專利名稱：用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染來源的方法， 具體地說，涉及一種包括大腸桿菌分離純化步驟、已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟和海洋水體糞便污染溯源分析步驟的利用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染來源的方法。
背景技術(shù)：
微生物源示蹤法(Microbial source tracking，MST) 20世紀80年代首先在歐美等國家興起并逐步發(fā)展。MST是利用微生物在環(huán)境中的生化特性、遺傳多樣性及其特異性代謝產(chǎn)物確定細菌宿主來源的一種技術(shù)，它尤其對非點源糞便污染的監(jiān)測與管理起到了不可比擬的作用。MST的基本原理是生活在不同宿主環(huán)境中的同一種微生物為了適應(yīng)所處的特異性生態(tài)環(huán)境，產(chǎn)生了一系列環(huán)境適應(yīng)性，并將這些特性以傳給子孫后代，進而形成一個區(qū)別于其他環(huán)境的同種微生物群，這些微生物會形成適應(yīng)生存環(huán)境特異性指紋圖譜，通過分析這些特異性指紋圖譜就能夠達到識別微生物污染源的目的。MST的基本路線為首先建立已知物種源指示生物特異性指紋圖譜庫，用樣本的指紋圖譜與標準庫里的特異性圖譜進行比較，用同源相似率詳識別污染水體的糞便來源。MST的常用示蹤因子——大腸桿菌。大腸桿菌(E.coli)即大腸埃希氏菌，為埃希氏菌屬Escherichia)代表菌。大腸桿菌為人等溫血動物腸道中的常居菌，其常在嬰兒或初生動物出生后幾個小時即可從口腔進入消化道，并在消化道的后端大量繁殖并終生存在。大腸桿菌由于經(jīng)常隨糞便排出體外，能廣泛傳播于外界環(huán)境，所以大腸桿菌是國際上水質(zhì)監(jiān)測的重要指標之一。大腸桿菌分子結(jié)構(gòu)較為簡單，其DNA是一條完整的DNA鏈，作為分子生物學的模式菌，人類對其研究得較為透徹。因此，綜合以上因素，大腸桿菌通常被人們選為MST的首選示蹤因子。MST指紋圖譜技術(shù)一REP-PCR擴增法?；蛑讣y圖譜是用PCR擴增環(huán)境微生物樣品總DNA的標記序列，然后用合適的電泳技術(shù)將其分離而成的具有特定條帶特征的圖譜?；蛑讣y模式的不同就反映細菌種屬的不同。細菌基因組重復(fù)序列PCR擴增法(PCR of repetitive sequences, rep-PCR)是 Versalovic 于 1996 年描述的一種細菌基因組指紋分析法，它利用DNA引物互補擴增出自然存在的、高度保守的、重復(fù)片段DNA序列(這些序列為多拷貝序列，在革蘭氏陰性菌中大多存在，而在革蘭氏陽性菌中很少存在)，通過電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異。35_40bp的重復(fù)性基因外回文序列(Mpetitive extragenic palindromic,REP)是重復(fù)序列的一種主要類型。REP-PCR這一技術(shù)可信度高、 重現(xiàn)性好、快速、分辨能力高，一直是MST研究中比較推崇的基因型指紋圖譜技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用大腸桿菌Mp-PCR基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染來源的方法，該方法包括
大腸桿菌分離純化步驟，在該步驟中，選擇合適梯度體積的糞便樣本，采用濾膜法，以帶柵格纖維濾膜和m-TEC瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)進行菌種分離培養(yǎng)后，挑取符合大腸桿菌形態(tài)特征的菌落，以LB瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)進行2 3次純化，對經(jīng)生化鑒定后確定為大腸桿菌的菌株進行保存；已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟，在該步驟中，采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法提取大腸桿菌基因組DNA，用特定引物進行聚合酶鏈反應(yīng)，采用緩沖液、染色液以及瓊脂糖凝膠進行聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物電泳，采用暗箱透射紫外照射進行瓊脂糖凝膠成像， 從而獲得各菌株的基因指紋圖譜，構(gòu)建已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫；海洋水體糞便污染溯源分析步驟，在該步驟中，采用數(shù)據(jù)分析軟件，將從海洋水體樣本中分離得到的未知源大腸桿菌基因指紋圖譜與已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫進行比對，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。本發(fā)明的大腸桿菌分離純化步驟包括1.選擇合適梯度體積的糞便樣本，采用濾膜法，以m-TEC瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)進行菌種分離培養(yǎng)后，挑取符合大腸桿菌形態(tài)特征的菌落，以LB瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)進行2 3 次純化，對經(jīng)生化鑒定后確定為大腸桿菌的菌株進行保存；2.在大腸桿菌生化鑒定中，對每株菌均需進行氧化酶試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗、 吲哚試驗、EC肉湯發(fā)酵試驗共4種實驗，對4種實驗要求均完全滿足的為大腸桿菌。本發(fā)明的大腸桿菌分離純化步驟可以大批量處理糞便樣本，實現(xiàn)對大腸桿菌的快速分離與純化。本發(fā)明的已知源大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜庫的建立步驟包括1.大腸桿菌基因組DNA提取方法采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法(需要RNA分解酶)和商品試劑盒法；2. PCR擴增反應(yīng)選用的PCR引物序列為REP IR :5，-IIIICGICGICATCIGGC-3，；REP 21 :5，-ICGICTTATCIGGCCTAC-3，(I 為次黃嘌呤)。3. PCR產(chǎn)物電泳采用0. 5 X TBE緩沖液(或是0. 5 X TAE緩沖液)；DNA染色液采用萬分之一的核酸染料，例如Gene Finder，或相當級別的DNA染色液；瓊脂糖凝膠要求長度 12cm，梳子齒寬彡4mm ；上樣量為10 μ L ；穩(wěn)壓電源進行電泳。4.瓊脂糖凝膠成像采用暗箱透射紫外照射，像素百萬級以上。5.圖譜庫分析方法應(yīng)用數(shù)據(jù)分析軟件，采用判別分析法對圖譜庫進行分析，以源驗證和交叉驗證得到的平均正確歸類率評估已知源大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜庫的歸類準確性。本發(fā)明的已知源大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜庫的建立與分析步驟可用于大批量檢測大腸桿菌的rep-PCR基因指紋，能夠滿足對圖譜庫建立與分析的時效性與準確性要求，可以用于圖譜庫的快速建立與準確分析。本發(fā)明的海洋水體糞便污染溯源分析步驟包括在該方法中，將從海洋水體樣品中分離得到的未知源大腸桿菌的rep-PCR基因指紋圖譜與已知源大腸桿菌rep-PCR基因指紋圖譜進行比對，應(yīng)用數(shù)據(jù)分析軟件的判別分析程序進行未知源菌株的歸類識別，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。本發(fā)明的海洋水體糞便污染溯源分析步驟可以用于準確、高效識別海洋水體糞便污染來源，及時有效地為近岸海域糞便污染監(jiān)測與管理提供依據(jù)。本發(fā)明方法的優(yōu)點體現(xiàn)在識別海洋水體糞便污染來源的準確性高；本發(fā)明所需儀器設(shè)備簡單，檢測時間短； 可以進行大批量樣本檢測；分辨性好、重復(fù)性強、穩(wěn)定性高。
具體實施例方式本發(fā)明優(yōu)選采用的大腸桿菌分離純化步驟包括(1)糞便樣本采集以無菌采樣勺采取新鮮糞便樣本放入無菌帶塞試管，4°C保存運輸，并在M小時內(nèi)處理。( 樣本前處理按1 10比例加入無菌生理鹽水，玻璃棒研磨，渦旋振蕩器振蕩 5分鐘混勻，用無菌生理鹽水稀釋至合適梯度；(3)濾膜抽濾以0. 45 μ m帶柵格纖維濾膜進行抽濾，將抽濾好的濾膜貼在m_TEC 瓊脂培養(yǎng)基平板上，35士0. 5°C條件下培養(yǎng)2h，再放到44. 5士0. 5°C的水浴中培養(yǎng)22 24h ；(4)菌株純化以LB瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)，挑取黃色、黃綠色或黃褐色且中央微突的的單菌落劃線分離，進行2 3次的純化。(5)生化鑒定對純化后大腸桿菌進行氧化酶試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗、吲哚試驗、EC肉湯發(fā)酵試驗共4種實驗的生化鑒定。(6)菌株保存將完全符合4種生化鑒定實驗指標的菌株配置成含有30%甘油的菌液，-20°C冷凍保存。本發(fā)明所采用的已知源大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜庫的建立步驟包括(1)大腸桿菌的純化采用營養(yǎng)瓊脂對大腸桿菌菌種進行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 36士 1°C，培養(yǎng)時間為18 Mh，設(shè)立空白營養(yǎng)瓊脂板為陰性對照；用挑菌針挑取單菌落至 LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36士 1°C，培養(yǎng)時間為16 18h，振蕩轉(zhuǎn)速為200rpm/ min，設(shè)立空白LB培養(yǎng)液為陰性對照；取10 μ L培養(yǎng)物進行LB培養(yǎng)基二次振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36士 1°C，培養(yǎng)時間為16h，振蕩轉(zhuǎn)速為200rpm/min，設(shè)立空白LB培養(yǎng)液為陰性對照。(2)大腸桿菌基因組DNA的提取可采用傳統(tǒng)苯酚_氯仿抽提法和商品試劑盒法； 取4mL大腸桿菌LB 二級培養(yǎng)物進行基因組DNA的提取，要求所提取的大腸桿菌基因組DNA 在瓊脂糖電泳中條帶清晰、單一無雜帶、分子量大小達到l(^bp以上，濃度達到200ng/ μ L以上，(0D260-0D320) / (0D280-0D320)為1. 8-2. 0。傳統(tǒng)苯酚-氯仿抽提法步驟如下 取2mL大腸桿菌LB 二級培養(yǎng)物，于離心機中12000rpm/min離心2min，棄上清留菌餅(上清要盡量去除干凈)；再加入2mL大腸桿菌LB 二級培養(yǎng)物，同上操作；加入500 μ L dH20， 振蕩5min，使其充分懸?。幌驊腋∫褐屑尤?0yL蛋白酶K(蛋白酶K的濃度為20mg/mL) 和100 μ L SDS (SDS的濃度為10 % )，補dH20至1000 μ L，上下顛倒混勻后置于65°C水浴中 Ih (或是37°C水浴中過夜)；加入等體積的PCI試劑(PCI為Tris飽和苯酚氯仿異戊醇體積比為25 24 1)，上下顛倒混勻15min，置于離心機中12000rpm/min離心15min，吸取上層液體(切勿帶入中層和下層的液體)，重復(fù)PCI操作；吸取上層液體，加入等體積的CI 試劑(Cl為氯仿異戊醇體積比為M 1)，上下顛倒混勻15min，置于離心機中12000rpm/ min離心15min，吸取上層液體(切勿帶入中層和下層的液體)；加入1/10體積的NaAc (NaAc 濃度為3mol/L，PH值5. 2)和2. 5倍體積的100%冰乙醇，上下顛倒混勻，置于_80°C冰箱中 IOmin (或是_20°C冰箱中30min)；置于4°C離心機中12000rpm/min離心15min，緩慢吸出液體，保留沉淀(動作須輕柔，切勿帶走沉淀，沉淀有時肉眼看不見)；加入70%冰乙醇，上下顛倒混勻，置于4°C離心機中12000rpm/min離心5min，緩慢吸出液體，保留沉淀(動作須輕柔，切勿帶走沉淀，沉淀有時肉眼看不見)；自然風干1 2h (或是置于旋轉(zhuǎn)干燥儀中干燥:3min)；加入IOOyL TE緩沖液，充分混勻；置于4°C冰箱(或_20°C冰箱)保存?zhèn)溆谩?3) PCR擴增反應(yīng)PCR引物序列為REP IR :5，-IIIICGICGICATCIGGC-3，；REP 21 :5，-ICGICTTATCIGGCCTAC-3，(I 為次黃嘌呤)。PCR 反應(yīng)液組成為引物 REP 1R(100 μ M) 1 μ L，引物 REP2I (100 μ Μ) 1 μ L，dNTP 混合物(各 2· 5mM) 8 μ L，LA Taq (5U/ μ L) 0· 5 μ L，10 X LA PCR 緩沖液(Mg2+25mM) 5 μ L,模板(大腸桿菌基因組DNA) 50ng, dH20補足至50 μ L。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性7min ；然后循環(huán)30 循環(huán)，每一循環(huán)為94°C變性30sec，49. 4°C退火lmin，72°C延伸Snin ；最后72°C延伸16min。 設(shè)立標準菌株基因組DNA的陽性PCR對照樣以及模板用dH20補足的陰性對照樣。 (4) PCR產(chǎn)物電泳采用0. 5 X TBE緩沖液(或是0. 5 X TAE緩沖液)；1. 5 %濃度瓊脂糖凝膠(加入萬分之一倍的Gene Finder染色液或同級別以上的DNA染色液)，瓊脂糖凝膠要求長度12cm，梳子齒寬彡4mm ；上樣量為10 μ L ；穩(wěn)壓電壓^OV下電泳15 20分鐘后，再以穩(wěn)壓電壓200V電泳1 1. 5h，至IOObp Marker條帶泳動到凝膠底端為止。(5)瓊脂糖凝膠成像將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進行成像。成像系統(tǒng)要求為暗箱透射紫外照射(或藍光照射)，像素達到百萬級以上。(6)指紋圖譜建庫將實驗獲得的大腸桿菌rep-PCR基因指紋圖譜輸入微生物源示蹤MST分析系統(tǒng)，并用IOObpDNA IadderMarker進行標化處理，建立已知源大腸桿菌 r印-PCR基因指紋圖譜庫。(7)圖譜庫分析應(yīng)用微生物源示蹤MST分析系統(tǒng)對圖譜庫進行判別分析，以源驗證和交叉驗證得到的平均正確歸類率評估已知源大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜庫的歸類準確性。本發(fā)明所采用的海洋水體糞便污染溯源分析步驟包括應(yīng)用微生物源示蹤MST分析系統(tǒng)中的判別分析程序，將從海洋水體樣品中分離得到的未知源大腸桿菌的r印-PCR基因指紋圖譜與已知大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜庫進行比對，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。本發(fā)明方法中所選用試劑和材料優(yōu)選分別為菌株分離基質(zhì)m-TEC瓊脂培養(yǎng)基菌株純化基質(zhì)LB瓊脂培養(yǎng)基增菌液LB肉湯濾膜0. 45 μ m帶柵格纖維濾膜
稀釋液0. 9%生理鹽水PCR 弓I 物序列REP 1R 5 ‘ -1111CGICGICATCIGGC-3 ‘ ； REP 21: 5，-ICGICTTATCIGGCCTAC-3，(I 為次黃嘌呤)PCR反應(yīng)液PCR反應(yīng)液組成為引物REP IR(IOOyM)IyL,弓丨物REP 21 (100 μ M) 1 μ L, dNTP 混合物(各 2. 5mM) 8 μ L, LATaq (5U/ μ L) 0· 5 μ L，10 X LA PCR 緩沖液 (Mg2+25mM) 5 μ L，模板(大腸桿菌基因組DNA) 50ng, dH20補充至50 μ L。緩沖液0. 5 X TBE緩沖液DNA染色液萬分之一的Gene Finder以下通過實施例的方式具體說明本發(fā)明利用大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染來源的方法。菌株分離純化實施例(大腸桿菌的分離純化)大腸桿菌的分離純化采集新鮮糞便樣本，經(jīng)研磨和梯度稀釋后，以0. 45 μ m帶柵格纖維濾膜進行抽濾，將抽濾好的濾膜貼在m-TEC瓊脂培養(yǎng)基平板上，35士0.5°C條件下培養(yǎng)池，再放到44. 5士0. 5°C的水浴中培養(yǎng)22 Mh ；挑取黃色、黃綠色或黃褐色且中央微突的單菌落以LB瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)進行2 3次的純化；對經(jīng)生化鑒定后確定為大腸桿菌的菌株進行保存，最終得到573株來自五種不同物種源的大腸桿菌菌株，包括人源159株，狗源108株，雞源95株，牛源112株，豬源99株。建庫實施例(已知源大腸桿菌I^p-PCR基因指紋圖譜庫建立)已知源大腸桿菌rep-PCR基因指紋圖譜庫的建立采用傳統(tǒng)的苯酚_氯仿抽提法提取大腸桿菌基因組DNA，用PCR引物進行PCR擴增反應(yīng)，采用緩沖液、Gene FinderDNA染色液以及瓊脂糖凝膠進行PCR產(chǎn)物電泳、采用暗箱透射紫外照射進行220萬像素瓊脂糖凝膠成像。將獲得的573株大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜輸入微生物源示蹤MST分析系統(tǒng)， 并用IOObpDNA IadderMarker進行標化處理，建立已知源大腸桿菌r印-PCR基因指紋圖譜庫；選用判別分析程序?qū)D譜庫進行歸類準確性驗證。本圖譜庫物種源模式的源驗證和交叉驗證的平均正確歸類率之差< 5%，說明圖譜庫歸類準確性良好，實踐可用。本發(fā)明圖譜庫的建立需要一周左右時間，每個周期可以進行幾十個至上百個樣品的檢測，因此可以用較短的時間進行大批量樣本的檢測。
權(quán)利要求
1.一種用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法，該方法包括大腸桿菌分離純化步驟，在該步驟中，選擇合適梯度體積的糞便樣本，采用濾膜法，以帶柵格纖維濾膜和m-TEC瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)進行菌種分離培養(yǎng)后，挑取符合大腸桿菌形態(tài)特征的菌落，以LB瓊脂培養(yǎng)基為基質(zhì)進行2 3次純化，對經(jīng)生化鑒定后確定為大腸桿菌的菌株進行保存；已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟，在該步驟中，采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法提取大腸桿菌基因組DNA，用特定引物進行聚合酶鏈反應(yīng)，采用緩沖液、染色液以及瓊脂糖凝膠進行聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物電泳，采用暗箱透射紫外照射進行瓊脂糖凝膠成像，從而獲得各菌株的基因指紋圖譜，構(gòu)建已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫；海洋水體糞便污染溯源分析步驟，在該步驟中，采用數(shù)據(jù)分析軟件，將從海洋水體樣本中分離得到的未知源大腸桿菌基因指紋圖譜與已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫進行比對， 依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此對采樣海域水體中的糞便污染進行溯源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法， 其中在大腸桿菌分離純化步驟的大腸桿菌生化鑒定中，對每株菌均需進行氧化酶試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗、吲哚試驗、EC肉湯發(fā)酵試驗共4種實驗，對4種實驗要求均完全滿足的為大腸桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法， 其中在已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟中，聚合酶鏈反應(yīng)選用的引物序列為REP IR :5’ -IIIICGICGICATCIGGC-3’REP 21 :5，-ICGICTTATCIGGCCTAC-3’其中，I為次黃嘌呤。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法，其中在已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟中，聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物電泳采用 0. 5XTBE緩沖液或是0. 5XTAE緩沖液；DNA染色液采用萬分之一的核酸染料或相當級別的 DNA染色液；瓊脂糖凝膠要求長度12cm，梳子齒寬> 4mm ；上樣量為10 μ L ；穩(wěn)壓電源進行電泳。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法， 其中在已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟中，瓊脂糖凝膠成像采用暗箱透射紫外照射，像素百萬級以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法，其中在已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟中，對圖譜庫的分析應(yīng)用數(shù)據(jù)分析軟件，采用判別分析法以源驗證和交叉驗證得到的平均正確歸類率評估已知源大腸桿菌 rep-PCR基因指紋圖譜庫的歸類準確性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法， 其中在海洋水體糞便污染溯源分析步驟中，采用判別分析法進行未知源菌株的歸類識別。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用大腸桿菌基因指紋圖譜識別海洋水體糞便污染源的方法，包括大腸桿菌分離純化步驟、已知源大腸桿菌基因指紋圖譜庫的建立步驟和海洋水體糞便污染溯源分析步驟。本發(fā)明應(yīng)用濾膜法分離純化大腸桿菌，選用重復(fù)性基因外回文序列聚合酶鏈反應(yīng)建立已知糞便源大腸桿菌基因指紋圖譜庫，將從海洋水體樣本中分離得到的未知源大腸桿菌基因指紋圖譜與已知糞便源大腸桿菌基因指紋圖譜庫進行比對，依據(jù)相似性大小排序確定其最大可能來源，并據(jù)此識別海洋水體中糞便污染來源。本發(fā)明所需儀器設(shè)備簡單，檢測時間短，可以進行大批量樣品檢測，分辨性好、重復(fù)性強、穩(wěn)定性高，能夠滿足對近岸海域糞便污染監(jiān)測、管理的需求。
文檔編號C12N1/20GK102181518SQ20101060997
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者關(guān)道明, 宋德瑞, 李冬梅, 梁斌, 王耀兵, 韓彥壘 申請人:國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心