結(jié)合人類補體c5的穩(wěn)定多肽的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)合人類補體組分5(C5)的多肽，以及所述多肽在治療中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 補體蛋白C5是補體系統(tǒng)的主要成分;先天免疫系統(tǒng)的關鍵部分。補體系統(tǒng)是一個 復雜免疫監(jiān)測系統(tǒng)，其具有受到嚴格控制、在多種過程中的許多任務。它作為抵御其他生物 感染的第一道宿主防御系統(tǒng)起作用，并且也將健康的宿主組織與細胞碎片、凋亡的和壞死 的細胞區(qū)別開。此外，它參與了清除免疫復合體、調(diào)節(jié)適應性免疫反應、促進組織再生、血管 生成、干細胞動員和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育(woodruff等Mol Immunol 2011，48( 14) :1631-1642;Ricklin等Nat Immunol 2010,11(9) :785-795)。擾亂補體激活和調(diào)節(jié)的精細平衡的 任何觸發(fā)，例如錯誤的或無限制地激活或不足的調(diào)節(jié)，可能導致包括自我攻擊宿主細胞導 致大量組織損傷的病態(tài)狀況。
[0003] 補體系統(tǒng)由30種蛋白質(zhì)組成。存在三種啟動補體的途徑:經(jīng)典途徑使用Clq識別細 胞表面的免疫復合體；當甘露醇結(jié)合凝集素(MBL)識別某些糖時，啟動凝集素途徑;和由補 體因子3(C3)水解自發(fā)啟動的備用途徑，該過程受到在入侵病原體上不存在的某些哺乳動 物細胞表面分子的抑制。這條備用途徑也作為補體系統(tǒng)的放大環(huán)路。所有三條途徑匯聚于 C3級別。C3裂解成C3a和C3b導致形成轉(zhuǎn)化酶，這種轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)而裂解補體因子5(C5)成C5a和 C5b<X5是各種免疫細胞的非常有效的引誘劑，而C5b與C6-9寡聚體化形成被稱為膜攻擊復 合體(MAC)或有時末端補體復合體(TTC)的孔。補體系統(tǒng)激活導致許多機制，目的是中和病 原體;在細胞諸如入侵細菌表面形成MAC導致溶解，沉積C3和C4裂解產(chǎn)物C3b和C4b有助于調(diào) 理素作用，導致由巨噬細胞吞噬病原體的作用和過敏毒素諸如C3a和C5a吸引單核細胞和中 性粒細胞到激活的位點，上調(diào)表面標志物，導致增強的免疫敏感性和細胞因子的釋放。
[0004] C5是190-kDa的糖蛋白，包含兩個二硫鍵連接的多肽鏈α和β，其分子質(zhì)量分別是 115和75kDa(Tack等Biochem 1979，18:1490-1497)。他￥11&11(1 等（J Immun 1991,146:362-368)構(gòu)建人類補體pr〇-C5的完整的cDNA序列，所述cDNA序列被預測編碼一個1676個氨基酸 的前體分子，這個前體分子包含18個氨基酸的前導肽和分開0和<1鏈的4個氨基酸接頭(SEQ ID NO: 251)。由于C5為所有補體激活途徑共有，不論刺激為何，阻斷C5將終止級聯(lián)反應的進 程，從而防止末端補體激活的有害的性質(zhì)，同時使鄰近的補體級聯(lián)的免疫保護和免疫調(diào)節(jié) 功能保持原樣。
[0005] 補體系統(tǒng)在抵御病原菌中的總體關鍵作用使其成為用于藥物學介入的令人關注 的目標。補體的許多突變或受損的調(diào)節(jié)參與各種疾病和狀況的事實強調(diào)了這點。這些包括 對自身免疫性疾病諸如系統(tǒng)紅斑狼瘡(SLE)增強的易感性，其中免疫復合體沉積引發(fā)經(jīng)典 途徑(Manderson等Annu Rev Immunol 2004,22:431_456)。此外，補體蛋白C1-C5的突變常 常導致SLE或類似SLE的癥狀。補體系統(tǒng)強烈參與的其他自身免疫性疾病是風濕性關節(jié)炎 (RA )，其中免疫復合體可能激活在RA關節(jié)處的補體、Sj 0gren氏綜合征、皮肌炎、和其他自身 抗體驅(qū)動的疾病諸如Gui Ilain-Barrg綜合征(GBS)、Fisher綜合征(Kaida等J .Neuroimmun 2010，223:5-12)、不同類型的血管炎、系統(tǒng)性硬化病、抗小球的基膜(anti-GBM)和抗磷脂綜 合征（APS)(Chen等J Autoimmun 2010,34:J276_J286)。而且，在諸如牙周炎（Abe等J Immunol 2012，189:5442-5448)、傷 口愈合（Cazender等Clin Dev Immunol 2012,在線出 版）、腫瘤生長(Markiewski等Nat Immunol 2008,9:1225-1235)和眼部疾病(諸如葡萄膜炎 和年齡相關的黃斑變性(AMD)) (Copland等Clin Exp Tmmunol 2009，159:303-314)的不同 狀況的動物模型中，補體抑制已經(jīng)被證明有效。
[0006] 靶向人類補體C5的抗體從例如，WO 95/29697、W0 02/30985和WO 2004/007553可 知。依庫麗單抗(Soliris?)是一種針對蛋白C5的人源化的單克隆抗體并且防止C5裂解成 C5a和C5b。依庫麗單抗已經(jīng)顯示出在治療陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)中是有效的，并 且被批準用于這種適應癥，PNH是一種罕見的并且有時危及生命的以血管內(nèi)溶血性貧血、血 栓形成傾向和骨髓衰竭為特征的血液疾病。依庫麗單抗最近也被Π)Α批準用于治療非典型 的溶血綜合征(aHUS)，一種由于備用補體途徑失控導致過度激活引起的罕見但危及生命的 疾病，表現(xiàn)為:血栓性微血管病(TMA)，導致?lián)p害生命器官諸如腎臟、心臟和腦的持續(xù)危險。 在aHUS中，移植受損的器官只能暫時地幫助患者，因為肝臟繼續(xù)產(chǎn)生控制蛋白（通常是補體 因子H或備用途徑的其他蛋白）的突變形式。短暫的急性的病理生理的相關疾病是由通過感 染志賀毒素陽性大腸桿菌（STEC-HUS)導致的HUS，并且也存在對這一病癥暗示藥效的有希 望的臨床數(shù)據(jù)(Lapeyraque等N Engl J Med 2011,364:2561-2563)。最后，C5阻斷抗體依庫 麗單抗已經(jīng)證明在高度不匹配的腎臟接受者中防止抗體介導的排斥（AMR)是有效的 (Stegall，M.D.等 Am J Transplant 2011,11:2405-2413)，及在治療自身免疫神經(jīng)病諸如 視神經(jīng)脊髓炎和重癥肌無力中是有效的（Pittock等Lancet Neurol 2013,12:554-562; Howard等Muscle Nerve 2013，48:76-84)〇
[0007] 除了全長的抗體，在文獻中描述了靶向C5的單鏈可變片段（scFV )、小體 (minibody)和適配體。這些C5抑制物可結(jié)合在C5分子的不同位點(表位)并且可具有不同的 作用模式。例如，依庫麗單抗在轉(zhuǎn)化酶裂解位點的一定距離處與C5相互作用，而小體 Mubodina?與C5的裂解位點相互作用。來自于軟蜱非洲鈍緣蜱(Ornithodoros moubata) 的C5抑制蛋白非洲鈍緣蜱補體抑制物（0mCI，Nunn，M.A·等了11111111111〇1 2005，174:2084-2 0 9 1 )已被猜測結(jié)合至在轉(zhuǎn)化酶裂解位點附近的C U B - C 5 d - M G 8超級結(jié)構(gòu)域的遠端 (FredsIund等Nat Immunol 2008，9(7): 753-760)。與上述提到的抑制C5裂解的三種蛋白不 同，單克隆抗體TNX-558結(jié)合至在完整的C5和釋放的C5a均存在的C5a表位而不抑制C5的裂 解（Fung等Clin Exp Tmmunol 2003，133(2):160-169)〇
[0008] 包含C5結(jié)合基序的C5結(jié)合多肽，公開在國際專利申請?zhí)朠CT/SE2013/050139,作為 WO 2013/126006公布。特別是，WO 2013/126006公開了由氨基酸序列
[0009] EX2X3X4A X6X7EID XiiLPNL Xi6XnXisQW X21AFIX25X26LX28D組成的C5結(jié)合基序BM，
[0010] 其中彼此獨立地，
[0011] X2 選自 H、Q、S、T和 V;
[0012] X3選自 I、L、M和V;
[0013] X4選自 A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、I^PY;
[0014] X6選自 N和 W;
[0015] X7選自 A、D、E、H、N、Q、R、S和 T;
[0016] X11選自 A、E、G、H、K、L、Q、R、S、I^PY;
[0017] Xi6 選自 N和 T;
[0018] X17選自 I、L和V;
[0019] Xi8選自 A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T;
[0020] X2i選自 I、L和V;
[0021] X25選自 D、E、G、H、N、S和T;
[0022] X26選自K和S;并且
[0023] X28 選自 A、D、E、H、N、Q、S、I^PY。
[0024] 特定C5結(jié)合基序的例子，如之前在WO 2013/126006中公開的，在本專利申請中如 SEQ ID NO: 1-248所示。
[0025] 從WO 2013/126006可知，額外的肽或多肽可增強C5結(jié)合多肽的穩(wěn)定。這種多肽的 一個例子是如本說明書中的SEQ ID N0:250所示的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)。合適的白蛋白 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其他例子公開在WO 2009/016043和WO 2012/004384^BD延伸的多肽在體內(nèi) 結(jié)合至血清白蛋白，并且得益于其較長的半衰期，增加多肽自身的凈半衰期(見例如WO 91/ 01743)〇
[0026] 持續(xù)提供具有相當?shù)腃5阻斷活性的試劑依然在本領域是實質(zhì)利益問題。特別是， 對防止末端補體級聯(lián)和促炎分子C5a形成的分子存在持續(xù)需要。提供這種分子在疾病治療 中的用途也是很有用。
[0027] 附圖簡述
[0028] 圖1圖解SDS-PAGE凝膠，其中條帶代表C5結(jié)合化合物PSI0242(SEQ ID N0:249)(0) 穩(wěn)定性測試之前;和(2w)兩周穩(wěn)定性測試之后。
[0029]圖2是穩(wěn)定性測試之前（實線）和兩周穩(wěn)定性測試之后(虛線）來自于PSI0242(SEQ ID NO:249)的反相HPLC的色譜圖。
[0030] 圖3圖解SDS-PSGE凝膠，其中第一泳道包含SeeBlue 2P大小標記物并且條帶代表 (〇)起始樣品；和（2w)兩周穩(wěn)定性測試之后的樣品。圖3A:SEQ ID N0:249;圖3B:SEQ ID NO: 261;圖3C:SEQ ID N0:262;圖3D:SEQ ID N0:264。
[0031] 圖4是穩(wěn)定性測試之前(實線)和兩周穩(wěn)定性測試之后(虛線)來自于C5結(jié)合化合物 (SEQ ID N0:253)的反相HPLC的色譜圖。
[0032] 圖5是穩(wěn)定性測試之前（實線）和兩周穩(wěn)定性測試之后（虛線）來自C5結(jié)合化合物 (SEQ ID NO:264)的反相HPLC的色譜圖。
[0033]圖6A-D顯示SDS-PAGE凝膠圖像，比較兩周穩(wěn)定性測試之前（0)和之后（2w)原始的 和修飾的多肽變體。分子大小標記物(Mw)是]Sfovex? Sharp預染蛋白標準（216、160、110、 80、60、50、40、30、20、15、10、3.51^^)。圖6六顯示冊1?2結(jié)合多肽的凝膠，其中泳道顯示泳道1 : Mw，泳道2:(0)Z02891(SEQ ID N0:272)，泳道3:(2w)Z02891(SEQ ID N0:272)，泳道4:Mw，泳 道5:(0)Z17341(SEQ ID N0:273)，泳道6:(2w)Z17341(SEQ ID N0:273)，泳道7:(0)Z17342 (SEQ ID N0:274)，泳道8:(2w)Z17342(SEQ ID N0:274)。圖6B是PDGF-肋結(jié)合多肽的凝膠， 其中泳道顯示：泳道l:Mw，泳道2:(0)Z15805(SEQ ID N0:275)，泳道3:(2w)Z15805(SEQ ID N0:275)，泳道4:Mw，泳道5:(0)Z17343(SEQ ID N0:276)，泳道6:(2w)Z17343(SEQ ID NO: 276)，泳道7:(0)Z17344(SEQ ID N0:277)，泳道8:(2w)Z17344(SEQ ID N0:277)。圖6C顯示 FcRn結(jié)合多肽的凝膠，其中泳道顯示：泳道I: (0)Z10103(SEQ ID N0:278)，泳道2: (2w) Z10103(SEQ ID N0:278)，泳道3:Mw，泳道4:(0))Z17347(SEQ ID N0:279)，泳道5:(2w) Z17347(SEQ ID N0:279)，泳道6:(0)Z17348(SEQ ID N0:280)，泳道7:(2w)Z17348(SEQ ID N0:280)。圖6C中見到的對角線的條帶是由于在同一個容器內(nèi)來自于第二次凝膠染色的印 記造成的偽跡。圖6D是CAK結(jié)合多肽的凝膠，其中泳道顯示泳道I: Mw，泳道2 : (O) Z09782 (SEQ ID N0:281)，泳道3:(2w)Z09782(SEQ ID N0:281)，泳道4:Mw，泳道5:(0)Z17351(SEQ ID N0:282)，泳道6:(2w)Z17351(SEQ ID N0:282)，泳道7:(0)Z17352(SEQ ID N0:283)，泳 道8:(2w)Z17352(SEQ ID N0:283)，泳道9:(0)Z17355(SEQ ID N0:284)，泳道 10:(2w) Z17355(SEQ ID N0:284)，泳道 11:(0)Z17357(SEQ ID N0:285)，泳道 12:(2w)Z17357(SEQ ID N0:285)，泳道 13:(0)Z17359(SEQ ID N0:286)，泳道 14:(2w)Z17