濫用和某些不正當(dāng)應(yīng)用已經(jīng)導(dǎo)致進(jìn)化出對(duì)抗生素具有抗性的新菌株?？股乜剐砸呀?jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)組成部分。不能用抗生素對(duì)付一些細(xì)菌，如具有萬(wàn)古霉素抗性的腸球菌，VRE和具有甲氧苯青霉素(methicillin)抗性的葡萄球菌，MRSA菌株，于是，被這些細(xì)菌感染的病人常常就會(huì)死去。對(duì)于新藥開(kāi)發(fā)來(lái)說(shuō)，抗生素的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為最困難的領(lǐng)域之一，許多大的制藥公司已經(jīng)削減或者完全停止了它們的抗生素開(kāi)發(fā)項(xiàng)目。然而，隨著抗生素抗性問(wèn)題的急劇增漲，包括不能被治療的感染性疾病的出現(xiàn)，對(duì)新型抗微生物療法的醫(yī)學(xué)需求顯然未能得到滿足，對(duì)先天免疫能夠產(chǎn)生影響的制劑將成為這樣的一類制劑之一。先天免疫系統(tǒng)是極為有效的、高度進(jìn)化的普遍的防御系統(tǒng)。先天免疫的要素(dements)總是低水平地存在，當(dāng)受到刺激時(shí)，它們能非?？焖俚乇患せ?。刺激包括細(xì)菌信號(hào)傳導(dǎo)分子和身體細(xì)胞表面的譜型識(shí)別受體間的相互作用，或其它致病機(jī)理。每天，人類都要通過(guò)各位所消化的食物和水分、各位所呼吸的空氣、各位所觸摸到的物體表面、寵物和人，接觸到成千上萬(wàn)的潛在的病原微生物。先天免疫便發(fā)揮作用以防止這些病原體引起疾病的發(fā)生。先天免疫系統(tǒng)不同于所謂的適應(yīng)性免疫(它包括抗體和抗原特異性B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞)，因?yàn)榍罢呖偸谴嬖诘模芰⒖坍a(chǎn)生效應(yīng)，并且對(duì)于任何特定的病原體都是相對(duì)非特異性的。適應(yīng)性免疫要求放大特定的識(shí)別要素(recoginationelements),因此需要數(shù)天至數(shù)周才能發(fā)生響應(yīng)。即便用疫苗接種預(yù)先刺激了適應(yīng)性免疫，它也可能需要三天或者更長(zhǎng)時(shí)間對(duì)一種病原體作出反應(yīng)，然而，先天免疫可以立刻或很快地(數(shù)小時(shí))地進(jìn)行反應(yīng)。先天免疫涉及各種效應(yīng)物功能，包括吞噬細(xì)胞、補(bǔ)體等等，但是尚未被完全理解。一般說(shuō)來(lái)，許多先天免疫響應(yīng)都是由微生物信號(hào)傳導(dǎo)分子結(jié)合到宿主細(xì)胞表面上的譜型識(shí)別受體而"觸發(fā)"的，該譜型識(shí)別受體稱之為Toll樣受體。在炎癥反應(yīng)中，有許多這樣的效應(yīng)物功能(effectorfimction)聚集到一起。然而，一個(gè)太劇烈的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致對(duì)身體有害的反應(yīng)，在極端的情況中可能出現(xiàn)膿毒癥，以及很可能死亡。在感染過(guò)程中，結(jié)構(gòu)性組分從感染原(infectiousagents)上釋放出來(lái)，導(dǎo)致炎癥應(yīng)答，當(dāng)它未受到抑制時(shí)，則有可能導(dǎo)致潛在的致死狀況，膿毒癥。在北美每年有大約780,000例膿毒癥患者。膿毒癥的發(fā)生可能是在社區(qū)獲得的傳染病如肺炎導(dǎo)致的結(jié)果，也可能是治療外傷、癌癥或大外科時(shí)的并發(fā)癥。當(dāng)身體完全無(wú)法控制炎癥應(yīng)答時(shí)，便會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的膿毒癥，身體器官開(kāi)始失去機(jī)能。在北美每年有多達(dá)120,000人死于膿毒癥。膿毒癥也可能涉及病原微生物或血液中的毒素(例如，敗血癥)，它是人類死亡的一個(gè)主要原因。革蘭氏陰性細(xì)菌是與這類疾病聯(lián)系最為普遍的生物。然而，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也在越來(lái)越多地引起感染病。革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以及它們的組分都能導(dǎo)致膿毒癥。微生物組分的存在引起促炎細(xì)胞因子的釋放，在這些促炎細(xì)胞因子中，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)是極其重要的。TNF-a和其它促炎細(xì)胞因子又能夠?qū)е缕渌傺捉橘|(zhì)(pro-inflammatorymediator)的釋放并導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)(pro-inflammatorycascade)。革蘭氏陰性膿毒癥通常是由細(xì)菌外膜組分，脂多糖(LPS,也被稱為內(nèi)毒素)的釋放引起的。血液中的內(nèi)毒素，被稱為內(nèi)毒素血癥(endotoxemia)，它主要來(lái)自于細(xì)菌感染，可以在抗生素治療過(guò)程中被釋放。革蘭氏陽(yáng)性膿毒癥可由細(xì)菌的細(xì)胞壁組分的釋放引起，這些細(xì)胞壁組分例如脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG)、由鏈球菌產(chǎn)生的鼠李糖-葡萄糖聚合物，或由葡萄球菌產(chǎn)生的莢膜多糖。不同于哺乳動(dòng)物DNA，細(xì)菌或其他非哺乳動(dòng)物的DNA含有高頻率的未甲基化的胞嘧啶-鳥(niǎo)苷二聚體(CpGDNA),已經(jīng)表明細(xì)菌或其他非哺乳動(dòng)物的DNA也能引發(fā)膿毒癥狀況，包括TNF-a的產(chǎn)生。哺乳動(dòng)物DNA含有CpG二核苷酸的頻率要低得多，它們常常是甲基化的形式。除了在細(xì)菌感染過(guò)程中它們的自然釋放，抗生素治療也能導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁組分LPS和LTA的釋放，而且也可能導(dǎo)致細(xì)菌DNA的釋放。這可能阻礙從感染痊愈，或者甚至導(dǎo)致膿毒癥。人們不斷認(rèn)識(shí)到陽(yáng)離子肽(cationicpeptides)可以作為防御感染的一種形式，盡管在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中，它的主要效果被認(rèn)為是抗微生物的效果(Hancock,R.E.W.，禾口R.Lehrer.1998Cationicpeptides:anewsourceofantibiotics.TrendsinBiotechnology^82-88)。具有抗微生物活性的陽(yáng)離子肽已經(jīng)從多種生物中分離出來(lái)。事實(shí)上，這些肽提供了一種防御微生物例如細(xì)菌和酵母的機(jī)制。一般地，認(rèn)為這些陽(yáng)離子肽與細(xì)胞質(zhì)膜相互作用，而且在大多數(shù)情況下，會(huì)形成通道和損傷，由此對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生抗微生物活性。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，它們和LPS作用，使外膜具有可通透性，由此導(dǎo)致自促式的穿透外膜的吸收，并到達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜。陽(yáng)離子抗微生物肽的例子包括indolicidin(來(lái)自牛嗜中性細(xì)胞的抗微生物多肽)、防御素(defensins)、殺菌肽(cecropins)禾口爪蟾抗菌肽(magainins)。最近，已經(jīng)逐漸認(rèn)識(shí)到，在先天免疫的其它方面，這些肽可以作為效應(yīng)物(Hancock,R.E.W.禾口GDiamond.2000.Theroleofcationicpeptidesininnatehostdefenses.TrendsinMicrobiology多402-410.;Hancock,R.E.W.2001.Cationicpeptides:effectorsininnateimmunityandnovelantimicrobials.LancetInfectiousDiseases];156-164),盡管還不知道該抗微生物功能和效應(yīng)物功能是否有關(guān)?！╆?yáng)離子肽具有能夠結(jié)合細(xì)菌產(chǎn)物如LPS和LTA的吸附作用。在對(duì)LPS的應(yīng)答中，這些陽(yáng)離子肽能夠抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此能夠在一定程度上防止致死性休克。然而，還沒(méi)有證明，這些效果是由于該肽結(jié)合到LPS和LTA上，還是由于該肽和宿主細(xì)胞的直接作用。在對(duì)微生物或微生物信號(hào)分子如LPS的攻擊產(chǎn)生應(yīng)答時(shí)，陽(yáng)離子肽通過(guò)與由哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)使用的調(diào)控路徑相類似的調(diào)控路徑被誘導(dǎo)(涉及Toll樣受體和轉(zhuǎn)錄因子NFKB)。由此看來(lái)，陽(yáng)離子肽在先天免疫中具有關(guān)鍵的作用。影響抗細(xì)菌肽的誘導(dǎo)的突變能夠降低對(duì)細(xì)菌攻擊進(jìn)行應(yīng)答時(shí)的生存者。同樣，當(dāng)果蠅的Toll路徑發(fā)生可導(dǎo)致抗真菌肽表達(dá)降低的突變時(shí)，也就增加了對(duì)致死性真菌感染的敏感性。對(duì)于人類，患有顆粒體缺乏綜合癥的病人完全缺乏a-防御素，會(huì)患上頻繁的和嚴(yán)重的細(xì)菌感染疾病。其它證據(jù)包括一些肽可由傳染原(infectiousagents)誘導(dǎo)，以及已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在炎癥發(fā)生處這些肽的濃度相當(dāng)高。陽(yáng)離子肽也可以調(diào)控細(xì)胞遷移，以促進(jìn)白細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的能力。例如，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，兩種人a-防御素多肽，HNP-l和HNP-2，對(duì)鼠和人的T細(xì)胞和單核細(xì)胞具有趨化活性，而且，人e-防御素似乎能夠通過(guò)和CCR6作用，而對(duì)未成熟樹(shù)突細(xì)胞和記憶T細(xì)胞起到化學(xué)引誘物(chemoattractants)的作用。類似地，發(fā)現(xiàn)豬的陽(yáng)離子肽PR-39對(duì)嗜中性粒細(xì)胞具有趨化作用。然而，具有不同結(jié)構(gòu)和組成的肽是否共有這些性質(zhì)仍不清楚。LL-37是唯一已知的來(lái)自人的cathelicidin(—種具強(qiáng)有力膜活性的抗微生物肽類的前體)，它是由骨髓前體、睪丸、炎癥疾病期間的人角化細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生。Cathelicidin肽的特征是在稱之為cathelin結(jié)構(gòu)域的N端前體區(qū)域(preproregion)具有相當(dāng)高比例的序列同一性。Cathelicidin肽作為未活4七的前肽前體被貯存起來(lái)，一旦受到刺激，它便被加工成為活性肽(activepeptides)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是基于如下開(kāi)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)可以基于受內(nèi)毒性的脂多糖、脂磷壁酸、CpGDNA或其它細(xì)胞成分(例如微生物或它們的細(xì)胞成分)調(diào)節(jié)，而又被陽(yáng)離子肽影響的多聚核苷酸表達(dá)譜型，篩選出可阻斷或降低個(gè)體的膿毒癥和/或炎癥的新穎化合物。而且，在使用陽(yáng)離子肽作為工具的基礎(chǔ)上，能夠鑒定出先天免疫的選擇性強(qiáng)化劑，它們不會(huì)引起膿毒癥反應(yīng)，卻能夠阻斷/抑止炎癥和/或膿毒癥應(yīng)答。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定多聚核苷酸或多聚核苷酸譜型的方法，這些多聚核苷酸受一種或多種膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)，同時(shí)受陽(yáng)離子肽抑制。本發(fā)明的方法包括將一種或多種多聚核苷酸與一種或多種膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物接觸，并同時(shí)或隨后立即將該種或該多種多聚核苷酸與陽(yáng)離子肽接觸。檢測(cè)在陽(yáng)離子肽存在時(shí)和陽(yáng)離子肽不存在時(shí)的表達(dá)差異，在表達(dá)上的變化，或者是增量調(diào)節(jié)(up-regulation)或者是減量調(diào)節(jié)(down-regulation),可以作為受膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)同時(shí)又受陽(yáng)離子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸譜型的標(biāo)志。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了由上述方法鑒定的一種或多種多聚核苷酸。膿毒癥或炎癥調(diào)節(jié)物包括LPS、LTA或CpGDNA或微生物成分(或它們的任意組合)，或相關(guān)試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定可阻止膿毒癥或炎癥的試劑的方法，包括將由前述方法鑒定出的多聚核苷酸與一種試劑進(jìn)行組合，其中，與不存在該試劑時(shí)相比較，在存在該試劑時(shí)該多聚核苷酸的表達(dá)受到了調(diào)節(jié)，并且在表達(dá)上的這種調(diào)節(jié)影響炎癥或膿毒癥應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)l)在存在或缺乏陽(yáng)離子肽的情況下，將細(xì)胞與LPS、LTA和/或CpGDNA接觸，和2)檢測(cè)在存在或缺乏該肽的情況下的多聚核苷酸表達(dá)譜型，提供了一種鑒定在炎癥或膿毒癥應(yīng)答受抑制時(shí)的多聚核苷酸表達(dá)譜型的方法。在該肽存在時(shí)獲得的譜型代表炎癥或膿毒癥應(yīng)答受到抑制。在另一個(gè)方面，將該肽存在時(shí)獲得的譜型與一種受測(cè)化合物存在時(shí)獲得的譜型相比較，從而鑒定出提供類似譜型的化合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了由前述方法鑒定的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定可強(qiáng)化先天免疫的試劑的方法，包括將編碼涉及先天免疫的多肽的一種或多種多聚核苷酸與感興趣的試劑接觸，其中，與不存在該試劑時(shí)相比較，在存在該試劑時(shí)該多聚核苷酸的表達(dá)被調(diào)節(jié)，并且該被調(diào)節(jié)的表達(dá)導(dǎo)致先天免疫的強(qiáng)化。優(yōu)選地，該試劑并不刺激個(gè)體內(nèi)的膿毒癥反應(yīng)。在一個(gè)方面，該試劑增加抗炎癥的多聚核苷酸的表達(dá)。示例性但非限制性的抗炎多聚核苷酸編碼的蛋白例如IL-1R拮抗劑同源物1(AI167887)、IL-10RP(AA486393)、IL匿IORa(U00672)、TNF受體成員1B(AA150416)、TNF受體成員5(H98636)、TNF受體成員lib(AA194983)、HLAII的IK細(xì)胞因子減量調(diào)節(jié)物(R39227)、TGF-B誘導(dǎo)性早期生長(zhǎng)應(yīng)答蛋白2(AI473938)、CD2(AA927710)、IL-19(畫—013371)或IL-IO(M57627)。在一個(gè)方面，該試劑降低編碼涉及NK-zc"B激活的蛋白酶體亞基例如蛋白酶體亞基26S(NM—013371)的多聚核苷酸的表達(dá)。在一個(gè)方面，該試劑可以作為蛋白激酶的拮抗劑。在一個(gè)方面，該試劑是選自SEQIDNO:4-54的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定多聚核苷酸表達(dá)譜型以鑒定可選擇性地強(qiáng)化先天免疫的化合物的方法。本發(fā)明包括檢測(cè)在有陽(yáng)離子肽接觸時(shí)和無(wú)陽(yáng)離子肽接觸時(shí)細(xì)胞的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其中，在該肽存在時(shí)的譜型代表刺激先天免疫；檢測(cè)在有一種受測(cè)化合物接觸時(shí)細(xì)胞的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其中，如果使用該受測(cè)化合物時(shí)的譜型與在該陽(yáng)離子肽存在時(shí)觀察到的譜型相類似，則表示該受測(cè)化合物可強(qiáng)化先天免疫。優(yōu)選的是，該化合物并不剌激個(gè)體內(nèi)的膿毒癥反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由一哺乳動(dòng)物個(gè)體的核酸樣品推斷該個(gè)體的感染狀態(tài)的方法，該方法是依靠于確定該核酸樣品中的多聚核苷酸表達(dá)譜型，例如與未感染的個(gè)體相比，表50、51和/或52中的至少兩種多聚核苷酸的表達(dá)量增加。還包括由上述任一方法獲得的多聚核苷酸表達(dá)譜型。在另一個(gè)方面，提供了作為CXCR4的拮抗劑的陽(yáng)離子肽。仍然在另一個(gè)方面，提供了鑒定作為CXCR-4的拮抗劑的陽(yáng)離子肽的方法，包括在受測(cè)肽存在或不存在的情況下將T細(xì)胞和SDF-I接觸，并測(cè)量趨化性。如果在受測(cè)肽存在時(shí)趨化性降低，則表明該肽是CXCR-4的拮抗劑。陽(yáng)離子肽也可以起到降低SDF-1受體多聚核苷酸(NM—013371)的表達(dá)的作用。在上述所有方法中，本發(fā)明的化合物或試劑包括但不限于肽(peptides)、陽(yáng)離子肽(cationicpeptides)、肽模擬物(peptidomimetics)、化學(xué)化合物(chemicalcompounds)、多肽(polypeptides)、核酸分子(nudeicacidmolecules)禾Q類似物。仍然在另一方面，本發(fā)明提供了被分離的陽(yáng)離子肽。本發(fā)明的被分離的陽(yáng)離子肽可用下列任一通式和單字母氨基酸記號(hào)表示XiXzXsD^PXOPXsXzXi(SEQIDNO:4)，其中&是一個(gè)或兩個(gè)R、L或K，X2是一個(gè)C、S或A,X3是一個(gè)R或P,Xf是一個(gè)A或V，Xs是一個(gè)V或W;X,LX2X3KX4X2XsX3PX3X,(SEQIDNO:11)，其中Xi是一個(gè)或兩個(gè)D、E、S、T或N，X2是一個(gè)或兩個(gè)P、G或D，X3是一個(gè)G、A、V、L、I或Y，X4是一個(gè)R、K或H，Xs是一個(gè)S、T、C、M或R;X,X2X3X4WX4WX4XsK(SEQIDNO:18)，其中X,是一至四個(gè)選自A、P或R的氨基酸，X2是一個(gè)或兩個(gè)芳香氨基酸(F、Y和W)，X3是一個(gè)P或K,X4是零至兩個(gè)選自A、P、Y或W的氨基酸，X5是一至三個(gè)選自R或P的氨基酸；X,X2X3X4X,VX3X4RGX4X3X4X,X3Xi(SEQIDNO:25)，其中X,是一個(gè)或兩個(gè)R或K,X2是一個(gè)極性的或帶電荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是C、S、M、D或A,X4是F、I、V、M或R;XiX2X3X4X!VX5X4RGX4XsX4XiX3Xi(SEQIDNO:32)，其中X,是一個(gè)或兩個(gè)R或K，X2是一個(gè)極的性或帶電荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是一個(gè)C、S、M、D或A，X4是一個(gè)F、I、V、M或R，Xs是一個(gè)A、I、S、M、D或R;禾口KX,KX2FX2KMLMX2ALKKX3(SEQIDNO:39),其中，X,是一個(gè)極性氨基酸(C、S、T、M、N和Q);X2是一個(gè)A、L、S或K，X]是1至17個(gè)選自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸KWKX2X,X^2X2X,X2X2X,X,X2X2lFHTALKPISS(SEQIDNO:46)，其中X,是一個(gè)疏水氨基酸，X2是一個(gè)親水氨基酸。此外，在另一方面本發(fā)明提供了被分離的陽(yáng)離子肽KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQIDNO:53)禾口KWKSYAHTMSPVRLVFHTALKPISS(SEQIDNO:54)。還提供了編碼本發(fā)明的陽(yáng)離子肽的核酸序列，包含這些多聚核苷酸的載體和含有這些載體的宿主細(xì)胞。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了可由一組通式表征的新穎的陽(yáng)離子多肽，它們能夠調(diào)節(jié)(例如，增量調(diào)控和/或減量調(diào)控)多聚核苷酸的表達(dá)，由此調(diào)控和炎癥應(yīng)答和/或先天免疫。在此使用的"先天免疫"是指一種生物防御病原體入侵、保護(hù)自己的先天具有的能力。在此使用的病原體或微生物可以包括，但不限于細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和病毒。先天免疫與獲得性/適應(yīng)性免疫不同，對(duì)于后者，生物主要是基于抗體和/或免疫淋巴細(xì)胞來(lái)發(fā)展自己的防御機(jī)制，其特征是特異性、可放大性和辨認(rèn)自身與非自身。先天免疫提供了廣泛的非特異性免疫，并且對(duì)于以前的暴露沒(méi)有免疫記憶。先天免疫的特點(diǎn)是能夠有效地抵抗廣范圍的各種潛在病原體，而不依賴于對(duì)一種病原體的先前接觸，先天免疫的另一個(gè)特點(diǎn)是能夠快速的生效(與特異性免疫應(yīng)答相比較而言，特異性免疫應(yīng)答的激發(fā)需要數(shù)天到數(shù)周的時(shí)間)。而且，先天免疫包括影響到其它疾病的免疫應(yīng)答，這些疾病例如癌癥、炎癥疾病、多發(fā)性硬化癥、各種病毒感染，等等。正如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)"陽(yáng)離子肽"是指約5到約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)的氨基酸序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明的陽(yáng)離子肽的長(zhǎng)度為約10到約35個(gè)氨基酸。如果一個(gè)肽具有足夠的JH電荷氨基酸，以致于pl大于約9.0,則認(rèn)為該肽是"陽(yáng)離子肽"，其中，pl(等電點(diǎn))-當(dāng)該肽的凈電荷是中性時(shí)的pH值。通常，該陽(yáng)離子肽的氨基酸殘基中至少有兩個(gè)是帶正電荷的，例如賴氨酸和精氨酸。"具正電荷"是指在pH7.0時(shí)具有凈的正電荷的氨基酸殘基側(cè)鏈。自然出現(xiàn)的陽(yáng)離子抗微生物肽的例子包括防御素、cathelicidins、爪蟾抗菌肽、峰毒肽(melittin)、殺菌肽、bactenecins(來(lái)自牛嗜中性粒細(xì)胞的抗微生物多肽)、indolicidins、polyphemusins、tachyplesins(來(lái)自馬蹄蟹血細(xì)胞的抗微生物多肽)，以及它們的類似物，這些自然出現(xiàn)的陽(yáng)離子抗微生物多肽可以依據(jù)本發(fā)明重組產(chǎn)生。許多生物都制造陽(yáng)離子肽，把這些分子作為抵抗微生物的非特異性防御機(jī)制的一部分來(lái)使用。分離出來(lái)的這些肽對(duì)廣范圍的各種微生物具有毒性，包括細(xì)菌、真菌和某些帶被膜的病毒。當(dāng)陽(yáng)離子肽對(duì)許多病原體發(fā)揮抵抗作用時(shí)，顯著的異常和不同程度的毒性是存在的。然而，本專利揭露了對(duì)微生物不具毒性卻能夠通過(guò)刺激先天免疫防御感染的其它陽(yáng)離子肽，并且本發(fā)明并不限于具有抗微生物活性的陽(yáng)離子肽。事實(shí)上，在本發(fā)明中使用的許多肽并沒(méi)有抗微生物活性。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的陽(yáng)離子肽包括，例如人cathelicindinlL-37、牛嗜中性細(xì)胞多肽indolicidin、以及牛bactenecin的變體，Bac2A。IL-37LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQID:1)IndolicidinILPWKWPWWPWRR-NH2(SEQIDNO:2)Bac2ARLARIVVIRVAR-NH2(SEQIDNO:3)在先天免疫中，免疫應(yīng)答并不依賴于抗原。先天免疫過(guò)程可以包括分泌性分子和前面提出的細(xì)胞組分的產(chǎn)生。先天免疫中，病原體由在生殖種系中編碼的受體識(shí)別。這些Toll樣受體具有廣泛的特異性，能夠識(shí)別許多病原體。當(dāng)陽(yáng)離子肽出現(xiàn)在免疫應(yīng)答中時(shí)，它們輔助宿主對(duì)病原體的應(yīng)答。在免疫應(yīng)答中的這種變化誘導(dǎo)趨化因子的釋放，趨化因子促使免疫細(xì)胞集中到感染發(fā)生的部位。趨化因子或化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞因子屬于一類免疫因子，它們介導(dǎo)趨化和其它促炎癥現(xiàn)象(參見(jiàn)，Schall，1991，'"e3:165-183)。趨化因子是長(zhǎng)度大約70-80殘基的小分子，通常被分為兩小類，具有由單個(gè)氨基酸隔開(kāi)的N端半胱氨酸(CxC)的a亞類，和在N端具有兩個(gè)相鄰半胱氨酸(CC)的P亞類。RANTES、MIP-Ia和MIP-1P屬于P亞類(參見(jiàn)綜述Horuk，R.,1994，IVemfaP/jcr/Twaco/.Sci，15:159-165;Murphy,P.M.,1994，Zw"m.及ev./附w柳o/.,12:593-633)。P型趨化因子RANTES、MCP-1和MCP-3的氨基末端關(guān)聯(lián)到介導(dǎo)細(xì)胞遷移和由這些趨化因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。這種關(guān)聯(lián)由實(shí)驗(yàn)觀察看出，剔除MCP-1氨基末端的8個(gè)殘基、MCP-3氨基末端的9個(gè)殘基和RANTES氨基末端的8個(gè)殘基，以及將一個(gè)甲硫氨酸增加到RANTES的氨基末端，會(huì)對(duì)其趨化性、鈣轉(zhuǎn)移和/或由它們的天然相似物刺激的酶釋放產(chǎn)生拮抗作用(Gong等，1996丄&W.C/iem.271:10521-10527;Proudfoot等，1996加oAC&em.271:2599-2603)。另夕卜，可以通過(guò)將Tyr28和Arg30通過(guò)雙突變變?yōu)榱涟彼岷屠i氨酸，將與a型趨化因子類似的趨化活性引入到MCP-1中，這表明該蛋白的內(nèi)部區(qū)域在調(diào)控趨化活性時(shí)也發(fā)揮著作用(Beall等，1992,/.fi/o/.CT^w.267:3455-3459)。迄今已獲表征的所有趨化因子的單體形式都具有明顯的結(jié)構(gòu)同源性，盡管a型和P型的四級(jí)結(jié)構(gòu)有所不同。e型和a型趨化因子的單體結(jié)構(gòu)非常類似，但是這兩種類型的二聚體結(jié)構(gòu)則完全不同。還鑒別出了另外一種趨化因子，淋巴細(xì)胞趨化因子(lymphotaetin)，它只有一個(gè)N端半胱氨酸，它代表了趨化因子的第三個(gè)亞家族(Y)(Yoshida等,1995，尸五5S丄"/.360:155-159;和Kelner等，1994.Sc/e"ce266:1395-1399)。趨化因子的受體屬于與G蛋白偶聯(lián)的具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的受體(GCR's)大家族(參見(jiàn)綜述Horuk,R.,1994，7Vemfo尸/zarm。co/.5W.15:159-165;禾卩Murphy，P.M.,1994,iev./w附w"o/.12:593-633)。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和交互失敏(cross-desensitization)研究已表明趨化因子受體在結(jié)合配體時(shí)具有明顯的混雜性。證明P趨化因子間的混雜性的例子包括CCCKR-1結(jié)合RANTES禾QMIP-1a(Neote等，1993,Ce〃72:415-425)，CCCKR-4結(jié)合RNATES、MIP-1a和MCP-1(Power等，C/zew.270:19495-19500)，以及CCCKR-5結(jié)合RNATES、MIP-1a和MIP-1P(Alkhatib等，1996，Sc/e"ce，inpress和Dragic等，1996，Waft/w381:667-674)。紅細(xì)胞具有一種能夠結(jié)合a和p趨化因子的受體(被稱為Duffy肌tigen(達(dá)菲抗原))(Horuk等，1994，傷o〖.C/jem.269:17730-17733;Neote等，1994,祝oo"4:44-52;和Neote等，1993,乂5/o/.CTew.268:12247-12249)。因此，趨化因子以及它們的受體間的明顯的序列和結(jié)構(gòu)同源性使得在受體-配體的相互作用中存在著重疊?！矫?，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的陽(yáng)離子肽在內(nèi)的化合物通過(guò)直接作用于宿主細(xì)胞而減少膿毒癥和炎癥應(yīng)答的應(yīng)用。在這一方面，一種鑒別被一種或多種膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物調(diào)控的多聚核苷酸的方法被提供，其中該調(diào)控被陽(yáng)離子肽改變。所述的膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物包括，但不限于內(nèi)毒性脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和/或CpGDNA或完整的細(xì)菌或其它細(xì)菌組分。該鑒別方法是依靠將多聚核苷酸與膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物接觸，并同時(shí)或隨后立即與陽(yáng)離子肽接觸。在存在陽(yáng)離子肽和缺少陽(yáng)離子肽時(shí)，對(duì)多聚核苷酸的表達(dá)進(jìn)行觀察，表達(dá)上的變化說(shuō)明該核苷酸或該類型的核苷酸受膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物的調(diào)控，并受陽(yáng)離子肽的抑制。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了由該方法鑒定的多聚核苷酸。這樣的多聚核苷酸一旦被鑒定出來(lái)，就可用于篩選能夠通過(guò)影響該多聚核苷酸的表達(dá)而阻止膿毒癥或炎癥的化合物。對(duì)表達(dá)的這種影響可以是表達(dá)的增量調(diào)控(upregulation)或減量調(diào)控(downregulation)。通過(guò)鑒定不激發(fā)膿毒癥反應(yīng)的化合物和能夠阻止或抑止炎癥或膿毒癥反應(yīng)的化合物，本發(fā)明還提出了一種鑒別先天免疫強(qiáng)化劑的方法。此外，本發(fā)明提供了在上述方法中使用和鑒別出的化合物。候選化合物從廣泛的來(lái)源獲得，包括各種合成化合物和天然化合物。例如，可以利用許多方法來(lái)隨機(jī)和定向合成出各種有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)寡聚核苷酸和寡聚多肽的表達(dá)。作為選擇，以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式存在的天然化合物的文庫(kù)(libraries)可被利用或方便地生產(chǎn)。此外，可以通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生化手段方便地修飾天然的或合成產(chǎn)生的文庫(kù)和化合物，也可利用這些文庫(kù)和化合物得到組合文庫(kù)(combinatoriallibraries).已知的藥理學(xué)的藥劑可以作定向或隨機(jī)的化學(xué)修飾，例如?；⑼榛?、酯化、酰胺化等等，從而得到結(jié)構(gòu)類似物(structuralanalogs)。候選試劑也可以從生物分子中找到，包括但不限于肽、肽模擬物(peptidiomimetics)、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、多肽、多聚核苷酸、化合物(chemicalcompounds)、衍生物(derivatives)、結(jié)構(gòu)類似物(structuralanalogs)或它們的組合(combinations)。篩選實(shí)驗(yàn)的溫育要素(components)包括允許受測(cè)化合物與感興趣的多聚核苷酸相互接觸的條件。接觸可以是在液相中、固相中，或者在細(xì)胞中。為了篩選出多個(gè)化合物，受測(cè)化合物可以選擇為組合文庫(kù)。依本發(fā)明的方法鑒定出的化合物可以通過(guò)在檢測(cè)化合物時(shí)通常使用的任何方法，在溶液中或者在結(jié)合到固體支持物之后，被進(jìn)一歩評(píng)估、檢測(cè)、克隆、測(cè)序等等?！愣裕诒景l(fā)明的方法中，利用陽(yáng)離子肽來(lái)檢測(cè)和定位在膿毒癥和炎癥過(guò)程中必需的多聚核苷酸。一旦被鑒定出來(lái)，就可以通過(guò)觀察其在陽(yáng)離子肽存在和缺乏時(shí)的表達(dá)來(lái)獲得多聚核苷酸的表達(dá)譜型(pattern)。在陽(yáng)離子肽存在的情況下獲得的譜型對(duì)于鑒定能夠抑制該多聚核苷酸的表達(dá)并由此阻止膿毒癥或炎癥的其它化合物又是很有用的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，己熟知的是，非肽類化合物和肽模擬物能夠模擬肽結(jié)合受體的能力和酶結(jié)合位點(diǎn)，并由此可被用來(lái)阻斷或激發(fā)生物反應(yīng)。當(dāng)一種感興趣的另外的化合物提供了與在陽(yáng)離子肽存在時(shí)相類似的多聚核苷酸表達(dá)譜型時(shí)，也可該應(yīng)用化合物來(lái)調(diào)節(jié)膿毒癥或先天免疫應(yīng)答。如此講來(lái)，本發(fā)明的陽(yáng)離子肽在作為膿毒癥和炎癥的已知抑制劑和先天免疫的已知強(qiáng)化劑的同時(shí)，也可用作鑒定抑制膿毒癥和炎癥和強(qiáng)化先天免疫的其它化合物的工具。正如在后面的實(shí)施例中看到的，本發(fā)明的肽具有廣泛的減少由LPS調(diào)控的多聚核苷酸表達(dá)的能力。在嚴(yán)重的感染或炎癥期間所看到的許多癥狀例如發(fā)燒和白血細(xì)胞數(shù)目升高都?xì)w咎于血液中的高水平內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種組分，它是膿毒癥在病理生理學(xué)上強(qiáng)有效的引發(fā)劑(trigger)。炎癥和膿毒癥的基本機(jī)制是相關(guān)聯(lián)的。在實(shí)施例1中，利用多聚核苷酸陣列來(lái)確定陽(yáng)離子肽對(duì)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的影響。特別地，觀察了對(duì)由LPS誘導(dǎo)的超過(guò)14,000個(gè)不同的特定多聚核苷酸的影響。表格顯示了用肽處理過(guò)的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比所見(jiàn)到的變化。得到的數(shù)據(jù)表明該肽具有降低由LPS誘導(dǎo)的多聚核苷酸表達(dá)的能力。類似地，實(shí)施例2說(shuō)明了本發(fā)明的肽能夠中和革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)物對(duì)免疫細(xì)胞的刺激。另外，注意到，某些促炎癥的多聚核苷酸受陽(yáng)離子肽的減量調(diào)節(jié)，這些陽(yáng)離子肽在表24中寫出，例如TLR1(AI339155)、TLR2(T57791)、TLR5(N41021)、TNF受體相關(guān)因子2(T55353)、TNF受體相關(guān)因子3(AA504259)、TNF受體超家族成員12(W71984)、TNF受體超家族成員17(AA987627)、小分子誘導(dǎo)性細(xì)胞因子亞家族B成員6(A1889554)、IL-12Re2(AA977194)、IL-18受體l(AA482489)，而抗炎癥的多聚核苷酸受陽(yáng)離子多肽的增量調(diào)節(jié)，這些陽(yáng)離子多肽在表25中寫出，例如IL-1R拮抗劑同源物1(AI167887)、IL-10RP(AA486393)、TNF受體成員1B(AA150416)、TNF受體成員5(H98636)、TNF受體成員lib(AA194983)、HLAII的IK細(xì)胞因子減量調(diào)節(jié)物(R39227)、可由TGF-B誘導(dǎo)的早期生長(zhǎng)應(yīng)答2(AI473938)或CD2(AA927710)。這些結(jié)果的適用性和應(yīng)用通過(guò)對(duì)鼠的體內(nèi)應(yīng)用證實(shí)。實(shí)施例3證明了這些肽對(duì)與之接觸的宿主細(xì)胞基本上不會(huì)產(chǎn)生毒性。在實(shí)施例4中可以看到，本發(fā)明的陽(yáng)離子肽可改變巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)。此實(shí)施例的結(jié)果說(shuō)明，促炎癥的多聚核苷酸受陽(yáng)離子肽的減量調(diào)節(jié)(down-regulated)(表24),而抗炎癥的多聚核苷酸受陽(yáng)離子肽的增量調(diào)節(jié)(up-regulated)(表25)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定可強(qiáng)化先天免疫的試劑的方法。在此方法中，將宿主細(xì)胞中編碼涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸與感興趣的試劑接觸。在存在該試劑和缺少該試劑的情況下，測(cè)定該多聚核苷酸的表達(dá)。比較表達(dá)情況，表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)說(shuō)明先天免疫被強(qiáng)化。在另一方面，該試劑并不激發(fā)膿毒癥反應(yīng)，如同缺乏促炎癥細(xì)胞因子TOF-a的增量調(diào)節(jié)(upregulation)時(shí)所揭示的。仍然在另一個(gè)方面，該試劑降低或阻斷炎癥或膿毒癥應(yīng)答。還是在另一個(gè)方面，該試劑降低TNF-a和/或白介素的表達(dá)，白介素包括但不限于IL-1e、IL-6、IL-12p40、IL-12p70和IL-8。在另一方面，本發(fā)明提供了利用陽(yáng)離子肽進(jìn)行直接的多聚核苷酸調(diào)節(jié)的方法和包括陽(yáng)離子肽在內(nèi)的化合物在激化先天免疫的元素(elements)中的應(yīng)用。在這一方面，本發(fā)明提供了為了鑒定可強(qiáng)化先天免疫的化合物而確定多聚核苷酸表達(dá)譜型的方法。在本發(fā)明的該方法中，對(duì)與陽(yáng)離子肽接觸的和未與陽(yáng)離子肽接觸的細(xì)胞作了多聚核苷酸表達(dá)譜型的初步檢測(cè)。在該肽存在的情況下得出的多聚核苷酸表達(dá)譜型表明先天免疫受到刺激。然后檢測(cè)了在受測(cè)化合物存在的情況下多聚核苷酸的表達(dá)譜型，其中使用受測(cè)化合物得到與在陽(yáng)離子肽存在時(shí)相類似的表達(dá)譜型，說(shuō)明這是一個(gè)可強(qiáng)化先天免疫的化合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在上述方法中確認(rèn)的化合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的化合物刺激趨化因子或趨化因子受體的表達(dá)。趨化因子或趨化因子受體可以包括，但不限于CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、匿-1a、函C、MIP-3a、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5和RANTES。仍然是在另一方面，該化合物是肽、肽模擬物(peptidomimetic)、化合物(chemicalcompounds)或核酸分子。仍然是在另一方面，該多聚核苷酸表達(dá)譜型包括促炎癥的多聚核苷酸的表達(dá)。這些促炎癥多聚核苷酸包括，但不限于環(huán)指蛋白10(D87451)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA0912蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1樣死亡受體結(jié)合蛋白(AB007856)、組織蛋白酶S(M90696)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-l癌基因(M54915)、蛋白酶體亞基P型5(D2懇)、KIAA0239蛋白(D87076)、氣管支氣管黏蛋白5亞型B(AJ001403)、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白CREBPa、整連蛋白aM(J03925)、與Rho相關(guān)的激酶2(NM—004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL161991、AL031983)和它們的任意組合。仍然在另一個(gè)方面，該多聚核苷酸表達(dá)譜型包括細(xì)胞表面受體的表達(dá)，細(xì)胞表面受體包括但不限于視黃酸受體(X06614)、G蛋白偶聯(lián)受體(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趨化因子(C-C基序)受體7(L31584)、腫瘤壞死因子受體超家族成員17(Z29575)、干擾素Y受體2(U05875)、細(xì)胞因子受體樣因子l(AF059293)、I類細(xì)胞因子受體(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受體樣2(U92971)、白血病抑制因子受體(NM—002310)、干擾素Y受體1(AL050337)。在后面例如表1-15中將說(shuō)明，陽(yáng)離子肽能夠中和宿主對(duì)感染原的信號(hào)分子的應(yīng)答，還能改變宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，這些主要是通過(guò)減量調(diào)節(jié)促炎應(yīng)答和/或增量調(diào)節(jié)抗炎應(yīng)答來(lái)完成。實(shí)施例5說(shuō)明，該陽(yáng)離子肽能夠通過(guò)誘導(dǎo)趨化因子的釋放來(lái)輔助宿主對(duì)病原體的應(yīng)答，趨化因子促使免疫細(xì)胞聚集到感染位點(diǎn)。這些結(jié)果通過(guò)鼠的體內(nèi)應(yīng)用被證實(shí)。從后面的實(shí)施例可以看到，陽(yáng)離子肽明顯影響宿主對(duì)病原體的應(yīng)答，原因在于陽(yáng)離子肽誘導(dǎo)選擇性的促炎應(yīng)答，例如促使免疫細(xì)胞聚集到感染位點(diǎn)的應(yīng)答，但不誘導(dǎo)明顯有害的促炎細(xì)胞因子，由此輔助宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控。膿毒癥似乎部分地是由對(duì)感染原的過(guò)度促炎應(yīng)答引起的。陽(yáng)離子肽誘導(dǎo)抗炎應(yīng)答和抑制某些具有潛在危害的促炎應(yīng)答，由此幫助宿主對(duì)病原體產(chǎn)生一種"平衡"的應(yīng)答。在實(shí)施例7中，為了研究陽(yáng)離子肽與細(xì)胞相互作用時(shí)產(chǎn)生這些效果的基本機(jī)制，對(duì)所選擇的MAP激酶的活化作了分析。巨噬細(xì)胞在應(yīng)答細(xì)菌感染時(shí)激活MEK/ERK激酶。MEK是MAP激酶激酶，當(dāng)它被激活時(shí)，便會(huì)磷酸化下游的激酶ERK(細(xì)胞外調(diào)節(jié)性激酶)，然后ERK形成二聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，它在那里激活轉(zhuǎn)錄因子如E1K-1，由此改變多聚核苷酸的表達(dá)。已經(jīng)表明MEK/ERK激酶可削弱巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌Ga/wowe〃a)的復(fù)制。由MEK激酶和NADPH氧化酶介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)(signaltransduction)在對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的先天性防御中發(fā)揮著重要的作用。如下面所示，陽(yáng)離子肽通過(guò)影響MAP激酶，對(duì)細(xì)菌感染產(chǎn)生影響。這些陽(yáng)離子肽可以l[接影響激酶。表21顯示了在肽的應(yīng)答中MAP激酶多聚核苷酸表達(dá)的變化，但^不限于這些。這些激酶包括MAP激酶激酶6(H070920)、MAP激酶激酶5(W69649)、MAP激酶7(H39192)、MAP激酶12(AI936909)和被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281)。在另一方法中，本發(fā)明的方法可以被組合使用，以鑒定具有多種特征的試劑，即具有抗炎癥/抗膿毒癥活性和能夠部分地通過(guò)體內(nèi)誘導(dǎo)趨化因子而強(qiáng)化先天免疫的肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了由哺乳動(dòng)物個(gè)體的核酸樣品推斷該個(gè)體的感染狀態(tài)的方法，該方法是依靠于確定核酸樣品中的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其例證是表55中的至少兩個(gè)多聚核苷酸與未感染的個(gè)體相比，多聚核苷酸表達(dá)增加。在另一方面，本發(fā)明提供了由哺乳動(dòng)物個(gè)體的核酸樣品推斷該個(gè)體的感染狀態(tài)的方法，該方法是依靠于確定核酸樣品中的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其例證是表56或表57中的至少兩個(gè)多聚核苷酸與未感染的個(gè)體相比較的多聚核苷酸表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，感染狀態(tài)的原因在于感染原或從它們那里得到的信號(hào)分子，例如，但不限于革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了依據(jù)上述方法確定的受感染個(gè)體的多聚核苷酸表達(dá)譜型。一旦經(jīng)確定，這樣的多聚核苷酸將可用于診斷與這些感染原或信號(hào)分子的存在或活性相關(guān)的癥狀。實(shí)施例10顯示了本發(fā)明的這個(gè)方面。特別地,表61證明了MEK和NADPH氧化酶抑制劑都能限制細(xì)菌的復(fù)制(鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)對(duì)由IFN-Y引發(fā)的巨噬細(xì)胞的感染激化了MEK激酶)。這是通過(guò)改變宿主細(xì)胞信號(hào)分子而如何影響細(xì)菌存活的一個(gè)例子。仍然在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提出了可抑制由基質(zhì)細(xì)胞源性因子1(SDF-1)誘導(dǎo)的T細(xì)胞趨化性的化合物。還提出了可降低SDF-1受體表達(dá)的化合物。這些化合物也可以用作CXCR-4的拮抗劑或抑制劑。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了作為CXCR-4拮抗劑的陽(yáng)離子肽。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定作為CXCR-4拮抗劑的陽(yáng)離子肽的方法。該方法包括，在存在受測(cè)肽和缺少受測(cè)肽時(shí)，將T細(xì)胞與SDF-1接觸，并測(cè)量趨化性。在受測(cè)肽存在的情況下，趨化性的降低表明該肽是CXCR-4的拮抗劑。這些化合物和方法在HIV病人的治療應(yīng)用中是有用的。這些類型的化合物及其實(shí)用性已經(jīng)被證明，例如實(shí)施例11(也參見(jiàn)表格62，63)。在該實(shí)施例中，已經(jīng)表明陽(yáng)離子肽可抑制細(xì)胞遷移(cellmigration)以及抗病毒活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述通式(通式A)的氨基酸序列的被分離的陽(yáng)離子肽XWuXsDQPXJPXsXzX!(SEQIDNO:4)，其中X,是一個(gè)或兩個(gè)R、L或K,X2是一個(gè)C、S或A，X3是一個(gè)R或P，X4是一個(gè)A或V，Xs是一個(gè)V或W。本發(fā)明的肽的例子包括，但不限于LLCRIVPVIPWCK(SEQIDNO:5),LRCPIAPVIPVCKK(SEQIDNO:6)，KSRIVPAIPVSLL(SEQIDNO:7)，KKSPIAPAIPWSR(SEQIDNO:8),RRARIVPAIPVARR(SEQIDNO:9)禾tlLSRIAPAIPWAKL(SEQIDNO:10)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述通式(通式B)的氨基酸序列的被分離的線性陽(yáng)離子肽X，LX2X3KX4X2XsX3PX3X！(SEQIDNO:11)，其中X是一個(gè)或兩個(gè)D、E、S、T或N，X2是一個(gè)或兩個(gè)P、G或D，X3是一個(gè)G、A、V、L、I或Y,是一個(gè)R、K或H，X5是一個(gè)S、T、C、M或R。本發(fā)明的肽的例子包括，但不限于DLPAKRGSAPGST(SEQIDNO:12)，SELPGLKHPCVPGS(SEQIDNO:13)，TTLGPVKRDSIPGE(SEQIDNO:14),SLPIKHDRLPATS(SEQIDNO:15)，ELPLKRGRVPVE(SEQIDNO:16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQIDNO:17)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述通式(通式C)的氨基酸序列的被分離的線性陽(yáng)離子肽XjXzXiX^W&W&XsK(SEQIDNO:18)(此式包括CP12a和CP12d)，其中X,是一至四個(gè)選自A、P或R的氨基酸，X2是一個(gè)或兩個(gè)芳香性氨基酸(F、Y和W),X3是一個(gè)P或K，X4是零至兩個(gè)選自A、P、Y或W的氨基酸，Xs是一至三個(gè)選自R或P的氨基酸。本發(fā)明的肽的例子包括，但不限于RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQIDNO:19)，RRAWWKAWWARRK(SEQIDNO:20)，RAPYWPWAWARPRK(SEQIDNO:21),RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQIDNO:22)，RAAFKWAWAWWRRK(SEQIDNO:23)禾BRRRWKWAWPRRK(SEQIDNO:24)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述通式(通式D)的氨基酸序列的被分離的十六聚體陽(yáng)離子肽X,X2X3X4X,VX3X4RGX4X3X4X,X3X,(SEQIDNO:25)，其中X,是一個(gè)或兩個(gè)R或K，X2是一個(gè)極性或帶電荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是C、S、M、D或A,X4是F、I、V、M或R。本發(fā)明的肽的例子包括，但不限于RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQIDNO:26),KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQIDNO:27)，KKDAIKKVDIRGMDMRRAR(SEQIDNO:28)，RKMVKVDVRGIMIRKDRR(SEQIDNO:29)，KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQIDNO:30)禾卩RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQIDNO:31)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述通式(通式E)的氨基酸序列的被分離的十六聚體陽(yáng)離子肽X!X2X3X4XiVXsX4RGX4X5X4X,X3X，(SEQIDNO:32)，其中X!是一個(gè)或兩個(gè)R或K，X2是一個(gè)極性或帶電荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R和H)，X3是一個(gè)C、S、M、D或A，X4是一個(gè)F、I、V、M或R，Xs是一個(gè)A、I、S、M、D或R。本發(fā)明的肽的例子包括，但不限于RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQIDNO:33)，KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQIDNO:34)，KESIKVIIRGMMVRMKK(SEQIDNO:35)，RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQIDNO:36)，KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQIDNO:37)和RHCIRRVSMRGIIMRRCK(SEQIDNO:38)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述通式(通式F)的氨基酸序列的被分離的更長(zhǎng)的陽(yáng)離子肽IQdKXzFXzKMLMXzALKKXs(SEQIDNO:39),其中X,是一個(gè)極性氨基酸(C、S、T、M、N和Q);Xz是一個(gè)A、L、S或K，X3是1-17個(gè)選自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。本發(fā)明的肽的例子包括，但不限于KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(SEQIDNO:40)，KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQIDNO:41)，KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(SEQIDNO:42)，KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQIDNO:43)，KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(SEQIDNO:44)和KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQIDNO:45)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述通式(通式G)的氨基酸序列的被分離的更長(zhǎng)的陽(yáng)離子肽KWKX2X,X,X2X2X,X2X2X,X,X2X2lFHTALKPISS(SEQIDNO:46)，其中，Xi是疏水性氨基酸，X2是親水性氨基酸。本發(fā)明的肽的例子包括，但不限于KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISS(SEQIDNO:47)，KWKSYAHTMSPVRLIFHTALKPISS(SEQIDNO:48)，KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISS(SEQIDNO:49),KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISS(SEQIDNO:50)，KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISS(SEQIDNO:51)，和KWKHALMKAHMLW醒IFHTALKPISS(SEQIDNO:52)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有下述式子的氨基酸序列的被分離的陽(yáng)離子肽KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQIDNO:53)或KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQIDNO:54)。在此使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"是指基本上沒(méi)有其它蛋白質(zhì)、脂類和核酸(例如，與體內(nèi)產(chǎn)生的肽天然聯(lián)系在一起的細(xì)胞組分)的肽。優(yōu)選地，該肽的純度依重量來(lái)算至少為70%、80%，或者最優(yōu)選90%。本發(fā)明還包括被列舉的多肽的類似物(analogs)、衍生物(derivatives)、保守變異體(conservativevariations)和陽(yáng)離子肽變體(cationicpeptidevariants),只要這些類似物、衍生物、保守變異體或變體具有可檢測(cè)到的強(qiáng)化先天免疫或抗炎癥的活性。肽的類似物、衍生物、保守變異體或變體的活性不一必與該肽的活性完全相同。陽(yáng)離子肽"變體"是指具有所參照的陽(yáng)離子肽的變化形式的肽。例如，術(shù)語(yǔ)"變體"包括參照肽的至少一個(gè)氨基酸在表達(dá)文庫(kù)中被替換而得到的陽(yáng)離子肽。術(shù)語(yǔ)"參照"肽是指本發(fā)明的任何陽(yáng)離子肽(例如，在上面式子中所定義的)，由它們得到變體、衍生物、類似物或保守變異。術(shù)語(yǔ)"衍生物"包括雜合肽，它包括兩種陽(yáng)離子肽中的每一種的至少一部分(例如，兩種陽(yáng)離子肽中的每一種的30-80%)。還包括將一個(gè)或多個(gè)氨基酸從在此列舉的肽的序列中刪去所得到的肽，只要該衍生物具有強(qiáng)化先天免疫或抗炎癥的活性。由此可以開(kāi)發(fā)得到同樣具有效用的更小的活性分子。例如，可以移去那些對(duì)于強(qiáng)化先天免疫和肽的抗炎活性并不是必要的氨基端氨基酸或羧基端氨基酸。同樣，可以將一個(gè)或一些(例如，少于5個(gè))氨基酸添加到陽(yáng)離子肽上而且不會(huì)完全抑制該肽的活性，這樣便得到另外的衍生物。此外，C端衍生物，例如C端甲基酯，和N端衍生物可以被獲得，而且它們被包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的肽包括本發(fā)明所公開(kāi)的肽的任何類似物、同源物(homolog)、突變體(mutant)、異構(gòu)體(isomer)或衍生物，只要在此所述的生物活性仍然保留著。還包括前面提出的通式所包含的肽的反向序列。此外，可以用"L"構(gòu)型的氨基酸替代"D"構(gòu)型的氨基酸，反之亦然。作為選擇，可以通過(guò)化學(xué)方法或者在其序列中增加兩個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基并氧化形成二硫鍵，將該肽環(huán)化。本發(fā)明還包括作為在此列舉的那些肽的保守變異體的肽。在此使用的術(shù)語(yǔ)"保守變異體"是指至少一個(gè)氨基酸被別的生物活性類似的殘基替換所得到的多肽。保守變異體的例子包括用一個(gè)疏水性殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸替代另一個(gè)疏水性殘基，或者用一個(gè)極性殘基替代另一個(gè)極性殘基，例如，精氨酸替代賴氨酸，谷氨酸替代天冬氨酸，谷氨酰胺替代夭冬酰胺，等等?？梢员舜颂鎿Q的中性親水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸。"保守變異體"還包括用取代的氨基酸替換未取代的原氨基酸(parentaminoacids)所得到的肽。這些取代的氨基酸可以包括甲基化的或酰胺化的氨基酸。其它替代對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。在一個(gè)方面，由取代的多肽制出的抗體也能夠特異地結(jié)合未取代的多肽。本發(fā)明的肽可以用普遍使用的方法合成，例如，該方法包括a氨基的t-BOC或FMOC保護(hù)。兩種方法都涉及逐步合成步驟，其中從該肽的C末端開(kāi)始，每一步增加一個(gè)氨基酸(參見(jiàn)，Coligan等，CwrreW尸ra/oco/s!"/w"m"o/ogK，Wiley/"/ewc/e^e，1991，第9單元)。本發(fā)明的肽也可以用已熟知的固相肽合成方法合成，例如由Merrifield(j;爿附.Oze附.5"oc，85:2149，1962)以及Stewart和Young(So/W尸/iayeSywf/jew's,Freeman,SanFrancisco,1969，第27-62頁(yè))描述的方法，其中使用了苯乙烯-二乙烯基苯共聚聚合物，每克聚合物中有0.1-1.0毫摩爾胺?；瘜W(xué)合成完成后，用HF-10。/。苯甲醚在0'C處理1/4-1小時(shí)，將該肽脫保護(hù)并從聚合物上切割下來(lái)。待試劑蒸發(fā)后，用1%乙酸溶液將肽從聚合物中提取出來(lái)，然后凍干得到粗產(chǎn)物。使用例如凝膠過(guò)濾的技術(shù)將該肽純化，例如在SephadexG-15上使用5%乙酸作為溶劑。將柱洗脫物的合適級(jí)分凍干，便可產(chǎn)生勻質(zhì)的肽，然后用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)例如氨基酸分析、薄層色譜、高效液相色譜、紫外吸收光譜、摩爾旋光或者溶解性測(cè)量對(duì)它進(jìn)行表征。如果需要的話，該肽可以使用固相Edman降解定量。本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的肽的被分離的核酸(例如，DNA、cDNA或RNA)。編碼在此描述的肽的類似物、突變體、保守變異體和變體的核酸也包括在內(nèi)。在此使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"是指基本上除去了與體內(nèi)產(chǎn)生的核酸天然聯(lián)系著的蛋白、脂和其它核酸所得到的核酸。優(yōu)選地，該核酸的純度在重量上為至少70%、80%或優(yōu)選90%?？梢允褂皿w外合成核酸的傳統(tǒng)方法替代體內(nèi)方法。正如在此使用的，"核酸"是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，它們可以是一個(gè)獨(dú)立的片斷，也可以是一個(gè)大的遺傳構(gòu)建物(construct)的一部分(例如，將一個(gè)啟動(dòng)子連接到編碼本發(fā)明的肽的核酸上)。大量的遺傳構(gòu)建物(例如，質(zhì)粒和其它表達(dá)載體)在本領(lǐng)域是己知的，它們可被用于在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)或原核細(xì)胞或真核(例如酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中制造本發(fā)明的肽?？紤]到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易地合成編碼本發(fā)明的多肽的核酸?？梢苑奖愕厥褂脗鹘y(tǒng)的分子生物學(xué)方法利用本發(fā)明的核酸獲得本發(fā)明的肽?？梢詫⒕幋a本發(fā)明的陽(yáng)離子肽的DNA插入到"表達(dá)載體"中。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"是指一種遺傳構(gòu)建物例如質(zhì)粒、病毒或其他本領(lǐng)域已知的載體，它們可以經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)而含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸。這些表達(dá)載體優(yōu)選為含有啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒，啟動(dòng)子有助于插入的基因序列在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和能實(shí)現(xiàn)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的表型選擇的多聚核苷酸(例如，抗生素抗性多聚核苷酸)。在本發(fā)明中可以使用各種啟動(dòng)子，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子。通常，該表達(dá)載體含有復(fù)制子位點(diǎn)和由與宿主細(xì)胞相容的物種所獲得的控制序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已熟知的傳統(tǒng)技術(shù)，將本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到受體(recipient)中。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.co/z')時(shí)，可以使用本領(lǐng)域已知的CaCh、MgCl2或RbCI方法制備能夠吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞。作為選擇，可以使用物理方法，例如電穿孔或微注射。電擊轉(zhuǎn)化是通過(guò)高電壓脈沖將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。此外，可以使用本領(lǐng)域已熟知的方法，通過(guò)原生質(zhì)體融合將核酸引入宿主細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的合適方法例如電穿孔和脂轉(zhuǎn)染也是己知的。本發(fā)明所包含的"宿主細(xì)胞"或"受體細(xì)胞"是指可以在其中用本發(fā)明的核酸來(lái)表達(dá)本發(fā)明的多肽的任何細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)也包括受體細(xì)胞或宿主細(xì)胞的任何子代。本發(fā)明優(yōu)選的受體細(xì)胞或宿主細(xì)胞包括大腸桿菌(Eco//)、金黃葡萄球菌(51.⑧w"s)和綠膿桿菌(Pa""g!'"0M)，盡管其它的革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞和本領(lǐng)域已知的其它生物也可以被利用，只要該表達(dá)載體含有復(fù)制起點(diǎn)以允許其在該宿主中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的方法所使用的陽(yáng)離子肽多聚核苷酸序列可以從生物體中分離得到，或者在實(shí)驗(yàn)室合成。編碼感興趣的陽(yáng)離子肽的特定DNA序列可以通過(guò)如下方法獲得1)從基因組DNA從分離出雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以提供感興趣的陽(yáng)離子肽所需的密碼子；和3)利用從供體細(xì)胞分離出的mRNA的反轉(zhuǎn)錄在體外合成雙鏈DNA序列。在后一種情況中，可以得到mRNA的雙鏈DNA互補(bǔ)序列，它通常被稱之為cDNA。當(dāng)所需要的肽產(chǎn)物的氨基酸殘基的整個(gè)序列都是已知時(shí)，合成其DNA序列通常是被選擇的方法。在本發(fā)明中，合成DNA序列具有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即允許整合進(jìn)最可能被細(xì)菌宿主識(shí)別的密碼子，由此便沒(méi)有翻譯上的困難，可以獲得高水平的表達(dá)。此外，事實(shí)上任何肽都可以被合成，包括那些編碼天然陽(yáng)離子肽的肽、它們的變體或合成的肽。當(dāng)所需要的肽的整個(gè)序列是未知的時(shí)候，DNA序列的直接合成便不可能，此時(shí)可以選擇的方法是獲得cDNA序列。分離出感興趣的cDNA序列的標(biāo)準(zhǔn)程序包括構(gòu)建含有cDNA文庫(kù)的質(zhì)?；蚴删w，cDNA文庫(kù)是由存在于供體細(xì)胞中具有高水平遺傳表達(dá)的大量mRNA的反轉(zhuǎn)錄獲得。當(dāng)同聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一起被使用時(shí)，即使稀有表達(dá)產(chǎn)物也能被克隆。當(dāng)陽(yáng)離子肽的氨基酸序列的重要部分是己知時(shí)，可以制作標(biāo)記的單鏈或雙鏈DNA或RNA探針，其序列被認(rèn)為是存在于目標(biāo)cDNA中，于是在己變性成為單鏈形式的cDNA克隆拷貝上進(jìn)行DNA/DNA雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)就可以應(yīng)用這些探針(Jay等，M/c.XcW及es.，11:2325，1983)。可以通過(guò)注射或一段時(shí)間內(nèi)的逐漸輸注方式不經(jīng)腸道地施用本發(fā)明的肽。該肽可以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或透皮施用。傳送該肽的優(yōu)選方法包括通過(guò)微球體或類蛋白形式的膠囊進(jìn)行口服，以氣霧劑形式傳送至肺，或者利用離子電滲透或電穿孔經(jīng)皮傳送。其它的施用方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。本發(fā)明的肽的不經(jīng)腸道施用形式的制備包括無(wú)菌的含水或無(wú)水溶液、懸浮液和乳液。無(wú)水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油，以及可注射用的有機(jī)酯例如油酸乙酯。含水載劑包括水、乙醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和含緩沖介質(zhì)的不經(jīng)腸道載體，包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、乳酸化林格氏溶液或非揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)施用的載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如它們可基于林格氏葡萄糖液)，等等。也可以含有防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物試劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體和類似物?，F(xiàn)在通過(guò)引用下面的非限制性實(shí)施例，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。通過(guò)引用本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明被更詳細(xì)地描述，同時(shí)，應(yīng)該理解，修改和變化亦在被描述和要求保護(hù)的內(nèi)容的精神和范圍之內(nèi)。實(shí)施例1抗膿毒癥/抗炎癥活性利用多聚核苷酸陣列來(lái)確定陽(yáng)離子肽對(duì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的影響。將A549人上皮細(xì)胞系保持在DMEM(Gibeo)中，并補(bǔ)充以10%胎牛血清(FBS，Medicorp)。將A549細(xì)胞鋪在100mm組織培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿含2.5X106個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)，然后和100ng/ml的Eco//0111:B4LPS(Sigma)共同溫育4小時(shí)，其中含有50/ig/ml的肽及培養(yǎng)基，或者不含有肽而只有培養(yǎng)基，作為對(duì)照。經(jīng)刺激后，用焦碳酸二乙酯處理的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞一次，再用細(xì)胞刷刮下細(xì)胞。用RNAquesous(Ambion，Austin,TX)分離總RNA。用含有Superase-In(RNA酶抑制劑Ambion)的無(wú)RNA酶的水重懸RNA沉淀物。用DNA-free試劑盒(Ambion)除掉DNA污染。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)RNA的質(zhì)量。所使用的多聚核苷酸陣列是HumanOperon陣列(該基因組的識(shí)別號(hào)(identificationnumber)是PRHU04-S1),它由雙份的14,000個(gè)的人寡聚體點(diǎn)組成。用10/ig總RNA制備探針，探針用Cy3或Cy5標(biāo)記的dUTP進(jìn)行標(biāo)記。該探針經(jīng)純化后雜交到印刷玻璃片上，42'C過(guò)夜，然后洗滌。洗滌之后，用PerkinElmer陣列掃描儀獲取圖象。用圖象處理軟件(Imapolynucleotide5.0，MarinaDelRey，CA)確定點(diǎn)的平均強(qiáng)度，中間強(qiáng)度和背景強(qiáng)度。使用"自制的"程序除去背景。該程序計(jì)算將每個(gè)子小格(subgrid)的底部強(qiáng)度計(jì)為10%,并對(duì)每個(gè)小格(grid)減去此值。使用Genespring軟件(RedwoodCity,CA)進(jìn)行分析。從一個(gè)玻片內(nèi)的點(diǎn)數(shù)值的集合中，獲得中間點(diǎn)強(qiáng)度值，并將該值與此實(shí)驗(yàn)中所有玻片的數(shù)值比較，從而使每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。肽處理的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的相對(duì)變化可以在表1和表2中看到。表2只顯示了那些在受測(cè)的14,000個(gè)多聚核苷酸中表達(dá)發(fā)生明顯變化的多聚核苷酸。該數(shù)據(jù)表明，該肽具有廣泛地降低由LPS誘導(dǎo)的多聚核苷酸表達(dá)的能力。在表1中，多聚核苷酸微陣列的研究表明了SEQIDNO:27的肽有效地降低了由Ecoh'0111:B4LPS增量調(diào)節(jié)的多種多聚核苷酸的表達(dá)。肽(50//g/ml)和LPS(O.lpg/ml)與A549細(xì)胞一起溫育4小時(shí)，或者LPS單獨(dú)與A549細(xì)胞溫育4小時(shí)，然后分離出RNA。利用5//g總RNA制作出Cy3/Cy5標(biāo)記的cDNA探針，并雜交到HumanOperon陣列(PRHU04)上。表1的第三列顯示未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度。"比值LPS/對(duì)照"一列是指用LPS刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)的強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度所得到的結(jié)果。"比值LPS+ID27/對(duì)照"一列是指用LPS和肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)的強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度所得到的結(jié)果。表1:肽SEQID27降低<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表1到表64中的所有登記號(hào)均指GenBank登記號(hào)(AccessionNumbers)。在表2中，多聚核苷酸微陣列的研究表明了濃度為50pg/ml的陽(yáng)離子肽有效地降低了由100ng/ml的￡.co//0111:B4LPS增量調(diào)節(jié)的許多多聚核苷酸的表達(dá)。肽和LPS與A549細(xì)胞一起溫育4小時(shí)，或者LPS單獨(dú)與A549細(xì)胞溫育4小時(shí)，然后分離出RNA。利用5//g總RNA制作出Cy3/Cy5標(biāo)記的cDNA探針，并雜交到HumanOperon陣列(PRHU04)上。表2的第三列顯示未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度。"比值LPS/對(duì)照"一列是指用LPS刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)的強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度所得到的結(jié)果。其它列是指用LPS和肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)的強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度所得到的結(jié)果。表2:由￡.co//0111:B4LPS增量調(diào)控的和由陽(yáng)離子肽降低的人A549上皮細(xì)胞多聚核苷酸表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例2中和對(duì)免疫細(xì)胞的刺激測(cè)試了化合物壓制革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)物對(duì)免疫細(xì)胞的剌激的能力。細(xì)菌產(chǎn)物刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，由此產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，當(dāng)它們不受壓制時(shí)，就可能導(dǎo)致膿毒癥。開(kāi)始的實(shí)驗(yàn)是利用由美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(Manassas,VA)獲得的鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，人上皮細(xì)胞系A(chǔ)549和來(lái)自BALB/c鼠骨髓的原代巨噬細(xì)胞(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)。用150mm培養(yǎng)板培養(yǎng)來(lái)自鼠骨髓的細(xì)胞，培養(yǎng)基為達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM;LifeTechnologies,Burlington,ON),并補(bǔ)充以20。/。FBS(SigmaChemicalCo,St.Louis,MO)和20%L細(xì)胞條件培養(yǎng)液作為M-CSF來(lái)源。當(dāng)巨噬細(xì)胞鋪滿60-80%時(shí)，移去培養(yǎng)基中的L細(xì)胞條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)14-16小時(shí)，直到它們進(jìn)入靜態(tài)，然后用10ng/mlLPS或100ng/mlLPS+20〃g/ml肽處理24小時(shí)。用ELISA(R&DSystems,Minneapolis,,)測(cè)定釋放到培養(yǎng)物上清中的細(xì)胞因子。細(xì)胞系RAW264.7和A549被保持在補(bǔ)充有10%胎小牛血清的DMEM中。將RAW264.7細(xì)胞以每孔1()S個(gè)細(xì)胞的密度接種到含有DMEM的24孔板中，將A549細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞的密度接種到含有DMEM的24孔板中，兩者均于37'C在5%C02中過(guò)夜培養(yǎng)。從過(guò)夜生長(zhǎng)的細(xì)胞中吸去DMEM，換以新鮮培養(yǎng)基。在一些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)靜脈穿刺將志愿者的血液收集(按照UBC臨床研究道德委員會(huì)承認(rèn)的程序，證明號(hào)C00-0537)到含有14.3USP單位肝素/ml血液的試管(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)中。將血液與帶有肽或者沒(méi)有肽的LPS,于37'C在聚丙烯管中混合6小時(shí)。樣品于2000Xg離心5分鐘，收集血漿，然后貯存于-20'C，直到用ELISA(R&DSystems)對(duì)其作IL-8分析時(shí)才取出。在這些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與LPS或其它細(xì)菌產(chǎn)物于37'C在5%C02中溫育6-24小時(shí)。鼠傷寒沙門氏菌LPS和￡.co/z'0111:B4LPS購(gòu)自Sigma。將來(lái)自金黃葡萄球菌(Sigma)的脂磷壁酸(LTA)重懸于無(wú)內(nèi)毒素的水(Sigma)中。對(duì)LTA制備物進(jìn)行鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(Sigma)以確定其沒(méi)有受到明顯的內(nèi)毒素污染。內(nèi)毒素污染小于lng/ml，該濃度不會(huì)導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞因子產(chǎn)物。無(wú)帽的脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)由ColoradoStateUniversity的JohnT.Belisle博士饋贈(zèng)。將分支桿菌(M;/coZw"en'w附)的AraLAM過(guò)濾滅菌，用鱟變形細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)定內(nèi)毒素污染，發(fā)現(xiàn)為3.75ng/1.0mgLAM。在加入LPS的同時(shí)(或者在一些特別指出的地方，是在隨后加入)，加入一定濃度范圍的陽(yáng)離子肽。移走上清，用ELISA(R&DSystems)對(duì)產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)都至少進(jìn)行三次，得到的是類似的結(jié)果。為了證實(shí)體內(nèi)的抗膿毒癥活性，將2或3/^￡工0//0111:B4LPS的磷酸緩沖鹽溶液(PBS;pH7.2)經(jīng)腹膜注射到半乳糖胺敏化的8-10周雌性CD-I或BALB/c鼠體內(nèi)，由此誘導(dǎo)膿毒癥。在其他實(shí)驗(yàn)中，將400//g￡.co//0111:B4LPS注射進(jìn)入CD-I鼠，10分鐘后，再通過(guò)腹膜內(nèi)注射導(dǎo)入肽(200//g)。注射后對(duì)存活情況進(jìn)行48小時(shí)監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)上認(rèn)為產(chǎn)生過(guò)量的TNF-a是與膿毒癥的發(fā)生聯(lián)系在一起的。在此實(shí)施例中使用的三種類型LPS、LTA或AraLAM代表了由革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌釋放的產(chǎn)物。SEQIDNO:1的肽能夠明顯降低由鼠傷寒沙門氏菌、洋蔥伯克霍爾德菌(5.cepac/a)和￡.co//0111:B4LPS刺激的TNF-a生成，前者所受的影響要稍小些(表3)。在后兩種情況中可以看到，濃度低至l/zg/ml的肽(0.25nM)也能導(dǎo)致TNF-a生成的顯著降低。一種不同的肽，SEQIDNO:3并不降低RAW巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的TOF-ci生成，說(shuō)明這是陽(yáng)離子肽的一個(gè)并不統(tǒng)一和不可預(yù)測(cè)的性質(zhì)。還測(cè)試了每個(gè)式子的代表性肽影響由￡co/;0111:840^刺激的11<^-a生成的能力(表4)。盡管這些肽中有許多都降低了TNF-a生成的至少60%,但是它們降低TNF-a生成的能力是有差別的?！舛鹊碾腟EQIDNO:1和SEQIDNO:2還能夠削弱細(xì)菌產(chǎn)物刺激上皮細(xì)胞系生成IL-8的能力。已經(jīng)知道LPS能夠有效地刺激上皮細(xì)胞生成IL-8。肽在低濃度(1-20//g/ml)時(shí)能壓制上皮細(xì)胞對(duì)LPS的IL-8生成應(yīng)答(表5-7)。肽SEQID2也抑制由LPS誘導(dǎo)的人全血中的IL-8生成(表4)。相反，高濃度的肽SEQIDNO:1(50-100//g/ml)實(shí)際上會(huì)導(dǎo)致IL-8的水平升高(表5)。這表明肽在不同的濃度具有不同的效果。肽對(duì)炎癥刺激的影響也在原代鼠細(xì)胞中得到了證實(shí)，肽SEQIDNO:l明顯降低了BALB/c鼠的源自骨髓的巨噬細(xì)胞中的TNF-a生成(>90%)，該細(xì)胞已經(jīng)用lOOng/ml￡.co//0111:B4LPS刺激過(guò)(表8)。這些實(shí)驗(yàn)都是在存在血清的情況下進(jìn)行的，其中含有LPS結(jié)合蛋白(LBP)，這是一種能夠介導(dǎo)LPS快速結(jié)合到CD14上的蛋白。在用lOOng/ml￡.co/!'LPS進(jìn)行刺激后一小時(shí)再將SEQIDNO:1延遲加入到巨噬細(xì)胞上清中，仍然導(dǎo)致TNF-a生成的明顯降低(70%,表9)。SEQIDNO:1能夠阻止LPS在體外誘導(dǎo)生成TNF-a，與此相一致，某些肽也能使鼠避免由高濃度LPS誘發(fā)的致死性休克。在一些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)預(yù)先注射半乳糖胺使CD-1鼠對(duì)LPS產(chǎn)生過(guò)敏性。由半乳糖胺敏化的小鼠在注射以3pg的co//0111:B4LPS之后4-6小時(shí)內(nèi)被處死。在注射LPS后15分鐘，再注射200g的SEQIDNO:1，有50%的小鼠存活(表10)。在其它實(shí)驗(yàn)中，將更高濃度的LPS注射到?jīng)]有預(yù)先注射D型半乳糖胺的BALB/c鼠中，肽提供的保護(hù)是100%,與之相比，在對(duì)照組中無(wú)一存活(表13)。發(fā)現(xiàn)被選擇的其它肽在這些模型中也是具有保護(hù)性的(表ll，12)。陽(yáng)離子肽還能夠減緩革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激，這些細(xì)菌產(chǎn)物例如分支桿菌的無(wú)帽脂阿拉伯甘露聚糖(AraLAM)和金黃葡萄球菌(S.ce^)的LTA。例如，SEQIDNO:1抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)TA(表14)和AraLAM(表15)對(duì)RAW264.7細(xì)胞中的TNF-a的誘導(dǎo)，后者的程度稍輕些。還發(fā)現(xiàn)另—個(gè)肽SEQIDNO:2降低了LTA對(duì)RAW264.7細(xì)胞中的TNF-a的誘導(dǎo)。濃度為1pg/ml的SEQIDNO:1能夠明顯降低(>75%)1pg/ml的金黃葡萄球菌LTA對(duì)TNF-a生成的誘導(dǎo)。在SEQIDNO:1濃度為20//g/ml時(shí)，AraLAM誘導(dǎo)TNF-a的抑制率>60%?？梢砸攵囵ぞ谺(PMB)作為對(duì)照，以證明在SEQIDNO:1對(duì)AraLAM誘導(dǎo)TNF-a的抑制中，內(nèi)毒素污染不是一個(gè)顯著因素。這些結(jié)果證明陽(yáng)離子肽能夠減弱免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)物的促炎細(xì)胞因子應(yīng)答。表3:在RAW264.7細(xì)胞中SEQIDNO:1減少由LPS誘導(dǎo)的TNF-a生成。在存在指定濃度的SEQID1的情況下，用100ng/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS、lOOng/ml洋蔥伯克霍爾德菌LPS和lOOng/ml￡.co"0111:B4LPS,刺激RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞6小時(shí)。用ELISA測(cè)定釋放到培養(yǎng)物上清中的TNF-a的濃度。100%是表示單獨(dú)用LPS溫育RAW264.7細(xì)胞6小時(shí)所獲得的TNF-a的量(鼠傷寒沙門氏菌LPS=34.5±3.2ng/ml，洋蔥伯克霍爾德菌LPS=11.6±2.9ng/ml，￡.co//0111:B4LPS=30.8±2.4ng/ml)。不加以刺激地培養(yǎng)了6小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞的TNF-a生成的背景水平為0.037-0.192ng/ml。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自于兩份相同的樣品，并且表示成三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表4:在RAW264,7細(xì)胞中陽(yáng)離子肽減少由￡.co/fLPS誘導(dǎo)的TNF-a生成。在存在指定濃度的陽(yáng)離子肽的情況下，用lOOng/ml￡.co//0111:B4LPS刺激RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞6小時(shí)。用ELISA測(cè)定釋放到培養(yǎng)物上清中的TNF-a的濃度。不加以刺激地培養(yǎng)了6小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞的TNF-a生成的背景水平為0.037-0.192ng/ml。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自于兩份相同的樣品，并且表示成三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表5:在A549細(xì)胞中SEQID1減少由LPS誘導(dǎo)的IL-8生成。在存在LPS(lOOng/ml￡.coW0111:B4)的情況下，用濃度逐漸增高的SEQID1刺激A549細(xì)胞24小時(shí)。用ELISA測(cè)定培養(yǎng)物中的IL-8濃度。單獨(dú)的細(xì)胞的IL-8背景水平為0.172±0.029ng/ml。數(shù)據(jù)表示成三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表6:在A549細(xì)胞中SEQID2減少由EcoffLPS誘導(dǎo)的IL-8生成。在存在LPS(lOOng/ml￡.co//0111:B4)的情況下，用濃度逐漸增高的SEQID2刺激人A549上皮細(xì)胞24小時(shí)。用ELISA測(cè)定培養(yǎng)物上清中的IL-8濃度。數(shù)據(jù)表示成三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表7:在人血液中SEQID2減少由JJ.o//LPS誘導(dǎo)的IL-8生成。用￡.co/〖Olll:B4LPS和濃度逐漸增高的肽刺激人全血4小時(shí)。將人全血樣品離心，移走血清并用ELISA測(cè)定IL-8濃度。數(shù)據(jù)表示成兩個(gè)供血者的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表8:在鼠骨髄巨噬細(xì)胞中SEQID1減少由￡lo//LPS誘導(dǎo)的TNF-a生成。在存在20pg/ml的肽或者沒(méi)有肽的情況下，將源自BALB/c鼠骨髓的巨噬細(xì)胞與1OOng/mlco//0111:B4LPS共同培養(yǎng)6小時(shí)或24小時(shí)。收集上清并用ELISA測(cè)定TNF-ci的水平。數(shù)據(jù)表示TNF-a的量，它來(lái)自兩份相同的實(shí)驗(yàn)，源自骨髓的巨噬細(xì)胞與LPS單獨(dú)溫育6小時(shí)(l.l±0.09ng/ml)或24小時(shí)(1.7±0.2ng/ml)。TNF-a的背景水平為6小時(shí)是0.038±0.008ng/ml，24小時(shí)是0.06±0.012ng/ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表9:推遲加入到A549細(xì)胞中的SEQID1抑制由EcoftLPS誘導(dǎo)的TNF-a生成。在逐漸后延的時(shí)間點(diǎn)，將肽(20/ig/ml)加入到已含有A549人上皮細(xì)胞和100ng/ml￡.co0111:B4LPS的培養(yǎng)孔中。6小時(shí)之后收集上清并用ELISA測(cè)定TNF-a水平。數(shù)據(jù)表示成三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表10:通過(guò)SEQID1對(duì)半乳糖胺敏化的CD-I鼠中的致命性內(nèi)毒素血癥進(jìn)行防御。通過(guò)三次腹膜內(nèi)注射半乳糖胺(20mg，溶于0.1ml無(wú)菌PBS中)，使CD-I鼠(9周大)對(duì)內(nèi)毒素產(chǎn)生過(guò)敏性。然后通過(guò)腹膜內(nèi)注射五.coh'0111:B4LPS(3pg，在0.1mlPBS中)誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克。注射LPS后15分鐘，再在一個(gè)不同的位點(diǎn)注射肽SEQID1(200pg/只鼠=8mg/kg)。對(duì)鼠進(jìn)行48小時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄下結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表ll:通過(guò)陽(yáng)離子肽對(duì)半乳糖胺敏化的CD-I鼠中的致命性內(nèi)毒素血癥進(jìn)行防御。通過(guò)腹膜內(nèi)注射半乳糖胺(20mg,溶于O.lml無(wú)菌PBS中)，使CD-I鼠(9周大)對(duì)內(nèi)毒素產(chǎn)生過(guò)敏性。然后通過(guò)腹膜內(nèi)注射五.co//0111:B4LPS(2pg，在O.lmlPBS中)誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克。注射LPS后15分鐘，再在一個(gè)不同的位點(diǎn)注射肽(200/ig/只鼠=8mg/kg)。對(duì)鼠進(jìn)行48小時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄下結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表12:通過(guò)陽(yáng)離子肽對(duì)半乳糖胺敏化的BALB/c鼠中的致命性內(nèi)毒素血癥進(jìn)行防御。通過(guò)腹膜內(nèi)注射半乳糖胺(20mg，溶于O.lml無(wú)菌PBS中)，使BALB/c鼠(8周大)對(duì)內(nèi)毒素產(chǎn)生過(guò)敏性。然后通過(guò)腹膜內(nèi)注射￡.co//0111:B4LPS(2g，在O.lmlPBS中)誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克。注射LPS后15分鐘，再在一個(gè)不同的位點(diǎn)注射肽(200//g/只鼠=8mg/kg)。對(duì)鼠進(jìn)行48小時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄下結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表13:通過(guò)SEQID1對(duì)BALB/c鼠的致命性內(nèi)毒素血癥進(jìn)行防御。將400〃g￡co//0111:B4LPS腹膜內(nèi)注射到BALB/c鼠體內(nèi)。在一個(gè)不同的腹膜位點(diǎn)注射肽(200;/g/只鼠=8mg/kg)。對(duì)鼠進(jìn)行48小時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄下結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表14:肽抑制由金黃葡萄球菌LTA誘導(dǎo)的TNF-a生成。在存在濃度逐漸升高的肽和沒(méi)有肽的情況下，用lpg/ml金黃葡萄球菌LPS刺激RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞。收集上清并用ELISA測(cè)定TNF-a的水平。不加以刺激地培養(yǎng)了6小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞的TNF-a生成的背景水平為0.037-0.192ng/ml。數(shù)據(jù)表示成三個(gè)或更多個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表15:肽抑制由分支桿菌的無(wú)帽脂阿拉伯甘露聚糖誘導(dǎo)的TNF-a生成。在存在20/ig/ml肽或多黏菌素B(PolymyxinB)或者沒(méi)有肽的情況下，用l//g/mlAraLAM刺激RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞。收集上清并用ELISA測(cè)定TNF-a的水平。不加以刺激地培養(yǎng)了6小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞的TNF-a生成的背景水平為0.037-0.192ng/ml。數(shù)據(jù)表示成三個(gè)或更多個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例3陽(yáng)離子肽的毒性評(píng)價(jià)使用兩種方法測(cè)量肽的潛在毒性。第一種，使用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實(shí)施例4通過(guò)陽(yáng)離子肽進(jìn)行多聚核苷酸調(diào)控利用多聚核苷酸陣列來(lái)測(cè)量陽(yáng)離子肽本身對(duì)巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的影響。將鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、人支氣管細(xì)胞(HBE)或A549人上皮細(xì)胞涂到150mm組織培養(yǎng)皿中，密度為每個(gè)培養(yǎng)皿5.6乂106個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)，然后與50;/g/ml的肽共同溫育4小時(shí)，或者只與培養(yǎng)基溫育而不含有肽。經(jīng)刺激后，用焦碳酸二乙酯處理過(guò)的PBS洗滌細(xì)胞一次，再用細(xì)胞刷從培養(yǎng)皿上刮下細(xì)胞。用Trizol(GibcoLifeTechnologies)分離總RNA。用含有RNA酶抑制劑(Ambion，Austin,TX)的無(wú)RNA酶的水重懸RNA沉淀物。在37'C用DNasel(Clontech,PaloAlto，CA)處理該RNA—小時(shí)。加入終止混合物(0.1MEDTA[pH8.0]，lmg/ml糖原)之后，樣品用苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)洗一次，再用氯仿洗一次。然后加入2.5體積100%乙醇和1/10體積乙酸鈉，pH5.2將RNA沉淀。該RNA重懸于含有RNA酶抑制劑(Ambion)的無(wú)RNA酶的水中，并貯存于-70'C。通過(guò)P/。瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)RNA的質(zhì)量。用分離出來(lái)的RNA作為模板，使用P肌動(dòng)蛋白特異性引物(5'陽(yáng)GTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3'(SEQIDNO:55)禾卩5'-GATGTCACGCACGATTTCC-3'(SEQIDNO:56))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以判斷是否有基因組DNA污染。瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色證實(shí)經(jīng)過(guò)35次循環(huán)并沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。AtlascDNA表達(dá)陣列(Clontech,PaloAlto，CA)由雙份(duplcate)點(diǎn)在正電荷膜上的588個(gè)經(jīng)由選擇的鼠cDNA組成，它們?cè)谳^早的多聚核苷酸陣列研究中被使用(表18，19)l用5//g總RNA制備得到32P放射性標(biāo)記的cDNA探針，將其與陣列于71'C溫育過(guò)夜。進(jìn)行泛洗，然后于4'C暴露于磷屏成像系統(tǒng)(phosphoimagerscreen,MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)3天。寸吏用MolecularDynamicsPSI磷屏成像(phosphoimager)獲取圖像。使用Atlaslmage1.0圖象分析軟件(Clontech)禾(lExcel(Microsoft,Redmond,WA)分析雜交信號(hào)。針對(duì)背景水平對(duì)每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度進(jìn)行校正，并針對(duì)探針標(biāo)記間的差異對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，方法是利用被發(fā)現(xiàn)在刺激條件間幾乎沒(méi)有變化的5個(gè)多聚核苷酸的平均值e肌動(dòng)蛋白、泛蛋白、核糖體蛋白S29、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和<^2+結(jié)合蛋白。當(dāng)一個(gè)給定的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)化雜交信號(hào)小于20時(shí)，則將其值定為20，由此計(jì)算比值和相對(duì)表達(dá)。下歩使用的多聚核苷酸陣列(表21-26)是ResgenHumancDNA陣列(該基因組的識(shí)別號(hào)(identificationnumber)是PRHU03誦S3),它由雙份的7，458個(gè)人cDNA點(diǎn)組成。用15-20〃g總RNA制備探針，探針用Cy3標(biāo)記的dUTP進(jìn)行標(biāo)記。該探針經(jīng)純化后雜交到印刷玻璃片上，42'C過(guò)夜，然后洗滌。洗滌之后，用Virtek玻片記錄儀獲取圖象。用圖象處理軟件(Imagene4丄MarinaDelRey，CA)確定點(diǎn)的平均強(qiáng)度，中間強(qiáng)度和背景強(qiáng)度。使用Genespring軟件(RedwoodCity，CA)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和分析。將平均背景強(qiáng)度從Imagene測(cè)定的平均強(qiáng)度中減去，計(jì)算出強(qiáng)度值。從一個(gè)玻片內(nèi)的點(diǎn)的數(shù)值集合中獲得中間點(diǎn)強(qiáng)度，并將該值與此實(shí)驗(yàn)中所有玻片的數(shù)值比較，從而使每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。肽處理的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的相對(duì)變化可以在下面的表格中看到。所使用的其它多聚核苷酸陣列(表27-35)是HumanOperon陣列(該基因組的識(shí)別號(hào)(identificationnumber)是PRHU04-S1)，它由雙份的14,000個(gè)人寡聚體點(diǎn)組成。用10〃g總RNA制備探針，探針用Cy3或Cy5標(biāo)記的dUTP進(jìn)行標(biāo)記。在這些實(shí)驗(yàn)中，將A549上皮細(xì)胞涂到100mm組織培養(yǎng)皿中，密度為每個(gè)培養(yǎng)皿2.5X1()6個(gè)細(xì)胞。用RNAqueous(Ambion)分離總RNA。用除DNA試劑盒(Ambion)除去DNA污染。由總RNA制備的探針經(jīng)純化后雜交到印刷玻璃片上，42'C過(guò)夜，然后洗滌。洗滌之后，用PerkinElmer陣列掃描儀獲取圖象。用圖象處理軟件(Imagene5.0,MarinaDelRey，CA)確定點(diǎn)的平均強(qiáng)度，中間強(qiáng)度和背景強(qiáng)度。使用"自制的"程序除去背景。該程序?qū)⒚總€(gè)子小格的底部強(qiáng)度計(jì)算為10%，并對(duì)每個(gè)小格減去此值。使用Genespring軟件(RedwoodCity,CA)進(jìn)行分析。從一個(gè)玻片內(nèi)的點(diǎn)的數(shù)值集合中獲得中間點(diǎn)強(qiáng)度，并將該值與此實(shí)驗(yàn)中所有玻片的數(shù)值比較，從而使每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。肽處理的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的相對(duì)變化可以在下面的表格中看到。實(shí)施半定量RT-PCR以證實(shí)多聚核苷酸陣列的結(jié)果。在熱循環(huán)儀中將RNA樣品和1p1寡聚dT(500/ig/ml)以及濃度為ImM的1pi混合dNTP儲(chǔ)液，于65'C溫育5分鐘，反應(yīng)體積為12pl，使用的水為焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水。加入15X第一鏈緩沖液，10.1MDTT禾B1p1RNaseOUT重組的核糖核酸酶抑制劑(40units///1)，于42'C溫育2分鐘，然后加入11(200units)的SuperscriptII(Invitrogen,Burlington,ON)。對(duì)于每個(gè)cDNA來(lái)源，在沒(méi)有SuperscriptII的情況下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，以提供陰性對(duì)照。禾擁5，和3，引物(1.0//M)、0.2mMdNTP混合物、1.5mMMgCl2、1U7b<7DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Missiauga,ON)和1XPCR緩沖液擴(kuò)增cDNA。每個(gè)PCR均在熱循環(huán)儀上進(jìn)行，包括30-40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30秒，52'C或55。C退火30秒，72'C延伸40秒。針對(duì)每種引物和每份RNA樣品，優(yōu)化PCR的循環(huán)次數(shù)，使其位于反應(yīng)的線性范圍內(nèi)。為了評(píng)估抽提歩驟和估計(jì)RNA的量，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)管家(housekeeping)多聚核苷酸e肌動(dòng)蛋白基因進(jìn)行了擴(kuò)增。用電泳觀察反應(yīng)產(chǎn)物，并用光密度分析法(densitometry)進(jìn)行分析，這樣就可參考e肌動(dòng)蛋白多聚核苷酸的擴(kuò)增計(jì)算出起始的RNA相對(duì)濃度。表18顯示，在小塊Atlas微陣列上，所選擇的已知多聚核苷酸中，SEQIDNO:1對(duì)RAW264.7細(xì)胞的處理增量調(diào)節(jié)了其中30多個(gè)不同的多聚核苷酸的表達(dá)。由肽SEQIDNO:l增量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸主要來(lái)自兩類一類包括受體(生長(zhǎng)因子、趨化因子、白介素、干擾素、激素、神經(jīng)遞質(zhì))、細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞粘連，另一類包括細(xì)胞-細(xì)胞通訊(生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、白介素、干擾素、激素)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞游動(dòng)和蛋白質(zhì)更新。受增量調(diào)節(jié)的特定多聚核苷酸包括編碼下列蛋白的多聚核苷酸趨化因子MCP-3、抗炎細(xì)胞因子IL-IO、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和受體例如IL-1R-2(結(jié)合到IL-1R1上的多產(chǎn)性IL-1的公認(rèn)拮抗物)、PDGF受體B、NOTCH4、LIF受體、LFA-1、TGFP受體1、G-CSF受體和IFNY受體。該肽還增量調(diào)控編碼幾種金屬蛋白酶及其抑制物的多聚核苷酸，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-1、BMP-2、BMP-8a、TIMP2禾nTIMP3。而且，該肽增量調(diào)節(jié)一些特異性轉(zhuǎn)錄因子，包括JunD，以及YY和LIM-1轉(zhuǎn)錄因子，和激酶例如Etkl和Csk,表明它具有廣泛的影響。多聚核苷酸陣列的研究還發(fā)現(xiàn)，SEQIDNO:1減量調(diào)節(jié)了RAW264.7巨噬細(xì)胞中的至少20個(gè)多聚核苷酸(表19)。由肽減量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸包括DNA修復(fù)蛋白和幾種炎癥介質(zhì)例如MIP-lci、制癌蛋白M(oncostatinM)和IL-12。肽對(duì)多聚核苷酸表達(dá)的許多影響都被RT-PCR證實(shí)(表20)。利用中等大小的微陣列(7835個(gè)多聚核苷酸)還發(fā)現(xiàn)，肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:19和SEQIDNO:1，以及每個(gè)式子的代表性肽改變了人上皮細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。SEQIDNO:1對(duì)多聚核苷酸表達(dá)的影響在兩種人上皮細(xì)胞系A(chǔ)549和HBE中加以比較。表21描述的是被2種或更多種肽增量調(diào)控的與宿主免疫應(yīng)答相關(guān)的多聚核苷酸，與未受刺激的細(xì)胞相比，它們的增量比率為2倍多。表22描述的是被2種或更多種肽減量調(diào)控的與宿主免疫應(yīng)答相關(guān)的多聚核苷酸，與未受刺激的細(xì)胞相比，它們的減量比率為2倍多。表23和表24分別顯示了受增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié)的人上皮促炎多聚核苷酸。表25和表26顯示了受陽(yáng)離子肽影響的促炎多聚核苷酸。一個(gè)明顯的趨向是陽(yáng)離子肽增量調(diào)節(jié)抗炎癥應(yīng)答，減量調(diào)節(jié)促炎癥應(yīng)答。要找到一個(gè)與抗炎癥應(yīng)答相關(guān)卻又受減量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸，是非常困難的(表26)。被陽(yáng)離子肽增量調(diào)控的促炎多聚核苷酸主要是與遷移和粘連相關(guān)的多聚核苷酸。應(yīng)該注意到，在受減量調(diào)控的促炎多聚核苷酸中，有幾種toll樣受體(TLR)多聚核苷酸受到所有陽(yáng)離子肽的影響，TLR多聚核苷酸對(duì)于宿主對(duì)感染原的應(yīng)答的信號(hào)傳導(dǎo)是非常重要的。被所有的肽增量調(diào)控的一種重要的抗炎多聚核苷酸是IL-10受體多聚核苷酸。IL-10是涉及調(diào)控促炎細(xì)胞因子的重要細(xì)胞因子。對(duì)于肽SEQIDN0:6，當(dāng)使用的是原代人巨噬細(xì)胞時(shí)，也可以觀察到對(duì)多聚核苷酸表達(dá)的這些影響，如表27和28所示。下面的表31-37顯示了每個(gè)式子的代表性肽對(duì)人上皮細(xì)胞表達(dá)所選多聚核苷酸(受測(cè)的14,000個(gè))的影響。為了測(cè)試肽改變?nèi)松掀ざ嗑酆塑账岜磉_(dá)的能力，每個(gè)式子至少選用了6種肽，它們確實(shí)具有廣泛的刺激效果。對(duì)每個(gè)式子而言，通常至少有50個(gè)多聚核苷酸被該組中的每一個(gè)肽增量調(diào)節(jié)。表18:RAW巨噬細(xì)胞中被肽SEQIDNO:l處理增量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸a。發(fā)現(xiàn)濃度為50pg/ml的陽(yáng)離子肽有效地誘導(dǎo)了數(shù)種多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與RAW細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA,轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與Atlas陣列雜交。未被刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度顯示在第三列。"比值肽:未刺激"一列是指受肽剌激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。管家多聚核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)化后的強(qiáng)度的變化范圍為0.8-1.2倍，因此這些多聚核苷酸可以有效地用于標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程。當(dāng)一個(gè)給定的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)雜交強(qiáng)度低于20時(shí)，將其值定為20，由此計(jì)算比值和相對(duì)表達(dá)。該分析實(shí)驗(yàn)用不同的RNA制備物重復(fù)三次，平均的倍數(shù)變化如下所示。顯示了相對(duì)表達(dá)水平發(fā)生兩倍或更大變化的多聚核苷酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表19:RAW巨噬細(xì)胞中被SEQIDNO:l處理減量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸'。發(fā)現(xiàn)濃度為50/ig/ml的陽(yáng)離子肽減少了數(shù)種多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與RAW細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA,轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與Atlas陣列雜交。未被刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度顯示在第三列。"比值肽'.未刺激"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。該分析實(shí)驗(yàn)用不同的細(xì)胞重復(fù)三次，平均的倍數(shù)變化如下所示。顯示了相對(duì)表達(dá)水平發(fā)生大約兩倍或更大變化的多聚核苷酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>孤兒受體細(xì)胞核受體2240.2U固8N-鈣依粘連蛋白細(xì)胞粘連受體2380.23M311310CT3轉(zhuǎn)錄因子5830.24M34381PLCj3磷脂酶1940.26U43144KRT18中間纖絲蛋白3180.28M11686THAM酶3420.32X58384CD40LCD40配體660,32X65453CD86T淋巴細(xì)胞抗原1950.36L25606制癌蛋白M細(xì)胞因子11270.39D31942PMS2DNADNA修復(fù)蛋白2000.4U28724IGFBP6生長(zhǎng)因子12910.41X81584MIP-1卩細(xì)胞因子3270.42M23503ATBF1AT基序結(jié)合因子830,43D26046Nucleobindin(核結(jié)合蛋白)高爾基體駐留蛋白3670.43M96823bcl-x細(xì)胞凋亡蛋白1420.43L35049尿調(diào)理素(uromodulirO糖蛋白3630.47L33406IL-12p40白介素6010.48M86671MmRad52DNA修復(fù)蛋白3710.54Z32767Tobl抗增生因子9560.5D78382UnglDNA修復(fù)蛋白5350.51X99018KRT19中間纖絲蛋白6220.52M28698PLC^磷脂酶2510.52X95346整連蛋白《6細(xì)胞粘連受體2870.54X69902GLUT1葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5240.56M23384CTLA4免疫球蛋白超家族4680.57X05719FRA2Fos相關(guān)性抗原4460.57X83971MTRP溶酶體締合性蛋白4980.58U34259表20:在對(duì)肽SEQIDNO:1的應(yīng)答中多聚核苷酸表達(dá)的變化能夠通過(guò)RT-PCR證實(shí)。將RAW264.7巨噬細(xì)胞與50/;g/ml的肽共同溫育4小時(shí)，或者單獨(dú)與培養(yǎng)基溫育4小時(shí)。分離總RNA，進(jìn)行半定量RT-PCR。每種多聚核苷酸的特異性引物對(duì)被用于擴(kuò)增RNA。/肌動(dòng)蛋白的擴(kuò)增被用作陽(yáng)性對(duì)照并被用于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行密度測(cè)量分析。結(jié)果表示為被肽處理的細(xì)胞與單獨(dú)同培養(yǎng)基溫育的細(xì)胞相比，其多聚核苷酸表達(dá)中的相對(duì)倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為三次實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。多聚核苷酸陣列比值-*RT-PCR-*CXCR44.0±1.74.1±0.9IL-8RB9.5±7.67.1±1.4MCP-313.5±4.44.8±0.88<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表21:A549上皮細(xì)胞中被肽處理增量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸a。發(fā)現(xiàn)濃度為50//g/ml的陽(yáng)離子肽增加數(shù)種多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與人cDNA陣列ID#PRHU03-S3雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值肽:未刺激"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>白酶表22:A549上皮細(xì)胞中被肽處理減量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸a。發(fā)現(xiàn)濃度為50//g/ml的陽(yáng)離子肽減少數(shù)種多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與人cDNA陣列ID#PRHU03-S3雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值肽:未刺激"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>錄因子<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表23:A549細(xì)胞中被肽處理增量調(diào)節(jié)的促炎多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)濃度為50pg/ml的陽(yáng)離子肽增加某些促炎多聚核苷酸的表達(dá)(數(shù)據(jù)是表21的一部分)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與人cDNA陣列ID#PRHU03-S3雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值肽:未刺激"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表25:A549細(xì)胞中被肽處理增量調(diào)節(jié)的抗炎多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)濃度為50/ig/ml的陽(yáng)離子肽增加某些抗炎多聚核苷酸的表達(dá)(數(shù)據(jù)是表21的一部分)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與人cDNA陣列ID#PRHU03-S3雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值肽:未刺激"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表26:A549細(xì)胞中被肽處理減量調(diào)節(jié)的抗炎多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)濃度為50/zg/ml的陽(yáng)離子肽減少某些抗炎多聚核苷酸的表達(dá)(數(shù)據(jù)是表21的一部分)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與人eDNA陣列ID#PRHU03-S3雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值肽:未刺激"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表27:原代人巨噬細(xì)胞中被SEQIDNO:6增量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)i濃度為50/zg/ml的肽SEQIDNO:6增加了許多多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與人巨噬細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值肽處理:對(duì)照"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表29:HBE細(xì)胞中被SEQIDNO:1增量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)濃度為50/;g/ml的肽SEQIDNO:1增加了許多多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與人HBE上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第三歹ij。"比值肽處理:對(duì)照"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>D80006KIAA0184蛋白0.2112.6AK000768假想蛋白0.3012.3X99894胰島素啟動(dòng)子因子10.2612.0AL031177未知1.0911.2AF052091未知0.2810.9L389285,10-甲叉亞甲基四氫葉酸合成酶0.2210.6AL117421未知0.8910.1AL133606假想蛋白0.899.8NM—016227膜蛋白CH10.289.6NM—006594連接蛋白相關(guān)性蛋白復(fù)合物40.399.3U54996ZW10同源物，蛋白0.599.3AJ007557鉀通道0.289.0AF043938肌肉RAS癌基因1.248.8AK001607未知2.748.7AL031320過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生因子300.318.4D38024未知0.318.3AF059575LIM同源框TF2.088.2AF043724肝炎A病毒細(xì)胞受體10.398.1AK002062假想蛋白2.038.0L13436鈉尿多肽受體0.537.8U33749甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子10.367.6AF011792細(xì)胞周期進(jìn)程2蛋白0.317.6AK000193假想蛋白1.186.8AF039022輸出蛋白(expotin)，tRNA0.356.8M17017白介素80.506.7AF044958NADH脫氫酶0.976,5U35246囊泡分選蛋白0.486.5AK001326四次跨膜蛋白(tetraspan)31.596.5M55422克魯佩爾相關(guān)性鋅指蛋白0.346.4U44772棕櫚酰-蛋白硫酯酶1.176.3AL117485假想蛋白0.675.9AB037776未知0.755.7AF131827未知0.695.6AL137560未知0.485.2X05908膜聯(lián)蛋白Al0.815.1X68264黑素瘤黏附分子0.645.0AL161995加urturin0.864.9AF037372細(xì)胞色素c氧化酶0.484.8畫—016187橋接整合蛋白20.654.8AL137758未知0.574.8U59863TRAF家族成員相關(guān)NFKB激活物0.464.7Z30643氯離子通道Ka0.704.7<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表30:HBE細(xì)胞中被肽SEQIDNO:1(50//g/ml)減量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)濃度為50pg/ml的肽SEQIDNO:1降低了許多多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與人HBE上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA,轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。在未被刺激的細(xì)胞中多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第三列。"比值肽處理:對(duì)照"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表31:A549細(xì)胞中被式A的肽誘導(dǎo)的多聚核苷酸表達(dá)的增量調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)濃度為50/ig/ml的肽增加了許多多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。未被刺激的對(duì)照細(xì)胞中的多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第三列和第四列，它們分別對(duì)應(yīng)于用染料Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA。"ID#:對(duì)照"一列是指受呔刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>001171表32:A549細(xì)胞中被式B的肽誘導(dǎo)的多聚核苷酸表達(dá)的增量調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)濃度為50pg/ml的肽增加了許多多聚核苷酸的表達(dá)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。未被刺激的對(duì)照細(xì)胞中的多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第三列和第四列，它們分別對(duì)應(yīng)于用染料Cy3禾nCy5標(biāo)記的cDNA。"ID#:對(duì)照"一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>動(dòng)物研究經(jīng)由UBC動(dòng)物管理委員會(huì)同意(UBCACC#A01-0008)。BALB/c鼠購(gòu)自CharlesRiverLaboratories,并用標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物設(shè)施喂養(yǎng)。年齡、性別和體重匹配的成年鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射阿佛丁(4.4mM2-2-2-三溴乙醇，2.5%2-甲基-2-丁醇，在蒸餾水中)被麻醉，劑量為每10g體重200^1。使用改自Ho和Furst1973的非外科的氣管內(nèi)滴注方法實(shí)施滴注。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將已麻醉的鼠的上頜牙鉤在支撐架頂部的金屬絲上，使其顎處于打開(kāi)狀態(tài)，用彈簧推壓胸部，使其咽、喉和氣管處于一條垂直線上。從外面照亮氣管，將一根插管導(dǎo)管插入到被清楚照亮的氣管內(nèi)腔。將20//1肽懸液或無(wú)菌水置于插管近端的小孔中，并將其用200//1空氣慢慢滴注到該氣管中。滴注之后，將這些動(dòng)物于豎直位置保持2分鐘，以使該流體流到呼吸樹(shù)內(nèi)。4小時(shí)后，通過(guò)腹膜內(nèi)注射300mg/kg的戊巴比妥，將這些鼠無(wú)痛致死。將該氣管暴露，將一個(gè)靜脈內(nèi)導(dǎo)管插入到氣管近端，并用縫合線適當(dāng)?shù)叵到Y(jié)。進(jìn)行灌洗通過(guò)氣管插管將0.75毫升無(wú)菌PBS引入肺中，在數(shù)秒后，吸出該流體。該步驟用同樣的PBS樣品重復(fù)三次。將灌洗液放在管子中，并置于冰上，每只鼠的總回收體積約為0.5ml。將此支氣管肺泡灌洗(BAL)液1200rpm高速離心10分鐘，移走上清，用ELISA檢測(cè)其中的TNF-a和MCP-1。陽(yáng)離子肽對(duì)趨化因子的增量調(diào)節(jié)作用在多個(gè)不同的系統(tǒng)中被證實(shí)。鼠MCP-1是人MCP-1的同源物，它是e(C-C)趨化因子家族的成員。已經(jīng)證明MCP-1能招集單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和一些T淋巴細(xì)胞。當(dāng)來(lái)自RAW264.7巨噬細(xì)胞和3個(gè)供體的人全血被濃度不斷增加的肽SEQIDNO:1刺激時(shí)，ELISA表明它們?cè)谄渖锨逯挟a(chǎn)生了明顯量的MCP-1(表36)。被濃度范圍為20-50//g/ml的肽刺激了24小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生了明顯量的MCP-1(背景之上200-400pg/ml)。當(dāng)用100/vg/ml的LL-37刺激這些細(xì)胞(24小時(shí))和全血(4小時(shí))時(shí)，產(chǎn)生了高水平的MCP-1。陽(yáng)離子肽誘導(dǎo)趨化因子的效應(yīng)也在一種完全不同的細(xì)胞系統(tǒng)，A549人上皮細(xì)胞中被檢測(cè)。有趣的是，盡管這些細(xì)胞應(yīng)答LPS時(shí)會(huì)產(chǎn)生MCP-1,并且這種應(yīng)答會(huì)被肽拮抗；但是A549細(xì)胞直接應(yīng)答肽SEQIDNO:1時(shí)，并沒(méi)有MCP-1產(chǎn)生。然而，高濃度的肽SEQIDNO:l的確誘導(dǎo)產(chǎn)生了一種嗜中性粒細(xì)胞特異性趨化因子IL-8(表37)。因此，SEQIDNO:1在不同的濃度和在不同的細(xì)胞類型中能夠誘導(dǎo)不同范圍的應(yīng)答。測(cè)試了各個(gè)式子對(duì)應(yīng)的大量肽在A549細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-8的能力(表38)。低濃度10/ig/ml的這些肽中有許多在背景水平上誘導(dǎo)出IL-8。還發(fā)現(xiàn)高濃度(100〃g/ml)的SEQIDNO:13在全血中誘導(dǎo)出IL-8(表39)。在HBE細(xì)胞(表40)和未分化的THP-1細(xì)胞(表41)中肽SEQIDNO:2也明顯誘導(dǎo)IL-8。通過(guò)氣管內(nèi)滴注給予BALB/c鼠SEQIDNO:1或無(wú)內(nèi)毒素的水，3-4小時(shí)后檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中的MCP-1和TNF-a水平。發(fā)現(xiàn)用50pg/ml肽SEQIDNO:l處理的鼠與只給予水或麻醉劑的鼠相比，前者產(chǎn)生的MCP-1水平明顯增高(表42)。對(duì)肽SEQIDNO:1并沒(méi)有促炎應(yīng)答，因?yàn)榕c只給予水或麻醉劑的鼠相比，該肽沒(méi)有明顯誘導(dǎo)出更多的TNF-a。還發(fā)現(xiàn)，在用肽SEQIDNO:1(高到lOOpg/ml)處理的RAW264.7細(xì)胞和骨髓源巨噬細(xì)胞中，肽SEQIDNO:1沒(méi)有明顯誘導(dǎo)TNF-a的生成(表43)。因此，肽SEQIDNO:1選擇性地誘導(dǎo)趨化因子的產(chǎn)生，而不誘導(dǎo)炎癥介導(dǎo)物例如TNF-a的產(chǎn)生。這說(shuō)明肽SEQIDNO:1具有雙重作用，它既作為能夠阻止細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)的炎癥的因子，又有助于招集可清除感染的吞噬細(xì)胞。表38:RAW264.7細(xì)胞和人全血中MCP-1的誘導(dǎo)。用濃度不斷增加的LL-37刺激RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞和人全血4個(gè)小時(shí)。將人全血樣品高速離心，移走血清，用ELISA檢測(cè)其中的MCP-I,同時(shí)用ELISA檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的上清中的MCP-1。RAW細(xì)胞的數(shù)據(jù)表示為三個(gè)或更多個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差，人全血的數(shù)據(jù)表示為來(lái)自三個(gè)不同供體的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。肽，SEQIDNO:1(〃g/ml)單核細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)蛋白(MCP)-l(pg/ml)*RAW細(xì)胞全血0135.3±16.3112.7±43.310165.7±18.2239.3±113.350367±11.5371±105100571±17.4596±248.1表39:A549細(xì)胞和人全血中IL-8的誘導(dǎo)。用濃度不斷增加的肽分別刺激A549細(xì)胞和人全血24小時(shí)和4小時(shí)。將人全血樣品高速離心，移走血清，用ELISA檢測(cè)其中的IL-8，同時(shí)用ELISA檢測(cè)A549細(xì)胞的上清中的IL-8。A549細(xì)胞的數(shù)據(jù)表示為三個(gè)或更多個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差，人全血的數(shù)據(jù)表示為來(lái)自三個(gè)不同供體的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。肽，SEQIDNO:1(//g/ml)IL-8(pg/ml)A549細(xì)胞全血0172±29.1660.7±126.61206.7±46.110283.3±28.4945.3±279.920392±31.750542.3±66.2畫.3±192.41001175.3±188.3表40:A549細(xì)胞中陽(yáng)離子肽誘導(dǎo)IL-8。用10pg肽刺激A549人上皮細(xì)胞24小時(shí)。移走上清，并用ELISA檢測(cè)其中的IL-8。肽UO/ig/ml)IL-8(ng/ml)沒(méi)有肽0.164LPS,沒(méi)有肽0.26SEQIDN0:10,278SEQIDN0:60.181SEQIDN0:70.161SEQIDNO:90.21SEQIDNO:IO0.297SEQIDNO:130.293SEQIDNO:140.148SEQIDNO:160.236SEQIDNO:170.15SEQIDNO:190.161SEQIDNO:200.151SEQIDNO:210.275SEQIDNO:220.314SEQIDNO:230.284SEQIDNO:240.139SEQIDNO:260週SEQIDNO:270,346SEQIDNO:280.192SEQIDNO:290.188SEQIDNO:300.284SE(JIDNO:310.168SEQIDNO:330.328SEqIDNO:340.315SEQIDNO:350.301SEQIDNO:360.166SEQIDNO:370.269SE(3IDNO:380.171SEQIDNO:400.478SEQK)NO:410.371SE(3IDNO:420.422SEQIDNO:430.552SE(3IDNO:440.265SEQIDNO:450.266SEQIDNO:470.383<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表41:人血液中肽誘導(dǎo)IL-8。用濃度不斷增加的肽刺激人全血4小吋。將人血樣品離心，移走血清，并用ELISA檢測(cè)其中的IL-8。數(shù)據(jù)來(lái)自兩個(gè)供體的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表42:HBE細(xì)胞中IL-8的誘導(dǎo)。將濃度不斷增加的肽與HBE細(xì)胞共同溫育8小時(shí)，移走上清，并用ELISA檢測(cè)其中的IL-8。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)或更多個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表43:未分化的THP-l細(xì)胞中IL-8的誘導(dǎo)。將指定濃度的肽與人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞共同溫育8小時(shí)，移走上清，并用ELISA檢測(cè)其中的IL-8。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表44;在鼠的氣道中肽SEQIDNO:l誘導(dǎo)MCP-l。用阿佛丁將BALB/c鼠麻醉，并對(duì)其氣管內(nèi)滴注肽或水，或者不進(jìn)行滴注(不作處理)。對(duì)鼠進(jìn)行4小時(shí)監(jiān)測(cè)，并分離出BAL流體，用ELISA分析其中的MCP-l和TNF-a濃度。數(shù)據(jù)表示為各種條件的四只或五只鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表45:陽(yáng)離子肽沒(méi)有明顯誘導(dǎo)TNF-a。將指定的肽(40pg/ml)與RAW246.7巨噬細(xì)胞共同溫育6小時(shí)。收集上清，并用ELISA檢測(cè)其中的TNF-a水平。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)或更多個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。肽處理TNF-a(pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>實(shí)施例6陽(yáng)離子肽增加趨化因子受體的表面表達(dá)為了分析IL-8RB、CXCR-4、CCR2和LFA-1的細(xì)胞表面表達(dá)，RAW巨噬細(xì)胞用10〃g/ml適當(dāng)?shù)牡谝豢贵w(SantaCruzBiotechnology)染色，接著用FITCGrove:PA)]或FITC偶聯(lián)的驢抗羊IgG(SantaCruz)。用FACscan對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)10,000次并開(kāi)啟前部和側(cè)部分散器以排除細(xì)胞碎片。多聚核苷酸陣列數(shù)據(jù)表明，與未受刺激的細(xì)胞相比，一些肽分別增量調(diào)節(jié)了趨化因子受體IL-8RB、CXCR-4和CCR2的表達(dá)10、4和1.4倍。為了證實(shí)該多聚核苷酸陣列數(shù)據(jù)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)用肽刺激了4小時(shí)的RAW細(xì)胞上的受體的表面表達(dá)。當(dāng)50/zg/ml的肽與RAW細(xì)胞共同溫育4小時(shí)時(shí)，IL-8RB平均被增量調(diào)節(jié)超過(guò)未刺激的細(xì)胞2.4倍，CXCR-4平均被增量調(diào)節(jié)超過(guò)未刺激的細(xì)胞1.6倍,CCR2被增量調(diào)節(jié)超過(guò)未刺激的細(xì)胞1.8倍(表46)。作為對(duì)照，CEMA被證明可導(dǎo)致類似的增量調(diào)節(jié)。Bac2A是唯一可明顯增量調(diào)節(jié)LFA-1(高于對(duì)照細(xì)胞3.8倍)的肽。表46:在對(duì)肽的應(yīng)答中，CXCR-4、IL-8RB和CCR2的表面表達(dá)增加。用肽刺激RAW巨噬細(xì)胞4小時(shí)。清洗該細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)牡谝豢贵w和FITC標(biāo)記的第二抗體染色。顯示的數(shù)據(jù)表示平均值(用肽刺激的RAW細(xì)胞的倍數(shù)變化)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。肽濃度(ml)蛋白表達(dá)的倍數(shù)增加IL-8RBCXCR-4CCR2SEQIDNO:l101.01.01.0SEQIDNO:l501.3±0.051.3±0.031.3±0.03SEGIDNO:l1002.4±0.61.6±0.231.8±0.15SEGIDNO:31002.0±0.6沒(méi)有做4.5CEMA501.6±0.11.5±021.5±0.151003.6±0.8沒(méi)有做4.7±1.1實(shí)施例7陽(yáng)離子肽導(dǎo)致的MAP激酶的磷酸化以2.5Xl()S-5Xl()S個(gè)細(xì)胞/nil的密度接種細(xì)胞，并讓其過(guò)夜。在早晨，用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次(無(wú)血清培養(yǎng)基-4小時(shí))。去掉該培養(yǎng)基并換之以PBS，然后于37'C放置15分鐘，再于室溫15分鐘。加入肽(濃度為0.1/Vml-50^g/ml)或水，溫育10分鐘。迅速移去PBS，代之以冰冷的放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液和抑制劑(NaF、B-甘油磷酸、MOL、釩酸鹽、PMSF、亮抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽)。將培養(yǎng)板在冰上搖動(dòng)10-15分鐘，或者搖至細(xì)胞裂解，收集裂解物。對(duì)于THP-1細(xì)胞，歩驟稍有不同；要使用更多的細(xì)胞(5X106)。它們?cè)谌狈ρ宓那闆r下過(guò)夜，加入lml冰冷的PBS以停止反應(yīng)，然后放置在冰上5-10分鐘，旋轉(zhuǎn)沉淀，然后用RIPA重懸。使用蛋白質(zhì)分析(Pierce,Rockford,IL.)測(cè)定蛋白濃度。細(xì)胞裂解物(20//g蛋白)用SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。該膜用lOmMTris-HCl,pH7.5，150mMNaCl(TBS)/5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，然后在冷的含有第一抗體的TBS/0.05°/。Tween20中過(guò)夜溫育。用TBS/0.05%Tween20清洗30分鐘后，再于室溫與辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(I:0,000,在TBS/0.05%Tween20中)溫育1小時(shí)。用TBS/0.1%Tween20清洗該膜30分鐘后，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)可以看到免疫反應(yīng)性條帶。對(duì)于使用外周血單核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)外周血(50-100ml)采自所有個(gè)體。在Ficoll-Hypaque上通過(guò)密度梯度離心從外周血分離出單核細(xì)胞。間期細(xì)胞(單核細(xì)胞)被回收、洗漆，然后重懸于含有10%胎小牛血清(FCS)和1。/。L-谷酰胺的推薦的細(xì)胞培養(yǎng)的首要培養(yǎng)基(RPMI-1640)中。以每孔4乂106個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞加到6孔培養(yǎng)板中，于37'C在5。/。C02氣體中放置1小時(shí)，讓黏附發(fā)生。洗去浮在表面的培養(yǎng)基和未黏附的細(xì)胞，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和肽。由它們排斥臺(tái)盼藍(lán)的能力估計(jì)新鮮收獲的細(xì)胞中應(yīng)有>99%存活。用^:進(jìn)行剌激后，在各種磷酸酶抑制劑和激酶抑制劑存在的情況下，用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，收集裂解物。分析蛋白含量，將各個(gè)樣品的大約加載到12%SDS-PAGE凝膠上。將膠中蛋白轉(zhuǎn)移點(diǎn)到硝酸纖維素上，用含有5%脫脂奶粉和1%TritonX100的Tris緩沖鹽(TBS)封閉1小時(shí)。用磷酸化特異性抗體檢測(cè)磷酸化。由肽誘導(dǎo)的磷酸化的結(jié)果總結(jié)于表46。發(fā)現(xiàn)在鼠巨噬RAW細(xì)胞系和HBE細(xì)胞中，SEQIDNO:2導(dǎo)致p38和ERKl/2發(fā)生劑量依賴的磷酸化。在THP-1人單核細(xì)胞系中，SEQIDNO:3導(dǎo)致MAP激酶的磷酸化，在鼠RAW細(xì)胞系中，SEQIDNO:3導(dǎo)致ERK1/2的磷酸化。表47:在對(duì)肽的應(yīng)答中MAP激酶的磷酸化。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>表48:在人血單核細(xì)胞中MAP激酶的肽磷酸化(SEQIDNO:l，50/zg/ml)被用來(lái)促進(jìn)磷酸化。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>實(shí)施例8陽(yáng)離子肽通過(guò)強(qiáng)化免疫應(yīng)答對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行防御通過(guò)腹膜內(nèi)注射對(duì)BALB/c鼠施以1X1()S沙門氏菌和陽(yáng)離子肽(200;Wg)。對(duì)鼠進(jìn)行24小時(shí)監(jiān)測(cè)，此時(shí)它們死亡，取出脾臟，勻漿化，重懸于PBS,涂在含有卡那霉素(50//g/ml)的LuriaBroth瓊脂平板上。平板于37'C溫育過(guò)夜，對(duì)存活細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)(表49和50)。通過(guò)腹膜內(nèi)注射對(duì)CD-1鼠施以含有1X1()S金黃葡萄球菌的5°/。豬粘蛋白液和陽(yáng)離子肽(200Ag)(表51)。對(duì)鼠進(jìn)行3天的監(jiān)測(cè)，此吋它們死亡，取出血液，涂板，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)。通過(guò)腹膜內(nèi)(IP)注射對(duì)CD-1雄鼠施以5.8X1()6CFUEHEC細(xì)菌和陽(yáng)離子肽(200/ig)，監(jiān)測(cè)3天(表52)。在這些動(dòng)物模型的每一個(gè)中都有一部分肽表現(xiàn)出對(duì)感染的防御。當(dāng)將表49和50中的防御分析結(jié)果與表31-37中的基因表達(dá)結(jié)果作比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)在沙門氏菌模型中最具防御性的肽能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中共同的一套基因(表53)。這清楚地表明基因表達(dá)的譜型與肽展示防御的能力是一致的。最小抑制濃度(MIC)測(cè)試的結(jié)果(表54)表明，這些陽(yáng)離子肽中有許多并不直接抵抗微生物。這表明肽防御感染的能力依賴于該肽刺激宿主先天免疫的能力，而不是依賴于直接的抗微生物活性。表49:在BALB/c鼠中陽(yáng)離子肽對(duì)沙門氏菌感染的影響。將沙門氏菌和肽腹膜內(nèi)注射到BALB/c鼠中，24小時(shí)后，這些動(dòng)物無(wú)痛死亡，取出脾臟，勻漿化，用PBS稀釋，平板計(jì)數(shù)，確定細(xì)菌存活數(shù)。肽處理脾臟中的存活細(xì)菌(CFU/ml)統(tǒng)計(jì)顯著性(p值)對(duì)照2.70±0.84X105SEQIDN0:11.50土0.26X1050.12SEQIDN0:62.57土0.72X1040.03SEQIDNO:133.80±0.97X1040.04SEQIDNO:174.79±1.27X1040.04SEQIDNO:271.01±0.26XW0.06表50:在BALB/c鼠中陽(yáng)離子肽對(duì)沙門氏菌感染的影響。將沙門氏菌和肽腹膜內(nèi)注射到BALB/c鼠中，24小時(shí)后，這些動(dòng)物無(wú)痛死亡，取出脾臟，勻漿化，用PBS稀釋，平板計(jì)數(shù)，確定細(xì)菌存活數(shù)。肽處理脾臟中的存活細(xì)菌(CFU/ml)對(duì)照1.88±0.16X104SEQIDNO:481.98士0.18X104SEQIDNO:267.1±1.37X104SEQIDNO:305.79土0.43XSEQIDNO:371.57土0.44X104SEQIDN0:52.75土0.59X104SEQIDN0:75.4±0.28X10jSEQIDN0:91.23±0.87X104SEQIDNO:142.11±0.23X10jSEQIDNO:202.78土0.22X104SEQIDNO:236.16±0.32X104表51:在鼠的金黃葡萄球菌感染模型中陽(yáng)離子肽的效應(yīng)。將含有1X108細(xì)菌的5。/。豬粘蛋白液腹膜內(nèi)(IP)注射到CD-I鼠中。經(jīng)由單獨(dú)的一次腹膜內(nèi)注射施以陽(yáng)離子肽(200//g)。監(jiān)測(cè)3天，這些鼠無(wú)痛死亡，取出血液，涂板計(jì)算存活數(shù)。下列的肽在控制金黃葡萄球菌感染方面是沒(méi)有效果的SEQIDNO:48，SEQIDNO:26<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>表52:在鼠的EHEC感染模型中陽(yáng)離子肽的效應(yīng)。將5.8X1()6CFUEHEC細(xì)菌腹膜內(nèi)(IP)注射到CD-1雄鼠(5周大)中。經(jīng)由單獨(dú)的一次腹膜內(nèi)注射施以陽(yáng)離子肽(200//g)。對(duì)這些鼠進(jìn)行3天的監(jiān)測(cè)。<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>表53:在體內(nèi)有活性的肽誘導(dǎo)A549上皮細(xì)胞中基因表達(dá)譜型的增量調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)在用濃度為50//g/ml的肽SEQIDNO:30、SEQIDNO:7和SEQIDNO:13處理4小時(shí)后，每一種肽都增加了一套基因的表達(dá)。將肽與人A549上皮細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離RNA，轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。未被刺激的對(duì)照細(xì)胞中的多聚核苷酸的強(qiáng)度顯示在第二列(用Cy3和Cy5標(biāo)記cDNA兩種情況的平均值)。增量調(diào)節(jié)倍數(shù)一列是指受肽刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。表中還包括作為陰性對(duì)照的肽SEQIDNO:37，它在鼠的感染模型中沒(méi)有活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>假想蛋白(AL022393)0.124.44.04.00.4受體(AF112461)0.162.410.010.01.9假想蛋白(AK002104)0.514.72.62.61.0蛋白(AL050261)0.263.32.82.81.0多肽(AF105424)0.262.55.35.31.0SPR1蛋白(AB031480)0.733.02,72.71.3脫氫酶(D]7793)4.382.32.22.20.9轉(zhuǎn)移酶(M63509)0.552.72.12.11.0過(guò)氧化物酶體因子(AB013818)0.373.42.92.91.4表54:在此研究的多數(shù)陽(yáng)離子肽，特別是在感染模型中有效的陽(yáng)離子肽并不是明顯抗微生物的。將系列稀釋的肽與指定的細(xì)菌在96孔板中溫育過(guò)夜。殺死該細(xì)菌的肽的最低濃度表示為MIC。符號(hào)〉表示MIC太大而不能測(cè)量。8//g/ml或更低的MIC被認(rèn)為是臨床上有意義的活性?？s寫￡.^仏大腸埃希氏菌(Eyc/zer/cWaco//);51aw"wj，金黃色葡萄球菌(Srap/^/ococcwsaw/^z^);尸oen^，銅綠假單胞菌(尸"W(io附o"ay。erwg〖"ay");X/>p/H>M,鼠傷寒沙門氏菌(5Wwo"e/Zae"Zen力W/j0^/7fwMA"/ww)，CrAoJ(C//o6ac/erWzo^eww'51);EHEC，腸出血性大腸埃希氏菌(Enterohaemorrhagic￡,co//)。肽MIC(//g/ml)EHEC多黏菌素0.25160.250.50.250,5慶大霉素0.250.250.250.250.250.5SEQIDNO:l32>966484SEQIDNO:5128>>>6464SEQIDNO:6128>>1286464SEQIDNO:7>>>>>>SEQIDNO:8>>>>>>SEQEDNO:9>>>>>>SEGIDNO:10>>>>>64SEQIDNO:12>>>>>>SEQIDNO:13>>>>>>SEQIDNO:14>>>>>>SEQIDNO:15128>>>12864SEQIDNO:16>>>>>>SEQIDNO:17>>>>>>SEQIDNO:19816166444SEQIDNO:2416321664SEQIDNO:208888168SE(3IDNO:21646496643232SEQIDNO:2281224844SEQIDNO:234881644SEQIDNO:241616416164SEQIDNO:260.53264220.5<table>tableseeoriginaldocumentpage102</table實(shí)施例9由細(xì)菌信號(hào)傳導(dǎo)分子誘導(dǎo)的多聚核苷酸在診斷/篩選中的應(yīng)用鼠傷寒沙門氏菌LPS和￡co"0111:B4LPS購(gòu)自SigmaChemicalCo.(St.Louis,MO)。將金黃葡萄球菌的LTA(Sigma)重懸于無(wú)內(nèi)毒素的水(Sigma)中。對(duì)LTA制備物開(kāi)展鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(Sigma)以確定其沒(méi)有受到明顯的內(nèi)毒素污染(即，小于lng/ml，這個(gè)濃度并不會(huì)導(dǎo)致RAW細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞因子產(chǎn)物)。使用AppliedBiosystem(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)(Missisauga,ON.)的Model392DNA/RNA合成儀合成CpG寡聚脫氧核苷酸，經(jīng)純化后重懸于無(wú)內(nèi)毒素的水(Sigma)中。使用如下序列CpG:5'-TCATGACGTTCCTGACGTT-3'(SEQIDNO:57)和非CpG:5'-TTCAGGACTTTCCTCAGGTT-3'(SEQIDNO:58)。測(cè)試了非CpG寡聚物刺激細(xì)胞因子生成的能力，發(fā)現(xiàn)它沒(méi)有導(dǎo)致TNF-a或IL-6的明顯產(chǎn)生，因此可看作一種陰性對(duì)照。將RAW264.7細(xì)胞與單獨(dú)的培養(yǎng)基、100ng/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS、1//g/ml金黃葡萄球菌LTA或1//MCpG共同溫育4小時(shí)(這些濃度可最佳地誘導(dǎo)RAW細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-a)),再?gòu)倪@些細(xì)胞中分離出RNA。使用該RNA制備出多聚核苷酸cDNA探針，將其與CIontechAtlas多聚核苷酸陣列濾膜雜交，如前面所述。cDNA探針與各個(gè)固定化DNA的雜交可以通過(guò)放射自顯影法顯現(xiàn)，并且可以使用磷光顯像系統(tǒng)進(jìn)行定量。表55-59總結(jié)了至少2-3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)用LPS處理RAW264.7細(xì)胞導(dǎo)致超過(guò)60種多聚核苷酸的表達(dá)量增加，這些多聚核苷酸編碼的蛋白包括炎癥蛋白，例如IL-ie、誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)、MIP-la、MIP-ie、MIP-2a、CD40和多種轉(zhuǎn)錄因子。將LPS、LTA和CpGDNA誘導(dǎo)的多聚核苷酸表達(dá)的變化進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所有這三種細(xì)菌產(chǎn)物都以相類似的程度增加促炎多聚核苷酸的表達(dá)，例如iNOS、MIP-la、MIP-2a、IL-1P、IL-15、TNFR1和NF-kB(表57)。表57描述了被細(xì)菌產(chǎn)物以類似的程度增量調(diào)節(jié)的19種多聚核苷酸，它們的刺激比值在這三種細(xì)菌產(chǎn)物間的差異不超過(guò)1.5倍。也有幾種多聚核苷酸是被LPS、LTA和CpG以類似的程度減量調(diào)節(jié)。還發(fā)現(xiàn)在對(duì)這三種細(xì)菌產(chǎn)物的應(yīng)答中，有許多多聚核苷酸是被不同地調(diào)節(jié)的(表58)，包括其表達(dá)水平在一種或多種細(xì)菌產(chǎn)物間的差異大于1.5倍的許多多聚核苷酸。與LPS或CpG相比較而言，表達(dá)受LTA處理差異影響的多聚核苷酸最多，包括對(duì)Jun-D、Jun-B、Elk-l和細(xì)胞周期蛋白G2和Al的超量刺激。僅僅有一些多聚核苷酸的表達(dá)被LPS或CpG處理更多地改變。與LTA或CpG處理相比較而言，LPS處理更能夠增加一些多聚核苷酸的表達(dá)，包括cAMP應(yīng)答元件DNA結(jié)合蛋白(CRE-BP)、干擾素誘導(dǎo)性蛋白1和CACCC框結(jié)合蛋白BKLF。與LPS或LTA處理相比較而言，CpG處理更能夠增加一些多聚核苷酸的表達(dá)，包括白血病抑制因子(LIF)和蛋白酶連接蛋白1(PN-1)。這些結(jié)果表明，盡管LPS、LTA和CpGDNA刺激表達(dá)應(yīng)答的多聚核苷酸大部分重疊，但是它們對(duì)某些多聚核苷酸的調(diào)節(jié)也表現(xiàn)出不同的能力。被使用的其它多聚核苷酸陣列是HumanOperon陣列(該基因組的識(shí)別號(hào)是PRHU04-S1),它由點(diǎn)成雙份的約14,000個(gè)人寡聚體點(diǎn)組成。用5//g總RNA制備探針，探針用Cy3或Cy5標(biāo)記的dUTP進(jìn)行標(biāo)記。在這些實(shí)驗(yàn)中，將A549上皮細(xì)胞涂到100mm組織培養(yǎng)皿中，密度為每個(gè)培養(yǎng)皿2.5X1()s個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜溫育，然后用100ng/ml五.co//0111:B4LPS刺激4小時(shí)。用RNAqueous(Ambion)分離總RNA。用除DNA試劑盒(Ambion)除去DNA污染。由總RNA制備的探針經(jīng)純化后雜交到印刷玻璃片上，42'C過(guò)夜，然后洗漆。洗滌之后，用PerkinElmer陣列掃描儀獲取圖象。用圖象處理軟件(Im叩olynucleotide5.0，MarinaDelRey，CA)確定點(diǎn)的平均強(qiáng)度，中間強(qiáng)度和背景強(qiáng)度。使用"自制的"程序除去背景。該程序?qū)⒚總€(gè)子小格的底部強(qiáng)度計(jì)算為10%，并對(duì)每個(gè)小格減去此值。使用Polynucleotidespring軟件(RedwoodCity，CA)進(jìn)行分析。從一個(gè)玻片內(nèi)的點(diǎn)的數(shù)值集合中獲得中間點(diǎn)強(qiáng)度，并將該值與此實(shí)驗(yàn)中所有玻片的數(shù)值比較，從而使每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。LPS處理的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的相對(duì)變化可以在下面的表格中看到。表60描述了許多以前未曾報(bào)道的變化，它們?cè)谠\斷感染方面將是有用的。為了證實(shí)和評(píng)估這些變化在功能上的顯著性，通過(guò)密度分析法對(duì)所選擇的mRNA和蛋白的水平進(jìn)行估計(jì)和定量。應(yīng)用CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸堿性蛋白特異性探針進(jìn)行Northern印跡雜交，證明用所有三種細(xì)菌產(chǎn)物進(jìn)行刺激后出現(xiàn)的是類似的表達(dá)(表60)。應(yīng)用Griess試劑估計(jì)炎癥介導(dǎo)物NO的水平，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)后產(chǎn)生的NO水平是可比較的，由于NO的水平可作為一氧化氮合成酶iNOS的酶活的標(biāo)志，因此可知iNOS表達(dá)的增量調(diào)節(jié)是類似的(表59)。Western印跡雜交分析證明CpG更優(yōu)先地刺激白血病抑制因子(LIF，細(xì)胞因子IL-6家族的成員)(表59)。其他的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)證明，LPS增量調(diào)節(jié)TNF-a和IL-6的表達(dá)，如ELISA的分析結(jié)果；還增量調(diào)節(jié)MIP-2a和IL-1PmRNA的表達(dá)和減量調(diào)節(jié)DP-1和細(xì)胞周期蛋白DmRNA的表達(dá)，如Northern印跡雜交的結(jié)果。通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌元件刺激全血中促炎細(xì)胞因子生成的能力，可以將該分析擴(kuò)展到與臨床更相關(guān)的體外系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)￡.co/z'LPS、鼠傷寒沙門氏菌LPS和金黃葡萄球菌LTA都刺激類似生成量的血清TNF-a和IL-1e。CpG也刺激這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，盡管其水平要低得多，但還是部分地支持了細(xì)胞系的數(shù)據(jù)。表55:厶549上皮細(xì)胞中被￡^0//0111:B4LPS增量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸。多聚核苷酸微陣列的研究表明，￡co/Z0111:B4LPS(100ng/ml)增加許多多聚核苷酸的表達(dá)。將LPS與A549細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離出RNA。用5/zg總RNA制備用Cy3/Cy5標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。未被刺激的細(xì)胞中的強(qiáng)度顯示在表55的第三列。"比值:LPS/對(duì)照"一列是指被LPS刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>L25876細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物36.710.3L04490NADH脫氫酶6.611.1Z18948S100鈣結(jié)合蛋白6.311.0D10522肉豆蔻酰基化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物6.15.8雨—014442唾液酸結(jié)合Ig樣凝集素86.17.6U81375溶質(zhì)載體家族296.06.4AF041410惡性腫瘤相關(guān)蛋白5.95.3U24077殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體5.814.4AL137614假想蛋白4.86.8畫—002406甘露糖基(a-l，3-)-糖蛋白e-1，2-^[-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶4.75.3AB002348KIAA0350蛋白4.77.6AF165217原肌球條件蛋白4(肌肉)4.612,3Z14093支鏈酮酸脫氫酶E1，a多肽4.65.4U82671鈣牽蛋白3.844.5AL050136未知3.65.0畫—005135溶質(zhì)載體家族123.65.0AK001961假想蛋白FLJ110993.65.9AL034410未知3.221.3S74728antiquitin13.19.2AL049714核糖體蛋白L34假基因23.019.5雨—014075PRO0593蛋白2.911.5AF189279磷脂酶A2，IIE類2.837.8J03925整連蛋白，aM2.79.9雨_012177F框蛋白Fbx52.626.2麗_004519電壓門控鉀通道，KQT樣亞家族，成員32.62UM28825CD1A抗原，多肽2.616.8XI6940肌動(dòng)蛋白，Y2,腸平滑肌2.411.8X03066II類主要組織相容性復(fù)合物，DO2.236.5A謹(jǐn)1237假想蛋白FLJ103752.118.4AB028971KIAA1048蛋白2.09.4AL137665未知2.07.3表56:八549上皮細(xì)胞中被￡^0//0111:8408減量調(diào)節(jié)的多聚核苷酸。多聚核苷酸微陣列的研究表明，￡co//0111:B4LPS(100ng/ml)降低了A549細(xì)胞中許多多聚核苷酸的表達(dá)。將LPS與A549細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離出RNA。用5^g總RNA制備用Cy3/Cy5標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。未被刺激的細(xì)胞中的強(qiáng)度顯示在表格5的第三列。"比值:LPS/對(duì)照"一列是指被LPS刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。登記號(hào)基因?qū)φ罩挥斜戎礚PS/培養(yǎng)基強(qiáng)度對(duì)照函_017433肌球蛋白I1IA167.80.03X60484H4組蛋白家族成員E36.20.04X60483H4組蛋白家族成員D36.90.05AF15畫假想蛋白602.80.05M96843DNA結(jié)合的抑制蛋白2,負(fù)顯性螺30.70.05旋-環(huán)-螺旋蛋白S79854脫碘酶，碘代甲腺原氨酸，III型39,40.06AB018266matrin315.70.08M33374NADH脫氫酶107.80.09AF005220人NUP98-HOXD13融合蛋白的105.20.09mRNA,部分cdsZ80783H2B組蛋白家族，成員L20.50.10Z46261H3組蛋白家族，成員A9.70.12Z80780H2B組蛋白家族，成員H35.30.12U33931紅血球膜蛋白帶7.2(stomatin)18.90.13M6O750H2B組蛋白家族，成員A35.80.14Z83738H2B組蛋白家族，成員E19.30.15Y14690膠原蛋白，V型，a27.50.15M30938XRCC5，X射線修復(fù)，補(bǔ)充中國(guó)倉(cāng)11.30.16鼠細(xì)胞的缺陷修復(fù)功能L36055真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白182.50.16Z80779H2B組蛋白家族，成員G54.30.16AF2268695(3)-脫氧核糖核酸酶;RB相關(guān)性7.10.18KRAB阻遏物D50924KIAA0134基因產(chǎn)物91.00.18AL133415波形蛋白78.10.19AL050179原肌球蛋白1(a)41.60.19AJ005579RD元件5.40.19M80899AHNAK細(xì)胞核蛋白11.60.19畫—004873BCL2相關(guān)性athanogene56.20.19X57138H2A組蛋白家族，成員N58.30.20AF081281溶血磷脂酶I7.20.22U96759vonHippel-Linau結(jié)合蛋白I6.60.22U85977人核糖體蛋白L12假基因，部分cds342.60.22D13315乙二醛酶7.50.22AC0O3O07未知218.20.22AB032980顧S246.60.22U40282整連蛋白關(guān)聯(lián)性激酶10.10.22U81984內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白14.70.23X91788氯通道，核苷酸敏感的，1A9.60.23AF018O81膠原蛋白，XVIII型，a16.90,24<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>表57:被細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)PS、LTA和CpGDNA刺激后，以類似的程度表達(dá)的多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)物(100ng/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS、1/ig/ml金黃葡萄球菌LTA或l/zMCpG)有效地誘導(dǎo)數(shù)種多聚核苷酸的表達(dá)。將細(xì)菌產(chǎn)物與RAW細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離出RNA，轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)記的cDNA探針，并將其與Atlas陣列雜交。未被刺激的對(duì)照細(xì)胞中的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值:LPS/LTA/CpG:對(duì)照"一列是指被細(xì)菌產(chǎn)物刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受剌激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>表58:被細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)PS、LTA和CpGDNA有差異地調(diào)節(jié)的多聚核苷酸。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)物UOOng/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS、l;/g/ml金黃葡萄球菌LTA或l;/MCpG)有效地誘導(dǎo)數(shù)種多聚核苷酸的表達(dá)。將細(xì)菌產(chǎn)物與RAW細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離出RNA,轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)記的cDNA探針，并將其與Atlas陣列雜交。未被刺激的對(duì)照細(xì)胞中的強(qiáng)度顯示在第二列。"比值:LPS/LTA/CpG:對(duì)照"一列是指被細(xì)菌產(chǎn)物刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)強(qiáng)度除以未受刺激的細(xì)胞的強(qiáng)度得到的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>表59:證實(shí)表57和表58的陣列數(shù)據(jù)。a)總RNA分離自未刺激的RAW巨噬細(xì)胞和用100ng/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS、1g/ml金黃葡萄球菌LTA、1pMCpGDNA或單獨(dú)的培養(yǎng)基處理了4小時(shí)的細(xì)胞，實(shí)施Northern印跡雜交，探査膜上的GAPDH、CD14、波形蛋白和三重四脯氨酸堿性蛋白，如以前所述[Scott等]。將Northern印跡的雜交強(qiáng)度與GAPDH作比較，以發(fā)現(xiàn)上樣方面的不一致。這些實(shí)驗(yàn)至少被重復(fù)三次，表示的數(shù)據(jù)是各種條件相對(duì)于培養(yǎng)基的平均水平(使用密度分析法測(cè)量)士標(biāo)準(zhǔn)偏差。b)用100ng/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS、1〃g/ml金黃葡萄球菌LTA、1MCpGDNA或單獨(dú)的培養(yǎng)基刺激RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)。制備蛋白裂解物，在SDS-PAGE凝膠上分離，實(shí)施Western印跡雜交以檢測(cè)LIF(R&D系統(tǒng))。這些實(shí)驗(yàn)至少被重復(fù)三次，表示的數(shù)據(jù)是LIF相對(duì)于培養(yǎng)基的水平(使用密度分析法測(cè)量)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。c)用100ng/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS、1//g/ml金黃葡萄球菌LTA、1MCpGDNA或單獨(dú)的培養(yǎng)基剌激RAW巨噬細(xì)胞24小時(shí)，收集細(xì)胞上清，使用Griess試劑檢測(cè)上清中的NO形成量，NO量是用穩(wěn)定的NO代謝物亞硝酸鹽的積累量來(lái)估計(jì)的，方法如前面所述[Scott等]。表示的數(shù)據(jù)是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>表60:A549人上皮細(xì)胞中被細(xì)菌信號(hào)傳導(dǎo)分子(LPS)增量調(diào)節(jié)的基因表達(dá)譜型。多聚核苷酸微陣列的研究表明，￡co//0111:B4LPS(100ng/ml)增加A549細(xì)胞中許多多聚核苷酸的表達(dá)。將LPS與A549細(xì)胞共同溫育4小時(shí)，分離出RNA。用5//g總RNA制備Cy3/Cy5標(biāo)記的cDNA探針，并將其與HumanOperon陣列(PRHU04)雜交。未被刺激的細(xì)胞中的強(qiáng)度顯示在表55的第三列。被LPS刺激的細(xì)胞中的多聚核苷酸表達(dá)變化的這些例子代表著它們與未處理的細(xì)胞相比，強(qiáng)度水平的變化在2倍以上。<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>實(shí)施例10改變信號(hào)傳導(dǎo)以防御細(xì)菌感染鼠傷寒沙門氏菌株SL1344由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;Manassas,VA)獲得，在Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了實(shí)施巨噬細(xì)胞感染，將冷凍的甘油儲(chǔ)物接種到盛于125ml搖瓶的10mlLB中，37'C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至穩(wěn)定相。將RAW264.7細(xì)胞(lXK)S個(gè)細(xì)胞/孔)接種到24孔板中。用培養(yǎng)基稀釋細(xì)菌直至可獲得標(biāo)稱復(fù)合感染(moi)，約為100,通過(guò)1000rpm的io分鐘離心使細(xì)菌離心到單層細(xì)胞上，以使感染同步發(fā)生，再讓感染于37'C在5%c02培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行20分鐘。用PBS洗細(xì)胞3次以除去細(xì)胞外的細(xì)菌，然后將細(xì)胞在含有100//g/ml慶大霉素(Sigma,St丄ouis，MO)的DMEM+10%FBS中溫育以殺死任何殘留的細(xì)胞外細(xì)菌，避免再感染。兩小時(shí)后，將慶大霉素濃度降至10/ig/ml，并在整個(gè)分析中維持該值。細(xì)胞在感染前用具有以下濃度的抑制劑預(yù)處理30分鐘50;/MPD98059(Calbiochem)，50//MU0126(Promega)，2mM二苯碘(DPI)，250〃M乙酰香蘭酮(夾竹桃麻素，Aldrich)，lmM抗壞血酸(Sigma)，30mMN-乙酰半胱氨酸(Sigma)和2mMN^L-—甲基精氨酸(L-NMMA,MolecularProbe)或2mMNG-D-—甲基精氨酸(D-NMMA，MolecularProbe)。在感染后的即刻、2小時(shí)和6-8小時(shí)再加入新鮮的抑制劑，以保證效力。對(duì)照細(xì)胞用每毫升培養(yǎng)基同等體積的二甲基亞砜(DMSO)處理。鼠傷寒沙門氏菌SL1344在細(xì)胞內(nèi)的存活/復(fù)制用慶大霉素抗性分析測(cè)定，如以前所述。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在感染后2小時(shí)和24小時(shí)，細(xì)胞用PBS洗兩次以除去慶大霉素，用含有1%TritonX-100/0.1%SDS的PBS裂解，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目由LB瓊脂平板上的菌落數(shù)計(jì)算出。在這些感染條件下，由標(biāo)準(zhǔn)的平板計(jì)數(shù)估計(jì)，巨噬細(xì)胞平均每個(gè)細(xì)胞含有一個(gè)細(xì)菌，這樣便可在感染后的24小時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行分析。細(xì)菌的纖絲化(filamentation)與細(xì)菌應(yīng)力(stress)有關(guān)。NADPH氧化酶和iNOS能被MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)激活。結(jié)果(表61)清楚的說(shuō)明，改變細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)是可藉以解決細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌感染的一種方法。由于細(xì)菌增量調(diào)節(jié)人細(xì)胞內(nèi)的多種基因，所以阻斷信號(hào)傳導(dǎo)的這種策略代表了抗感染治療的一種普遍方法。表61:在IFN-Y致敏的RAW細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)分子MEK對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的影響。處理a效果b0無(wú)MEK抑制劑U0126降低細(xì)菌纖絲化(細(xì)菌應(yīng)力)e增加細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌數(shù)目MEK抑制劑PD98059降低細(xì)菌纖絲化(細(xì)菌應(yīng)力)e增加細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌數(shù)目NADPH氧化酶抑制劑d降低細(xì)菌纖絲化(細(xì)菌應(yīng)力)e增加細(xì)胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌數(shù)目實(shí)施例11抗病毒活性SDF-1是一種C-X-C趨化因子，它是HIV-1共受體CXCR-4的自然配體。為了抑制HIV-1的復(fù)制，考慮趨化因子受體CXCR-4和CCR5作為可能的目標(biāo)。sdf-i的晶體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出反平行的e-片層和帶正電荷的表面，這些特征對(duì)于其結(jié)合CXCR-4中帶負(fù)電荷的細(xì)胞外環(huán)是非常重要的。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，趨化因子衍生物、小的CXCR4拮抗劑，或模擬趨化因子的結(jié)構(gòu)或離子性質(zhì)的激動(dòng)劑都可以成為治療X4HIV-1感染的有用試劑。發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子肽抑制SDF-1誘導(dǎo)的T細(xì)胞遷移，這暗示這些肽可以用作CXCR-4拮抗劑。遷移分析如下進(jìn)行。用趨化性培養(yǎng)基(RPMI1640/10mMHepes/0.5。/。BSA)將人JurkatT細(xì)胞重懸至5X1()6個(gè)細(xì)胞/ml。利用5^"m聚碳酯Transwell插件(Costar)在24孔板中實(shí)施遷移分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，肽或?qū)φ沼泌吇耘囵B(yǎng)基稀釋，并置于下位腔中，同時(shí)將O.lml細(xì)胞(5Xl(^個(gè)/ml)加入到上位腔中。37'C3小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定遷移到下位腔中的細(xì)胞數(shù)目。下位腔的培養(yǎng)物用30秒的時(shí)間穿過(guò)FACscan，開(kāi)啟前部和側(cè)部分散器以排出細(xì)胞碎片。將活細(xì)胞的數(shù)目與"100%遷移對(duì)照"作比較，對(duì)于后者，5乂105個(gè)細(xì)胞被直接移液到下位腔中，然后用FACscan計(jì)數(shù)30秒。結(jié)果說(shuō)明，肽的加入導(dǎo)致人JurkatT細(xì)胞的遷移受到抑制(表62)，這很可能是因?yàn)镃XCR-4的表達(dá)受到影響(表63和64)。表62:肽抑制人JurkatT細(xì)胞的遷移:<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>表63:對(duì)應(yīng)于表56的多聚核苷酸陣列數(shù)據(jù):<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>表64:對(duì)應(yīng)于表62和63的FACs數(shù)據(jù):<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>盡管本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)引用優(yōu)選的實(shí)施方案被描述，但是應(yīng)該理解，可以在不脫離本發(fā)明的精神的情況下作出各種改變。因此，本發(fā)明僅受權(quán)利要求的限制。權(quán)利要求1.一種鑒定受一種或多種膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)和被肽變更的多聚核苷酸或多聚核苷酸譜型的方法，該方法包括將一種或多種多聚核苷酸與一種或多種膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物接觸，并同時(shí)或隨后立即將該種或該多種多聚核苷酸與肽接觸，檢測(cè)表達(dá)上的變化，其中一種變化作為受膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)和被肽降低的多聚核苷酸或多聚核苷酸譜型的標(biāo)志。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中該膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物為L(zhǎng)PS，LTA或CpGDNA,細(xì)菌成分或整個(gè)細(xì)胞，或相關(guān)試劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)表達(dá)上的變化包括在和膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物接觸之前和之后檢測(cè)多聚核苷酸的表達(dá)水平。4.通過(guò)權(quán)利要求1的方法確定的多聚核苷酸或多聚核苷酸譜型。5.根據(jù)權(quán)利要求4的多聚核苷酸或多聚核苷酸譜型，其中該多聚核苷酸編碼涉及炎癥或膿毒癥應(yīng)答的多肽。6.—種鑒定阻止膿毒癥或炎癥的試劑的方法，該方法包括將含有權(quán)利要求5的多聚核苷酸的細(xì)胞與一種試劑接觸，其中，與不存在該試劑時(shí)的表達(dá)相比較，在存在該試劑時(shí)該多聚核苷酸的表達(dá)受到了調(diào)節(jié)，并且在表達(dá)上的這種調(diào)節(jié)影響炎癥或膿毒癥應(yīng)答。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中該影響為抑制炎癥或膿毒癥應(yīng)答。8.通過(guò)權(quán)利要求6的方法確定的試劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑，其中該試劑為肽、肽模擬物、化學(xué)化合物、核酸分子或多肽。10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑，其中該肽是選自SEQIDNO:11-54。11.一種鑒定代表炎癥或膿毒癥應(yīng)答受抑制的多聚核苷酸表達(dá)譜型的方法，該方法包括在存在或缺少肽的情況下，將細(xì)胞與LPS、LTA、CpGDNA和/或完整細(xì)菌或細(xì)菌成分接觸；以及檢測(cè)在存在或缺少該肽的情況下細(xì)胞的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其中在該肽存在時(shí)的譜型代表炎癥或膿毒癥應(yīng)答受到抑制。12.—種鑒賓抑制炎癥或膿毒癥應(yīng)答的化合物的方法，該方法包括將細(xì)胞與一種或多種被懷疑能夠抑制炎癥或膿毒癥應(yīng)答的化合物接觸，確定提供了與權(quán)利要求11所述方法中得到的抑制炎癥或膿毒癥應(yīng)答的肽所得到的相類似的譜型的多聚核苷酸表達(dá)譜型的化合物。13.通過(guò)權(quán)利要求12的方法確定的化合物。14.一種鑒定強(qiáng)化先天免疫的試劑的方法，該方法包括將一種或多種編碼涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸與感興趣的試劑接觸，其中，與不存在該試劑時(shí)的多聚核苷酸表達(dá)相比較，在存在該試劑時(shí)該多聚核苷酸的表達(dá)被調(diào)節(jié)，并且該被調(diào)節(jié)的表達(dá)導(dǎo)致先天免疫的強(qiáng)化。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該試劑不刺激膿毒癥反應(yīng)。16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該試劑減少炎癥或膿毒癥應(yīng)答。17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該試劑阻止炎癥或膿毒癥應(yīng)答。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17中任一項(xiàng)所述的方法，其中該試劑增加編碼抗炎基因的多聚核苷酸的表達(dá)。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中抗炎基因選自包括IL-1R拮抗劑同源物l(AI167887)、IL陽(yáng)10RP(AA486393)、IL-10Ra(U00672)、TNF受體成員1B(AA150416)、TNF受體成員5(H98636)、TNF受體成員lib(AA194983)、HLAII的IK細(xì)胞因子減量調(diào)節(jié)物(R39227)、TGF-B誘導(dǎo)性早期生長(zhǎng)應(yīng)答2(AI473938)、CD2(AA927710)、糖皮質(zhì)素相關(guān)性多聚核苷酸(AK000892)或IL-IO(M57627)的基因。20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該試劑抑制TNF-a的表達(dá)。21.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該試劑抑制白介素的表達(dá)。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中該白介素為IL-8。23.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該試劑為肽。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中該肽選自SEQIDNO:11-54。25.根據(jù)權(quán)利要求16或17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的試劑降低蛋白酶體亞基表達(dá)。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的蛋白酶體亞基包括具有登記號(hào)D11094,L02426,D00763，AB009398,AF054185,M34079,M34079或AL031177的多聚核苷酸。27.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該試劑為鋅指蛋白(AF061261);細(xì)胞周期基因(S70622);IL-10受體(U00672);轉(zhuǎn)移酶(AF038664);同源框蛋白(AC004774);分叉頭型蛋白(AF042832);未知(AL096803);KIAA0284蛋白(AB006622);假想蛋白(AL022393);受體(AF112461);假想蛋白(AK002104);蛋白(AL050261);多肽(AF105424);SPR1蛋白(AB031480);脫氫酶(D17793):轉(zhuǎn)移酶(M63509);和過(guò)氧化物酶體因子(AB013818)。28.通過(guò)權(quán)利要求14的方法確定的試劑。29.權(quán)利要求28所述的試劑，其中該試劑為肽、肽模擬物、化學(xué)化合物或核酸分子。30.—種鑒定多聚核苷酸表達(dá)譜型以確定選擇性地強(qiáng)化先天免疫的化合物的方法，該方法包括檢測(cè)在有肽接觸時(shí)和無(wú)肽接觸時(shí)細(xì)胞的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其中，在該肽存在時(shí)的譜型代表刺激先天免疫；檢測(cè)在有一種受測(cè)化合物接觸時(shí)細(xì)胞的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其中，使用該受測(cè)化合物時(shí)的譜型與在該肽存在時(shí)觀察到的譜型相類似，則表示化合物強(qiáng)化先天免疫。31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該化合物不刺激膿毒癥反應(yīng)。32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該多聚核苷酸表達(dá)譜型包括炎性的多聚核苷酸的表達(dá)。33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中該炎性的多聚核苷酸包括環(huán)指蛋白10(D8745D、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MASK(AB040057)、KIAA09I2蛋白(AB020719)、KIAA0239蛋白(D87076)、RAP1、GTP酶激活蛋白1(M64788)、FEM-1樣死亡受體結(jié)合蛋白(AB007856)、組織蛋白酶S(M906%)、假想蛋白FLJ20308(AK000315)、pim-l癌基因(M54915)、蛋白酶體亞基e型5(D29011)、KIAA0239蛋白(D87076)、氣管支氣管黏蛋白5亞型B(AJ001403)、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白CREBPa、整連蛋白aM(J03925)、與Rho相關(guān)的激酶2(NM—004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL161991、AL031983)、視黃酸受體(X06614)、G蛋白偶聯(lián)受體(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趨化因子(C-C基序)受體7(L31584)、腫瘤壞死因子受體超家族成員17(Z29575)、干擾素Y受體2(U05875)、細(xì)胞因子受體樣因子1(AF059293)、I類細(xì)胞因子受體(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受體樣2(U92971)、白血病抑制因子受體(NM—02310)、干擾素Y受體1(AL050337)或它們的任意組合。34.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該表達(dá)譜型包括編碼趨化因子的多聚核苷酸的表達(dá)。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中該趨化因子包括CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP-1a、MDC、MIP-3a、MCP-1、MCP-2、MCP陽(yáng)3、MCP-4、MCP-5和RANTES。36.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該表達(dá)譜型包括細(xì)胞分化因子的表達(dá)。37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中該細(xì)胞分化因子包括TGFP誘導(dǎo)性早期生長(zhǎng)應(yīng)答2(AI473938)，鋅指蛋白(AF061261，U00115,X78924),和轉(zhuǎn)錄因子(U31556，AL137681,X68560)。38.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該多聚核苷酸表達(dá)譜型包括細(xì)胞表面受體的表達(dá)。39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中該細(xì)胞表面受體包括趨化因子受體或整連蛋白受體。40.通過(guò)權(quán)利要求30的方法確定的化合物。41.權(quán)利要求40所述的化合物，其中該化合物刺激趨化因子或趨化因子受體表達(dá)。42.權(quán)利要求41所述的化合物，其中該趨化因子或趨化因子受體是CXCR4、CCR5、CCR2、CCR6、MIP-1a、IL-8、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP隱4或MCP-5。43.權(quán)利要求40所述的化合物，其中該化合物為肽、肽模擬物、化學(xué)化合物或核酸分子。44.根據(jù)權(quán)利要求43的化合物，其中所述的肽是選自SEQEDNO:11-54。45.根據(jù)權(quán)利要求40的化合物，其中該化合物改變激酶活性。46.根據(jù)權(quán)利要求45的化合物，其中該激酶選自MAP激酶激酶3(D87116)，MAP激酶激酶6(H07920),MAP激酶激酶5(W69649),MAP激酶7(H39192),MAP激酶12(AI936909)，被MAP激酶激活的蛋白激酶3(W68281),或MAP激酶激酶l(L11284)。47.—種鑒定能夠選擇性強(qiáng)化先天免疫的試劑的方法，包括將含有一種或多種編碼涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸的細(xì)胞與感興趣的試劑接觸，其中，與不存在該試劑時(shí)的表達(dá)相比較，在存在該試劑時(shí)該種多聚核苷酸或該多種多聚核苷酸的表達(dá)被調(diào)節(jié)，并且該被調(diào)節(jié)的表達(dá)導(dǎo)致先天免疫的強(qiáng)化。48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中該表達(dá)譜型被應(yīng)用于篩選強(qiáng)化先天免疫的化合物。49.一種鑒定既能夠抑制或阻止膿毒癥或炎癥應(yīng)答又能夠強(qiáng)化先天免疫的試劑的方法，包括將含有i)一種或多種編碼能夠抑制炎癥或膿毒癥應(yīng)答的多肽的多聚核苷酸和ii)一種或多種編碼涉及先天免疫的多肽的多聚核苷酸的細(xì)胞與感興趣的試劑接觸，其中，與不存在該試劑時(shí)的該種多聚核苷酸或該多種多聚核苷酸表達(dá)相比較，在存在該試劑時(shí)該種多聚核苷酸或該多種多聚核苷酸的表達(dá)被調(diào)節(jié)，并且該被調(diào)節(jié)的表達(dá)導(dǎo)致炎癥或膿毒癥應(yīng)答的抑制和先天免疫的強(qiáng)化。50.—種由哺乳動(dòng)物個(gè)體的核酸樣品推斷該個(gè)體的感染狀態(tài)的方法，該方法包括鑒定該核酸樣品中的多聚核苷酸表達(dá)譜型，例示為表55中的至少兩種多聚核苷酸的表達(dá)與未感染的個(gè)體相比有增加。51.—種由哺乳動(dòng)物個(gè)體的核酸樣品推斷該個(gè)體的感染狀態(tài)的方法，該方法包括鑒定該核酸樣品中的多聚核苷酸表達(dá)譜型，例示為表56中的至少兩種多聚核苷酸的表達(dá)與未感染的個(gè)體相比有減少。52.—種由哺乳動(dòng)物個(gè)體的核酸樣品推斷該個(gè)體的感染狀態(tài)的方法，該方法包括鑒定該核酸樣品中的多聚核苷酸表達(dá)譜型，例示為表57中的至少兩種多聚核苷酸與未感染的個(gè)體相比較的多聚核苷酸表達(dá)。53.—種用于由其核酸樣本推斷哺乳動(dòng)物個(gè)體感染情況的方法，該方法包括鑒別該核酸樣本中的多聚核苷酸譜型，多聚核苷酸譜型由至少兩個(gè)選自下列各項(xiàng)的多聚核苷酸變化為例登記號(hào)D87451，環(huán)指蛋白10;登記號(hào)AL049975,未知；登記號(hào)U39067,真核翻譯起始因子3亞基2;登記號(hào)AK000942,未知；登記號(hào)AB040057,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MASK;登記號(hào)AB020719，KIAA0912蛋白；登記號(hào)AB007856,FEM-1樣死亡受體結(jié)合蛋白；登記號(hào)AL137376,未知；登記號(hào)AL137730，未知登記號(hào)M90696，組織蛋白酶S;登記號(hào)；登記號(hào)AK001143,未知登記號(hào)AF038406，NADH脫氫酶；登記號(hào)AK000315，假想蛋白FLJ20308;登記號(hào)M54915，pim-l癌基因登記號(hào)D290U，蛋白酶體亞基e型5;登記號(hào)AL034348，未知；登記號(hào)D87076，KIAA0239蛋白登記號(hào)AJ001403，氣管支氣管粘蛋白5亞型B:登記號(hào)J03925，整連蛋白aM:與Rho相關(guān)的激酶2(NM_004850)、PTD017蛋白(AL050361)、未知基因(AK001143、AK034348、AL049250、AL161991、AL031983)，視黃酸受體(X06614)、G蛋白偶聯(lián)受體(Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579)、趨化因子(C-C基序)受體7(L31584)、腫瘤壞死因子受體超家族成員17(Z29575)、干擾素Y受體2(U05875)、細(xì)胞因子受體樣因子1(AF059293)、I類細(xì)胞因子受體(AF053004)、凝集因子II(凝血酶)受體樣2(U92971)、白血病抑制因子受體(NM—002310)、干擾素Y受體1(AL050337)或它們的任意組合。54.根據(jù)權(quán)利要求50、51、52或53的任意一個(gè)的方法，其中該感染狀態(tài)由細(xì)菌、病毒、真菌或寄生物引起。55.根據(jù)權(quán)利要求50、51、52或53的任意一個(gè)的方法，其中該感染狀態(tài)由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌引起。56.具有由權(quán)利要求50、51、52或53的方法鑒定的感染狀態(tài)的個(gè)體的多聚核苷酸表達(dá)譜型。57.作為CXCR-4的拮抗劑的肽。58.—種鑒定作為CXCR-4的拮抗劑的肽的方法，包括在該肽存在或不存在的情況下將T細(xì)胞和SDF-1接觸，并測(cè)量趨化性，其中，在該肽存在時(shí)趨化性降低，則表明該肽是CXCR-4的拮抗劑。59.包含通式X,LX2X3KX4X2XsX3PX3X,(SEQIDNO:ll)的被分離的肽，其中X!是一個(gè)或兩個(gè)D、E、S、T或N，X2是一個(gè)或兩個(gè)P、G或D，X3是一個(gè)G、A、V、L、I或Y，X4是一個(gè)R、K或H，Xs是一個(gè)S、T、C、M或R。60.根據(jù)權(quán)利要求59的肽，其中該肽選自DLPAKRGSAPGST(SEQIDNO:12)，SELPGLKHPCVPGS(SEQIDNO:13)，TTLGPVKRDSIPGE(SEQIDNO:14)，SLPIKHDRLPATS(SEQIDNO:15),ELPLKRGRVPVE(SEQIDNO:16)和NLPDLKKPRVPATS(SEQIDNO:17)。61.根據(jù)權(quán)利要求59的肽，其中該肽具有抗炎癥活性。62.根據(jù)權(quán)利要求59的肽，其中該肽具有抗膿毒癥活性。63.包含通式X,X2X3X4WX4WX4XsK(SEQIDNO:18)的被分離的肽，其中X,是一至四個(gè)選自A、P或R的氨基酸，X2是一個(gè)或兩個(gè)芳香性氨基酸(F、Y和W),X3是一個(gè)P或K，X4是零至兩個(gè)選自A、P、Y或W的氨基酸，Xs是一至三個(gè)選自R或P的氨基酸。64.根據(jù)權(quán)利要求63的肽，其中該肽選自RPRYPWWPWWPYRPRK(SEQIDNO:19)，RRAWWKAWWARRK(SEQIDNO:20)，RAPYWPWAWARPRK(SEQIDNO:21)，RPAWKYWWPWPWPRRK(SEQIDNO:22)，RAAFKWAWAWWRRK(SEQIDNO:23)禾QRRRWKWAWPRRK(SEQIDNO:24)。65.根據(jù)權(quán)利要求63的肽，其中該肽具有抗炎癥活性。66.根據(jù)權(quán)利要求63的肽，其中該肽具有抗膿毒癥活性。67.包含通式X,X2X3X4》VX3X4RGX4X3X4XiX3X,(SEQIDNO:25)的被分離的肽，X,是一個(gè)或兩個(gè)R或K,X2是一個(gè)極性或帶電荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R禾卩H),X3是C、S、M、D或A，X4是F、I、V、M或R。實(shí)施例四本發(fā)明方案中探針修飾的第二種方法。探針的5，端修飾了生物素，3'端修飾了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。實(shí)施例五本發(fā)明方案中探針修飾的第三種方法。探針的中間不同位置分別標(biāo)記了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。實(shí)施例六本發(fā)明方案檢測(cè)目標(biāo)基因的第一種檢測(cè)模式。本方法檢測(cè)過(guò)程如圖3所示，"目標(biāo)基因序列"是和H5N1RNA病毒HA基因的一段區(qū)域，根據(jù)該目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)單鏈DNA"報(bào)告探針"(RP)。RP按實(shí)施例一中的修飾方法修飾之后，即探針的3'端修飾了生物素，5'端修飾SMD(磺胺對(duì)甲氧嘧啶)后，與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠孵育，形成帶磁珠的探針，在下述反應(yīng)條件下，RP與"目標(biāo)基因序列"結(jié)合，在N.BstNBI酶作用下，RP被切刻成兩段較短的片段，與目標(biāo)基因結(jié)合不穩(wěn)定，而與其脫離，新的探針又可以結(jié)合在目標(biāo)序列上，重復(fù)上述反應(yīng)，最終形成被切刻探針的拷貝數(shù)增多，即檢測(cè)信號(hào)的放大。將反應(yīng)液置于磁場(chǎng)中，被切刻的標(biāo)記SMD的一段較短探針游離于溶液中，用SMD檢測(cè)試紙對(duì)此溶液進(jìn)行檢測(cè)，以實(shí)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)被切刻探針上的SMD而達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)序列基因。以下為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式68.根據(jù)權(quán)利要求67的肽，其中該肽選自RRMCIKVCVRGVCRRKCRK(SEQIDNO:26)，KRSCFKVSMRGVSRRRCK(SEQIDNO:27)，KKDAIKKVD1RGMDMRRAR(SEQIDNO:28)，RKMVKVDVRG薩RKDRR(SEQIDNO:29),KQCVKVAMRGMALRRCK(SEQIDNO:30)禾卩RREAIRRVAMRGRDMKRMRR(SEQIDNO:31)。69.根據(jù)權(quán)利要求67的肽，其中該肽具有抗炎癥活性。70.根據(jù)權(quán)利要求67的肽，其中該肽具有抗膿毒癥活性。71.包含通式X!X2X3X4^VXsX4RGX4X5X4XiX3X,(SEQIDNO:32)的被分離的肽，Xi是一個(gè)或兩個(gè)R或K，X2是一個(gè)極性或帶電荷的氨基酸(S、T、M、N、Q、D、E、K、R禾nH)，X3是一個(gè)C、S、M、D或A，X4是一個(gè)F、I、V、M或R，Xs是一個(gè)A、I、S、M、D或R。72.根據(jù)權(quán)利要求71的肽，其中該肽選自RTCVKRVAMRGIIRKRCR(SEQIDNO:33)，KKQMMKRVDVRGISVKRKR(SEQIDNO:34)，KESIKVIIRGMMV腹KK(SEQIDNO:35)，RRDCRRVMVRGIDIKAK(SEQIDNO:36),KRTAIKKVSRRGMSVKARR(SEQIDNO:37)禾口RHCIRRVSMRG畫RRCK(SEQIDNO:38)。73.根據(jù)權(quán)利要求71的肽，其中該肽具有抗炎癥活性。74.根據(jù)權(quán)利要求71的肽，其中該肽具有抗膿毒癥活性。75.包含通式KXiKX2FX2KMLMX2ALKKX3(SEQIDNO:39)的被分離的肽，其中X!是一個(gè)極性氨基酸(C、S、T、M、N和Q);X2是一個(gè)A、L、S或K，X3是1-17個(gè)選自G、A、V、L、I、P、F、S、T、K和H的氨基酸。76.根據(jù)權(quán)利要求75的肽，其中該肽選自KCKLFKKMLMLALKKVLTTGLPALKLTK(SEQIDNO:40)，KSKSFLKMLMKALKKVLTTGLPALIS(SEQIDNO:41)，KTKKFAKMLMMALKKVVSTAKPLAILS(SEQIDNO:42)，KMKSFAKMLMLALKKVLKVLTTALTLKAGLPS(SEQIDNO:43),KNKAFAKMLMKALKKVTTAAKPLTG(SEQIDNO:44)和KQKLFAKMLMSALKKKTLVTTPLAGK(SEQIDNO:45)。77.根據(jù)權(quán)利要求75的肽，其中該肽具有抗炎癥活性。78.根據(jù)權(quán)利要求75的肽，其中該肽具有抗膿毒癥活性。79.包含通式KWKX2X,X,X2X2X《2X2X^X2X2lFHTALKPISS(SEQIDNO:46)的被分離的肽，其中，X,是疏水性氨基酸，X2是親水性氨基酸。80.根據(jù)權(quán)利要求79的肽，其中該肽選自KWKSFLRTFKSPVRTIFHTALKPISSSEQIDNO:47)，KWKSYAHTMSPVRLIFHTALKPISScSEQIDNO:48)，KWKRGAHRFMKFLSTIFHTALKPISScSEQIDNO:49)，KWKKWAHSPRKVLTRIFHTALKPISScSEQIDNO:50)，KWKSLVMMFKKPARRIFHTALKPISScSEQIDNO:51)和KWKHALMKAHMLW畫IFHTALKPISS(SEQIDNO:52)。81.根據(jù)權(quán)利要求79的^C，其中該肽具有抗炎癥活性。82.根據(jù)權(quán)利要求79的肽，其中該肽具有抗膿毒癥活性。83.含有序列KWKSFLRTFKSPVRTVFHTALKPISS(SEQIDNO:53)的被分離的肽。84.含有序列KWKSYAHTIMSPVRLVFHTALKPISS(SEQIDNO:54)的被分離的肽。85.降低SDF-l受體的多聚核苷酸表達(dá)的被分離的肽。86.根據(jù)權(quán)利要求59-84的任何一項(xiàng)的肽，其中所述的肽包含至少一個(gè)D-對(duì)映異構(gòu)體的氨基酸。87.根據(jù)權(quán)利要求59-84的任何一項(xiàng)的肽，其中所述的肽是環(huán)狀的。88.根據(jù)權(quán)利要求57或59-87的任何一項(xiàng)的肽，其中所述的肽是陽(yáng)離子性的。89.根據(jù)權(quán)利要求86或88的肽，其中所述的肽是環(huán)狀的。90.—種剌激個(gè)體的先天免疫的方法，該方法包括給予個(gè)體一個(gè)可以達(dá)到醫(yī)療效果的數(shù)量的肽來(lái)刺激免疫應(yīng)答，所述的肽被闡述在SEQIDNO:1-3、11、18、25、32、39、46、53或54中。91.根據(jù)權(quán)利要求90的方法，其中所述的先天免疫被宿主免疫細(xì)胞的激活、增殖、分化、細(xì)胞表面的抗原表達(dá)、細(xì)胞骨架的重構(gòu)或者M(jìn)AP激酶通路的激活所證明。92.根據(jù)權(quán)利要求91的方法，其中所述的MAP激酶是MEK和/或ERK。93.根據(jù)權(quán)利要求90的方法，其中所述的肽有抗炎癥活性。94.根據(jù)權(quán)利要求90的方法，其中所述的肽有抗膿毒癥活性。95.根據(jù)權(quán)利要求90的方法，其中所述的肽包含至少一個(gè)D-對(duì)映異構(gòu)體的氨基酸。96.根據(jù)權(quán)利要求卯的方法，其中所述的肽是環(huán)狀的。97.根據(jù)權(quán)利要求1-3、11、12、23、24、30-39、58、90-96的任何一項(xiàng)的方法，其中所述的肽是陽(yáng)離子性的。98.根據(jù)權(quán)利要求1-3、11、12、23、24、30-39、58、90-97的任何一項(xiàng)的方法，其中所述的肽是反向的。99.根據(jù)權(quán)利要求57或59-89的任何一項(xiàng)的肽，其中所述的肽是反向的。全文摘要描述了一種鑒定受一種或多種膿毒癥或炎癥誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)和受陽(yáng)離子肽抑制的多聚核苷酸或多聚核苷酸譜型的方法。一種鑒定代表炎癥或膿毒癥應(yīng)答受抑制的多聚核苷酸表達(dá)譜型的方法。該方法包括在存在或缺少肽的情況下，將細(xì)胞與LPS、LTA、CPGDNA和/或完整微生物或微生物成分接觸；檢測(cè)在存在或缺少該肽的情況下細(xì)胞的多聚核苷酸表達(dá)譜型，其中在該肽存在時(shí)的譜型代表炎癥或膿毒癥應(yīng)答受到抑制。還包括由本發(fā)明的方法鑒定的化合物和試劑。在另一方面，本發(fā)明提供用于強(qiáng)化個(gè)體的先天免疫的方法和化合物。文檔編號(hào)C07K14/00GK101215601SQ200710168028公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2002年12月2日優(yōu)先權(quán)日2001年12月3日發(fā)明者B·B·芬利,C·M·羅森伯格,D·鮑迪什,J-P·S·鮑爾斯,M·G·斯科特,R·E·W·漢考克申請(qǐng)人:英屬哥倫比亞大學(xué)