基于給予免疫原性的應(yīng)激蛋白的治療性癌癥疫苗的制作方法
【專利說(shuō)明】基于給予免疫原性的應(yīng)激蛋白的治療性癌癥疫苗
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基于應(yīng)激蛋白、包括如HSP(熱休克蛋白）和/或GRP(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白） 運(yùn)樣的類型的伴侶蛋白或抗性機(jī)制化RP、CTL4、PD-L1等）中設(shè)及的其他蛋白的癌癥治療的 新型治療方法。本發(fā)明尤其設(shè)及用于制備藥物組合物或治療性疫苗的方法、所述藥物組合 物或治療性疫苗本身W及用于癌癥的治療性治療的治療方法。
[0002] 免疫系統(tǒng)基于兩種防御機(jī)制，即：先天性免疫，其迅速但無(wú)特異性；W及獲得性免 疫，其較慢但有特異性并且具有記憶。運(yùn)兩種互補(bǔ)機(jī)制通過(guò)在細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答期間直 接地亦或在體液免疫應(yīng)答期間通過(guò)活性分子(如免疫球蛋白、細(xì)胞因子等類型）的分泌動(dòng)員 細(xì)胞W提供抵抗內(nèi)部"侵襲"的能力。
[0003] 癌癥的發(fā)生和發(fā)展大量地設(shè)及免疫。根據(jù)=階段理論(3E)，致癌作用響應(yīng)于消除 機(jī)制，基于雙重免疫功能、旨在破壞腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性免疫監(jiān)視過(guò)程W及抗癌細(xì)胞的"選 擇"。=階段理論包括被稱為消除階段的第一階段，在該階段期間免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤增殖， 引起與腫瘤相關(guān)的組織參與和環(huán)境變化(非特異性細(xì)胞（巨隧細(xì)胞、NK、sDC)的動(dòng)員），抗增 殖、調(diào)亡、血管生成抑制的分子的分泌，細(xì)胞因子的產(chǎn)生，CD4和CD8的動(dòng)員和激活。在被稱為 響應(yīng)于免疫系統(tǒng)的平衡階段的第二階段期間，"敏感的"腫瘤細(xì)胞被消除并且導(dǎo)致最具抗性 的細(xì)胞的免疫選擇。調(diào)動(dòng)起來(lái)的抗性機(jī)制為抵抗細(xì)胞調(diào)亡，抑制細(xì)胞因子(TGF-0、化-10、 PGE2、ID0)的分泌，改變抗原呈遞(主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類的表達(dá)的部分或全部喪 失），中和分子的分泌，W及MICA和MICB表達(dá)，通過(guò)表達(dá)化S-L，導(dǎo)致T淋己細(xì)胞死亡的PD-Ll， "反攻"細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)。在此階段期間，破環(huán)的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量與抗性細(xì)胞的數(shù)量均 衡。此均衡階段與在治療期間觀察到的緩解階段對(duì)應(yīng)，運(yùn)也是通過(guò)毒性最強(qiáng)的克隆抵抗免 疫防御系統(tǒng)或治療的能力來(lái)選擇毒性最強(qiáng)的克隆的選擇階段。在被稱為逃逸階段的第=階 段期間，已經(jīng)發(fā)展一種或多種逃逸手段的抵抗免疫系統(tǒng)的各種保護(hù)機(jī)制的細(xì)胞在無(wú)任何控 制下增殖。然后癌細(xì)胞發(fā)展為腫瘤塊，運(yùn)是生理逃逸現(xiàn)象的臨床表現(xiàn)。在抵抗治療的現(xiàn)象期 間，在癌癥的晚期和轉(zhuǎn)移期也觀察到相關(guān)的逃逸現(xiàn)象。
[0004] 抗癌治療包括外科手術(shù)，其中，目標(biāo)主要是移除或減小腫瘤，但是運(yùn)種"機(jī)械性"行 為對(duì)致癌作用沒(méi)有任何實(shí)際抑制效果并且通常通過(guò)旨在"消除"癌癥起源的各種不同的治 療療法來(lái)補(bǔ)充。在腫瘤細(xì)胞的情況下，放射療法的目的是導(dǎo)致快速增殖細(xì)胞的DNA改變。放 射療法的副作用是雙重的：甚至?xí)丈浣】导?xì)胞，從而引起健康細(xì)胞的破壞或能夠?qū)е缕?癌變的遺傳變異，并且腫瘤細(xì)胞憑借產(chǎn)生伴侶蛋白或分子伴侶化SP、GRP等)發(fā)展抗福射誘 導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡的抗性，從而引起逃逸現(xiàn)象?；瘜W(xué)療法旨在通過(guò)作用于細(xì)胞本身或通過(guò)抑制 具體的代謝途徑來(lái)消除腫瘤細(xì)胞：與DNA的直接相互作用（親電子劑、嵌入劑、分裂劑）、與 DNA的間接相互作用(DNA合成的抑制劑，例如，抗代謝物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑;紡鍵體形成抑 制劑）、新血管形成抑制劑、蛋白酶體抑制劑。腫瘤細(xì)胞在運(yùn)里再次發(fā)展抵抗機(jī)制，并且盡管 實(shí)施的多化療策略，但伴隨著大量腫瘤增殖、適應(yīng)性的證據(jù)W及可W認(rèn)為類似于自然逃逸 現(xiàn)象的細(xì)胞選擇，如免疫系統(tǒng)設(shè)及的3E理論所述，觀察到復(fù)發(fā)現(xiàn)象。
[0005] 免疫療法包括:被動(dòng)免疫療法，其由提供大量效應(yīng)物組成；W及主動(dòng)免疫療法，其 目的是引起特異性免疫應(yīng)答。被動(dòng)免疫療法基于注射抗體W便阻斷受體，引起細(xì)胞溶解，刺 激細(xì)胞毒性，提局細(xì)胞調(diào)亡的抑制（西義昔單抗-ErM扣X⑥、貝伐單抗-Ava.stin@:、利義昔單 抗-Mabthera駁等）。使用細(xì)胞因子是刺激抗腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答的另一種策略（IL2、 Inf 丫等）。主動(dòng)免疫療法或接種疫苗的免疫作用的目的是根據(jù)W下不同的策略使患者對(duì)癌 癥免疫:通過(guò)激活樹(shù)突狀細(xì)胞、TLR激動(dòng)劑、腫瘤細(xì)胞裂解物、修飾或非修飾的非增殖腫瘤細(xì) 胞來(lái)激活免疫系統(tǒng)。運(yùn)些方法構(gòu)成新的先進(jìn)療法醫(yī)藥產(chǎn)品(ATMP)。它們很有希望并且得到 很好的結(jié)果，如果它們與其他治療結(jié)合效果會(huì)更好。已經(jīng)被食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的 第一種主動(dòng)免疫療法治療是通過(guò)在存在特異性腫瘤抗原的情況下培養(yǎng)，基于患者的T淋己 細(xì)胞(TL)的激活的前列腺癌疫苗（Sipuleucel-T) Provenge飯。然而，運(yùn)些治療也一樣，觀 察到與設(shè)及免疫系統(tǒng)的3E理論中所述的自然逃離現(xiàn)象類似的逃逸現(xiàn)象。
[0006] 因此仍然需要提供用于治療癌癥的新型治療策略，其能夠提供特異性的固有有效 性和/或有助于多種治療策略。
[0007] 各種不同的抗腫瘤機(jī)制，盡管有多種，但均得到直接或間接攻擊腫瘤細(xì)胞的基本 策略的支持，而最后的步驟是細(xì)胞溶解或細(xì)胞死亡。因此，抗細(xì)胞調(diào)亡因子似乎是關(guān)鍵現(xiàn) 象，因?yàn)樗ㄟ^(guò)保護(hù)腫瘤細(xì)胞W抵抗破壞的中間機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)直接逃逸(抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào) 亡)或間接逃逸。
[000引許多研究已經(jīng)提供了更好地理解抗性現(xiàn)象，并且尤其是"伴侶蛋白"或應(yīng)激蛋白在 抗細(xì)胞調(diào)亡中的作用的手段。尤其是，已知的效果是熱休克蛋白化SP110、HSP 90、HSP 70、 HSP 60、HSP 20和泛素及主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（也歸在應(yīng)激蛋白家族下）中的GRP(葡萄糖調(diào) 節(jié)蛋白）GRP 94、GRP 78(BiP)和GRP 58的保護(hù)效果。重點(diǎn)也已經(jīng)放在更具體地設(shè)及在其中 包括多藥耐藥蛋白（MRP)，如GP 170、VMP1和LRP的各種治療(多種藥物抗性)的抗性因子上。
[0009] 對(duì)應(yīng)激尤其是熱休克的抗性機(jī)制似乎是通用的并且存在于所有活的生物體(細(xì) 菌、植物、動(dòng)物）中。HSP的功能的特征為某些蛋白和酶通過(guò)形成分子復(fù)合物的保護(hù)或修復(fù)活 動(dòng)，運(yùn)些分子復(fù)合物抑制"不適當(dāng)?shù)逆I"由于"代謝攻擊"（低氧、低碳水化合物濃度等）、侵略 性物理攻擊(熱、福射）、或化學(xué)/藥物攻擊而引起的變性和形成。
[0010] 目前，存在使用HSP作為治療祀標(biāo)的新的策略。尤其是，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些分子W便 嘗試抑制HSP 90,但是結(jié)果喜憂參半并且具有高的毒性水平。更先進(jìn)的治療方法之一是使 用小分子17-AAG(坦螺旋霉素或17-締丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素;Len化ckers，熱 休克蛋白90:癌癥分子伴侶巧eat shock protein 90:the cancer chape;rone)J Biosci 32(3)2007年4月，517-530,Indian Academiy of Sciences),其抑制HSP 90的分子伴侶功 能并且其臨床活性很有希望，但是有許多副作用。類似地，小分子Ganetespid(STA-9090)， HSP 90的ATP位點(diǎn)的抑制劑，目前在黑素瘤中進(jìn)行測(cè)試，就像對(duì)功能或HSP 90位點(diǎn)起作用一 樣的其他分子(新生霉素、She地erdine、同種型抑制劑等等）。研究考慮的另一個(gè)祀標(biāo)是通 過(guò)作用于服P 70來(lái)提升對(duì)細(xì)胞調(diào)亡的抑制。在考慮中的產(chǎn)品是A孤70(氨基酸分子）、PES(2-苯基亞乙基橫酷胺KVER-155 008(腺巧衍生物)MKT077(小分子）。最后，抵抗服P 27和叢生 蛋白的"反義0GX-427"的使用已經(jīng)成為若干臨床研究的主題。
[0011] 此外，已經(jīng)參考自體使用HSP 70或其衍生物的參考文獻(xiàn)作為抵抗小鼠的腫瘤細(xì)胞 白勺免疫因子。A IV^noret and J H曰n邑m曰n(Prot有ines de choc thermique et 曰nti邑enes tumoraux(熱休克蛋白和腫瘤抗原），Medecine/Sciences 1994; 10:665-71)描述了針對(duì)與 腫瘤多膚相關(guān)的條件顯示免疫原性的純化的HSP 70制劑的小鼠免疫。Wirth D等人(安娜醫(yī) 學(xué)獸醫(yī)學(xué)(Ann.Med Vet).2002,146,201-216)提及了W下研究，運(yùn)些研究已經(jīng)表明用HSP制 劑接種小鼠或轉(zhuǎn)移由腫瘤得到的HSP 70基因，使小鼠對(duì)施用自體的腫瘤細(xì)胞免疫并且誘導(dǎo) 已經(jīng)發(fā)展的腫瘤細(xì)胞的消退。
[0012] 然而，目前看起來(lái)運(yùn)些方法具有集中于一種應(yīng)激蛋白或另一種應(yīng)激蛋白的特異性 祀點(diǎn)，而不提供集中于抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展的"整套"保護(hù)機(jī)制的組合策略。因此，已經(jīng)提到通 過(guò)刺激如服P 27和服P 70的其他HSP(熱休克應(yīng)答)的分泌從而增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞調(diào)亡的抗性并且 通過(guò)誘導(dǎo)化學(xué)保護(hù)（如上所述的A M自noret and J化ngman 1994)，抑制服P 90也會(huì)引起產(chǎn) 生防御信號(hào)。
[0013] 本發(fā)明的目的是提供全面的整體方法，也就是說(shuō)，該方法提供了同時(shí)作用于多種 抗性機(jī)制，優(yōu)選為腫瘤細(xì)胞發(fā)展的整套運(yùn)些機(jī)制的能力。
[0014] 本發(fā)明的目的還提供運(yùn)種方法尤其是在對(duì)患者施用治療方案的過(guò)程中適用于腫 瘤細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷的一種或多種應(yīng)激的可能性。
[0015] 本發(fā)明的目的還提出一種方法，該方法提供與使用細(xì)胞系相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)化。
[0016] 因此，本發(fā)明的目的還設(shè)及確保該方法將腫瘤細(xì)胞的類型和/或階段，尤其是正在 接受治療的患者的腫瘤細(xì)胞的類型和/或階段考慮在內(nèi)。
[0017] 因此，本發(fā)明的目的還提出就其本身而言可W構(gòu)成治療方案或作為另一種治療方 案的輔助方案的運(yùn)樣的方法。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)目的還提出具有患者特異性的運(yùn)樣的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明的目的是通過(guò)已經(jīng)被給予免疫原性的應(yīng)激蛋白刺激免疫系統(tǒng)，尤其是通過(guò) 半抗原化，W便引起表達(dá)所述抗性因子(應(yīng)激蛋白）的細(xì)胞的消除。該免疫學(xué)治療旨在消除 或控制可W表達(dá)運(yùn)些抗性因子的細(xì)胞。提出的治療性方法旨在尤其是基于W下幾點(diǎn)用于抵 抗癌癥：
[0020] -腫瘤細(xì)胞在它們被自然(免疫系統(tǒng)）"應(yīng)激"或通過(guò)治療性方案(放射療法、化學(xué)療 法、免疫療法等）"應(yīng)激"時(shí)發(fā)展用于抵抗或逃逸的機(jī)制；
[0021] -抵抗機(jī)制引起多種類型的應(yīng)激蛋白如HSP、GRP和其他蛋白/糖蛋白的參與；
[0022] -應(yīng)激蛋白本身在體內(nèi)不會(huì)自然產(chǎn)生免疫原性，盡管它們?cè)谀承l件下可W通過(guò) 接種疫苗產(chǎn)生"免疫保護(hù)"；
[0023] -特異性抗-服P(或抗-抗性因子)方法似乎也會(huì)發(fā)生逃逸現(xiàn)象；
[0024] -蛋白環(huán)境(輔因子、底物等)似乎是被考慮到的要素 W便通過(guò)接種疫苗產(chǎn)生抗腫 瘤保護(hù)效果。
[0025] 本發(fā)明因此具體地設(shè)及一種用于制備包含應(yīng)激蛋白的組合物的方法，所述應(yīng)激蛋 白通過(guò)在腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上在體外施加應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)。更具體地講，所述方法產(chǎn)生免疫原 性形式的運(yùn)樣的應(yīng)激蛋白，也就是說(shuō)，能夠被患者的免疫系統(tǒng)識(shí)別并且能夠?qū)е禄颊叩拿?疫系統(tǒng)形成針對(duì)運(yùn)些蛋白和存在運(yùn)些蛋白的腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。該方法有利地包括使腫 瘤細(xì)胞滅活W便使腫瘤細(xì)胞不增殖的步驟。本發(fā)明還設(shè)及包含運(yùn)樣的蛋白的組合物，特別 是藥物組合物或治療性疫苗。本發(fā)明還設(shè)及通過(guò)有原則的治療策略或者與另一種治療方案 (特別是佐劑)組合的方式施用運(yùn)樣的組合物的抗癌治療方法。
[00%]本發(fā)明設(shè)及一種方法并且該方法提供了制備藥物組合物的能力，該藥物組合物包 括在施加到腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激的條件下由腫瘤細(xì)胞表達(dá)應(yīng)激蛋白中的多種或所有或大部分。 運(yùn)構(gòu)成獲得的結(jié)果產(chǎn)物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，該結(jié)果產(chǎn)物通過(guò)代表多種應(yīng)激蛋白，使得藥物組合物 包含給予免疫原性的各種各樣的應(yīng)激蛋白，運(yùn)些應(yīng)激蛋白構(gòu)成患者的免疫系統(tǒng)將能夠與其 反應(yīng)的另外的免疫原性元件，然后祀向整組腫瘤細(xì)胞，并且抵消在免疫系統(tǒng)和/或施加的處 理的壓力下由運(yùn)些腫瘤細(xì)胞不同地發(fā)展的抗性機(jī)制。
[0027] -般來(lái)講，將在根據(jù)本發(fā)明的組合物中發(fā)現(xiàn)一種或多種W下形式的運(yùn)些應(yīng)激蛋 白：在游離狀態(tài)下，在與腫瘤細(xì)胞的膜相關(guān)的狀態(tài)下（包含內(nèi)膜），存在于腫瘤細(xì)胞的表面 上，存在于腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部，與腫瘤細(xì)胞的碎片或與腫瘤膚相關(guān)。
[0028] 因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物將優(yōu)選地包括迄今為止并且在給定時(shí)間點(diǎn)記載的一種 或多種識(shí)別的應(yīng)激蛋白。W下部分提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的應(yīng)激蛋白