一種溶桿菌素的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分離提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種溶桿菌素的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽(AMPs)是一類帶正電的兩親性（同時(shí)具有疏水性部位和親水性部位)小分 子肽類物質(zhì)，抗菌肽之間的主要差異在于氨基酸組成和肽鏈的長(zhǎng)度(6~100個(gè)氨基酸）?？?菌肽是大多數(shù)生物包括人類在內(nèi)的先天免疫系統(tǒng)不可缺少的一部分。從生物合成角度分 析，抗菌肽主要分為兩類:非核糖體途徑合成的抗菌肽和核糖體途徑合成的抗菌肽。從生化 性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的角度分析，抗菌肽通常分為陽離子抗菌肽、陰離子抗菌肽、芳香族抗菌肽 以及來源于氧結(jié)合蛋白的肽類。
[0003] 抗菌肽通常含12~50個(gè)氨基酸殘基。雖然不同來源的抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)差異性很 大，但也有共性：（1 )N端富含極性氨基酸，特別是堿性氨基酸如賴氨酸和精氨酸，這一特征 使抗菌肽具有表面活性劑活性;絕大多數(shù)抗菌肽的第二位氨基酸殘基是色氨酸，它對(duì)抗菌 肽殺菌活性的高低起著至關(guān)重要的作用；（2)C末端通常酰胺化。抗菌肽結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的研究 是對(duì)抗菌肽進(jìn)行高效、快捷分離純化的基礎(chǔ)，也是對(duì)其進(jìn)行作用機(jī)理和結(jié)構(gòu)改造的前提，目 前已有大量基于抗菌肽結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測(cè)對(duì)抗菌肽進(jìn)行從頭設(shè)計(jì)并得到新型、高效、特異抗 菌肽的研究報(bào)道。
[0004] 枯草芽孢桿菌(Baci 1 lus subti 1 is)能分泌多種具有潛在生物醫(yī)藥工程利用價(jià)值 的低分子量的抗菌肽和細(xì)菌素類的抗菌活性物質(zhì)，其中包括溶桿菌素(Bacilysin)。溶桿菌 素是一種結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的二肽之一，對(duì)許多的細(xì)菌和真菌具有抑制作用。其分子結(jié)構(gòu)中含有 一個(gè)N末端的L-丙氨酸和C末端的一個(gè)非常見氨基酸L-anticapsin。溶桿菌素被敏感菌株通 過細(xì)胞壁肽轉(zhuǎn)運(yùn)酶(peptide permease)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，然后被胞內(nèi)肽酶(peptidase)水解成 L_alanine和L_anticapsin，L_anticapsin通過抑制己糖胺通路（hexosamine biosynthesis pathway)中的第一步關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖胺合成酶，從而影響細(xì)菌肽聚糖 (peptidoglycan)和真菌甘露糖蛋白（mannoprotein)合成，導(dǎo)致細(xì)胞原生質(zhì)體或細(xì)胞壁裂 解來殺死細(xì)胞。其殺菌機(jī)理獨(dú)特且具有廣譜抗菌活性，因此在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上具有潛在應(yīng)用 價(jià)值。
[0005] 目前常見的抗菌肽大多來源于細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物。常規(guī)的抗菌肽分離與純化工藝大 都存在著以下的不足：（1)由于發(fā)酵培養(yǎng)基的成分比較復(fù)雜，發(fā)酵過程中，經(jīng)過物理、化學(xué)的 相互作用培養(yǎng)基各種成分可能會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的反應(yīng)，造成發(fā)酵終產(chǎn)物成分的變化。（2)通過 微生物的自身代謝產(chǎn)抗菌肽時(shí)，除了目標(biāo)產(chǎn)物以外，還會(huì)有其他的代謝產(chǎn)物這又會(huì)增加提 取過程的難度。（3)多肽類分子量小、易酶解、提取工藝復(fù)雜，且各種肽類物質(zhì)的純化策略因 自身理化性質(zhì)的差異而千變?nèi)f化，這些令分離純化存在成本高、得率低、工序繁瑣、?；铍y 等問題。
[0006] 因此，有必要提供一種高效的產(chǎn)業(yè)化分離提取抗菌肽的方法，解決傳統(tǒng)提取工藝 使用過程中所帶來的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種高效的適合產(chǎn)業(yè)化分離純化溶桿 菌素的方法。
[0008] 一種溶桿菌素的純化方法，包括以下步驟：
[0009] (1)提供生產(chǎn)溶桿菌素的發(fā)酵液；
[0010] (2)除去發(fā)酵液中的菌體；
[0011] (3)以XAD1600樹脂為填料，進(jìn)行第一次吸附層析，以水為流動(dòng)相，收集合并流穿液 和洗脫液I;
[0012] (4)以SP207樹脂為填料，進(jìn)行第二次吸附層析，以體積濃度大于5%的乙醇溶液為 流動(dòng)相，獲得洗脫液II;
[0013] (5)將洗脫液II濃縮、凍干。
[0014] 本發(fā)明最關(guān)鍵的部分是兩步吸附層析中填料的選擇，第一次吸附層析使用的填料 為XAD1600，是一種非極性大孔吸附樹脂，起初步純化的作用。當(dāng)然經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)選擇其他 種類的非極性大孔吸附樹脂也是可以的，但相對(duì)來說效果沒有XAD1600那么好。第二次吸附 層析使用的填料為SP207樹脂，是一種有部分離子交換功能的大孔吸附樹脂，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 選擇其他種類的大孔吸附樹脂都不能達(dá)到要求，所以SP207樹脂是必須的。
[0015]優(yōu)選的，所述第一次吸附層析和第二次吸附層析前進(jìn)行濃縮。濃縮使用納濾膜過 濾器，納濾膜過濾器可以將處理液中的水分、無機(jī)鹽等雜質(zhì)透出，而有效成分由于分子量相 對(duì)較大而被截留。濃縮后的體積根據(jù)層析上樣體積需要確定。
[0016] 所述發(fā)酵液由枯草芽孢桿菌發(fā)酵獲得。溶桿菌素為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)分泌的抗菌肽，所以本發(fā)明方法的發(fā)酵液獲得并不局限于本發(fā)明所使用的枯草 芽孢桿菌特定菌株。
[0017] 所述除去發(fā)酵液中的菌體的方法為用陶瓷膜過濾器進(jìn)行過濾。陶瓷膜過濾器具有 熱穩(wěn)定性好，耐化學(xué)腐蝕性能優(yōu)越，機(jī)械強(qiáng)度高并且過濾效果好等優(yōu)點(diǎn)。
[0018] 步驟(3)中第一次吸附層析使用XAD1600樹脂為填料，溶桿菌素純化的模式為流穿 模式，即溶桿菌素不與填料結(jié)合，而雜質(zhì)與填料結(jié)合，所以使用水為流動(dòng)相，而溶桿菌素在 流穿液和以水為流動(dòng)相時(shí)獲得的洗脫液中。
[0019] 優(yōu)選的，步驟(3)中，第一次吸附層析洗脫流速為10~25mL/min，洗脫2.5~5BV。最 優(yōu)選的，步驟(3)中，洗脫流速為20mL/min，洗脫3BV。當(dāng)洗脫流速過快或過慢時(shí)，洗脫效果都 會(huì)變差，而洗脫體積太小則不能將溶桿菌素全部洗脫下來，洗脫體積太大則增加后續(xù)處理 的工作量。其中BV為所用填料的體積。
[0020] 步驟(4)中第二次吸附層析使用SP207樹脂為填料，溶桿菌素純化的模式為結(jié)合-洗脫模式，即溶桿菌素與填料結(jié)合，為提高純度，一般在洗脫前需要采用水清洗，與填料不 結(jié)合或結(jié)合很弱的雜質(zhì)在流穿液和以水為流動(dòng)相清洗時(shí)去除，然后用洗脫溶液洗脫獲得溶 桿菌素，而與填料結(jié)合很強(qiáng)的雜質(zhì)也不能被洗脫下來。
[0021] 優(yōu)選的，步驟(4)中，第二次吸附層析洗脫流速為0.3~lBV/h。最優(yōu)選的，步驟(4) 中，洗脫流速為〇.5BV/h。
[0022] 優(yōu)選的，步驟(4)中，第二次吸附層析上樣方法采用靜態(tài)吸附。優(yōu)選的，所述靜態(tài)吸 附的時(shí)間為100~140min。最優(yōu)選的，所述靜態(tài)吸附的時(shí)間為120min。
[0023]優(yōu)選的，步驟(4)中，第二次吸附層析上樣方法采用動(dòng)態(tài)上樣，上樣體積< 2.5BV。 [0024] 優(yōu)選的，步驟(4)中，洗脫液采用體積濃度10%的乙醇溶液。當(dāng)乙醇濃度過低時(shí)，洗 脫強(qiáng)度較弱，洗脫液體積會(huì)增加;過高時(shí)，容易將雜質(zhì)也洗脫下來。
[0025]本發(fā)明在經(jīng)過小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)摸索好條件后，使用500L發(fā)酵罐這樣的中試級(jí)發(fā)酵實(shí) 驗(yàn)，相應(yīng)的，后續(xù)純化步驟也都是在小試摸索條件后，經(jīng)中試級(jí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的。所以本發(fā)明純 化方法適用于溶桿菌素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0026]本發(fā)明純化方法能夠高效低成本地從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中純化提取溶桿菌素， 最終得率能夠達(dá)到89%，并且所得溶桿菌素純度達(dá)到99%，適用于產(chǎn)業(yè)化分離提取溶桿菌 素。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明純化方法工藝路線圖；
[0028] 圖2為枯草芽孢桿菌小試實(shí)驗(yàn)中一級(jí)種子發(fā)酵過程中還原性糖、細(xì)胞干重、總糖和 抗生素效價(jià)的變化曲線圖；
[0029] 圖3為枯草芽孢桿菌中試生產(chǎn)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中溶氧、pH和抗生素效價(jià)的變化曲線圖；
[0030] 圖4為納濾膜過濾過程濾過液與截留液的液相分析圖；
[0031 ]其中1:納濾膜過濾過程濾過液的液相分析圖，2:納濾膜過濾過程截留液的液相分 析圖，
[0032]圖5為SP207樹脂靜態(tài)吸附曲線圖；
[0033]圖6為不同濃度洗脫劑靜態(tài)解吸SP207樹脂曲線圖；
[0034] 圖7為bacilysin在SP207樹脂上的穿透曲線圖；
[0035]圖8為SP207樹脂的動(dòng)態(tài)穿透曲線圖；
[0036] 圖9為HPLC-CAD檢測(cè)bacilysin成品純度圖；
[0037]圖10為bacilysin成品的質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]本發(fā)明實(shí)施例中涉及到的菌株有：
[0039] (1)枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)ZJU007,保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中科院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No.4140,保藏時(shí)間2010年9月03日；該菌株已在申請(qǐng)?zhí)枮?201010521030.9，名為"一種枯草芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用"的前期申請(qǐng)專利中公開。
[0040] (2)白色念珠菌，保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中科院微生物研究 所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為ATCC10231-3147。 [0041 ] 培養(yǎng)基：
[0042] (1)斜面培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基。
[0043] (2)種子培養(yǎng)基(每L配方）：15g葡萄糖，10g酵母粉，lg K2HP〇4,0.5g MgS〇4,0.01g FeS〇4，10g NaCl，加 H20至約800mL，調(diào)pH至7.0后加 0.4g CaC03,定容到 1L。
[0044] (3)發(fā)酵培養(yǎng)基（每L配方）：2 ? 72g酵母粉，26 ? 67g可溶性淀粉，3 ? 95g(NH4)2S〇4， 2.4g K2HP〇4，10g NaCl，0.5g MgS〇4,0.72g CaC03,0.02g CuS〇4,0.02g FeS〇4,0.02g MnSCk，加ddH20至約800mL，調(diào)pH至6.5后定容到1匕
[0045] (4)白色念珠菌培養(yǎng)基(每L配方）：20g葡萄糖，lOg蛋白胨，20g瓊脂，加H20溶解，定 容到1L。
[0046]實(shí)施例1枯草芽孢桿菌小量發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0047]取1環(huán)經(jīng)活化的菌種，接入到種子瓶中，500mL錐形瓶中裝100mL培養(yǎng)基，初始pH值 7.0，30 °C下200RPM培養(yǎng)24h。再將種子液以10 % (v/v)的接種量接入到5L發(fā)酵罐(裝液量為 60 % )中，發(fā)酵罐通氣量400L/h，轉(zhuǎn)速200RPM，28 °C發(fā)酵50h，每隔4h取樣一次用于檢測(cè)。 [0048]從圖2可以看到，在0~28h階段pH值一直下降，這主要是因?yàn)榫w處于生長(zhǎng)期，菌 體利用發(fā)酵液中的營(yíng)