一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，它包括以下步驟：樣品處理：S1.收集百日咳桿菌菌體，菌體經(jīng)重懸、浸提、離心去除沉淀，將上清液超濾濃縮并調(diào)pH值到7.0；S2.一次洗脫：上清液上樣于CaptoAdhere層析柱上，用緩沖液洗脫，收集洗脫液；S3.透析：洗脫液在pH4.5～5.5、15～25mM NaAc溶液中進(jìn)行透析脫鹽，得透析液；S4.二次洗脫：透析液上樣于CaptoSPImRes層析柱，洗脫并收集洗脫液即為純化的百日咳桿菌粘附素。本發(fā)明采用CaptoAdhere層析柱、CaptoSPImRes層析柱對百日咳桿菌培養(yǎng)液的菌體進(jìn)行分離純化，所得抗原蛋白百日咳桿菌粘附素成分明確、質(zhì)量可控，純化方法具有操作簡單、純化速度快、成本低的優(yōu)點。
【專利說明】一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]百日咳(pertussis, whooping cough)是由革蘭氏陰性百日咳桿菌引起的一種具有強傳染性的呼吸系統(tǒng)疾病，典型癥狀為突然陣發(fā)性痙咳，并帶有吸氣性尾聲或伴有嘔吐，新生兒及嬰幼兒患者會引起呼吸暫停和發(fā)紺。百日咳在發(fā)病初期傳染力極強，不易診斷，因此進(jìn)行疫苗接種是預(yù)防和控制百日咳最經(jīng)濟最有效的手段。
[0003]百日咳桿菌其致病物質(zhì)主要包括百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)、絲狀血凝素(Filamentous Hemagglutinin, FHA)、百日咳桿菌粘附素(Pertactin, PRN)、凝集原(Agglutinogens, AGGs)、腺苷酸環(huán)化酶毒素(Adenylate Cyclase Toxin, ACT)、氣管細(xì)胞毒素(Tracheal Cytotoxin, TCT)和不耐熱毒素(Heat-labile toxin, HLT)等多種生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)在百日咳桿菌的致病作用和引起宿主對疾病的免疫反應(yīng)方面起著重要作用。目前市場上的百日咳疫苗主要有全菌體百日咳疫苗和無細(xì)胞百日咳疫苗兩種，后者屬于百日咳疫苗的升級產(chǎn)品，其僅含提純的有效抗原而咩有百日咳菌體，因此大大降低了注射后的不良反應(yīng)而保留了良好的免疫效果，因此被廣泛使用。
[0004]無細(xì)胞百日咳疫苗的發(fā)展趨勢，是通過純化手段去除無用且引起副反應(yīng)的組分(如HLT、TCT和ACT)，保留并提純具有保護(hù)性免疫作用的抗原成分(如PT、FHA和PRN等)，傳統(tǒng)的無細(xì)胞百日咳疫苗抗原制備工藝可以分為以下兩種:
1.離心共純化工藝:我國和日本大部分廠商采用的離心共純化工藝，即細(xì)菌培養(yǎng)液收獲后，通過硫酸銨鹽析、高鹽溶液浸提和蔗糖密度梯度離心獲得精制抗原，然后利用戊二醛溶液或者甲醛溶液將抗原脫毒為類毒素；但此種方法所需設(shè)備投資巨大，且此工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品純度不夠高、產(chǎn)率也較低，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)；
2.柱層析:包括以下幾種:(1)羥基磷灰石，結(jié)合珠蛋白柱層析和凝膠過濾法；(2)藍(lán)膠親和層析和胎球蛋白親和層析法；(3)藍(lán)膠親和層析和羥基磷灰石層析法；(4)珍珠巖層析和羥基磷灰石柱層析；雖然使用這些工藝都可得到較純的百日咳抗原PT和FHA，但(1)、
(2)、(3)工藝都有其不可避免的問題，例如:藍(lán)膠親和層析、胎球蛋白親和層析、結(jié)合珠蛋白親和層析法，層析填料的結(jié)合基團(tuán)容易降解下來而影響疫苗質(zhì)量。另外，洗脫液中含有毒物質(zhì)或者洗脫條件過于苛刻，這些都會直接影響抗原產(chǎn)率和質(zhì)量；工藝(4)雖可獲得較高純度和產(chǎn)率的PT和FHA，但菌苗培養(yǎng)物經(jīng)珍珠巖柱層析分離純化后，PT和FHA的純度只能達(dá)到62%-68%，還要經(jīng)過羥基磷灰石柱層析分離純化，PT和FHA的純度才能達(dá)到90%左右，羥基磷灰石價格昂貴，并且此步大約10%的PT和FHA損失掉。且無細(xì)胞百日咳疫苗抗原制備工藝大多是關(guān)于PT和FHA，對PRN分離純化的報道很少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，本發(fā)明采用Capto Adhere層析柱、Capto SP ImRes層析柱對百日咳桿菌培養(yǎng)液的菌體進(jìn)行分離純化，所得抗原蛋白百日咳桿菌粘附素成分明確、質(zhì)量可控，純化方法具有操作簡單、純化速度快、成本低的優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，它包括以下步驟:
51.樣品處理:收集百日咳桿菌菌體，菌體經(jīng)重懸、浸提、離心去除沉淀，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/15?1/10，并調(diào)pH值到7.0 ；
52.一次洗脫:將上清液上樣于用磷酸鹽緩沖液平衡好的Capto Adhere層析柱上，依次用A液、B液、C液、D液洗脫，收集D液的洗脫液，即為百日咳桿菌粘附素粗品；
其中，所述 A 液為 pH7.0,15 ?25mM ΡΒ、0.7 ?1.3Μ NaCl，B 液為 pH4 ?5，15 ?25mMNaAC、0.7 ?1.3M NaCl，C 液為 pH4 ?5，15 ?25mM NaAC、0.1 ?0.5M NaCl，D 液為 pH4 ?5,15 ?25mM NaAC、0.03 ?0.07M NaCl ；
53.透析:將百日咳桿菌粘附素粗品在pH4.5?5.5、15?25mM NaAc溶液中進(jìn)行透析脫鹽，得透析液；
54.二次洗脫:將透析液上樣于平衡好的Capto SP ImRes層析柱，用pH 4.5?5.5、15?25mM NaAc、0.1?0.2M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液即為純化的百日咳桿菌粘附素。
[0007]進(jìn)一步地，步驟S1所述樣品處理的具體操作為:百日咳桿菌培養(yǎng)液降溫至2?8°C，離心去除上清液，收集菌體，將收集到的菌體在pH8?9、90?llOmM Tris、130?170mMNaCl緩沖液中重懸，每克菌體加入8?12ml緩沖液，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/15?1/10，用40?60%的醋酸調(diào)pH值到7.0。
[0008]進(jìn)一步地，步驟S4中所述Capto SP ImRes層析柱采用20mM NaAC, ρΗ5.0的溶液平衡。
[0009]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明采用Capto Adhere層析柱、Capto SP ImRes層析柱對百日咳桿菌培養(yǎng)液的菌體進(jìn)行分離純化，所得抗原蛋白百日咳桿菌粘附素成分明確、質(zhì)量可控，分離純化百日咳桿菌粘附素的純度達(dá)到99%，純化方法具有操作簡單、純化速度快、成本低的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明一次洗脫的層析圖譜；
圖2為本發(fā)明二次洗脫的層析圖譜；
圖3為本發(fā)明分離純化的百日咳桿菌粘附素純度分析電泳圖。

【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。實施例1:一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，它包括以下步驟:
S1.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)液降溫至2?8°C，離心去除上清液，收集菌體，將收集到的菌體在pH8、90mM Tris、130mM NaCl緩沖液中重懸，每克菌體加入8ml緩沖液，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/15，用40%的醋酸調(diào)pH值到7.0 ； 52.一次洗脫:將上清液上樣于用磷酸鹽緩沖液平衡好的Capto Adhere層析柱上，依次用 A 液(pH7.0、15mM ΡΒ、0.7Μ NaCl )、Β 液(pH4，15mM NaAC、0.7M NaCl )、C 液(pH4，15mMNaAC、0.1M NaCl )、D液(pH4，15mM NaAC、0.03M NaCl)洗脫，收集D液的洗脫液，即為百日咳桿菌粘附素粗品，一次洗脫的層析圖譜如圖1所示；
53.透析:將百日咳桿菌粘附素粗品在pH4.5、15mM NaAc溶液中進(jìn)行透析脫鹽，得透析液；
54.二次洗脫:將透析液上樣于用20mM NaAC，pH5.0的溶液平衡好的Capto SP ImRes層析柱，用pH 4.5、15mM NaAc、0.1M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液即為純化的百日咳桿菌粘附素，二次洗脫的層析圖譜如圖1所示。
[0012]實施例2:—種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，它包括以下步驟:
51.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)液降溫至8°C，離心去除上清液，收集菌體，將收集到的菌體在pH9、110mM Tris、170mM NaCl緩沖液中重懸，每克菌體加入12ml緩沖液，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/10，用60%的醋酸調(diào)pH值到7.0 ；
52.一次洗脫:將上清液上樣于用磷酸鹽緩沖液平衡好的Capto Adhere層析柱上，依次用 A 液(pH7.0、25mM ΡΒ、1.3Μ NaCl )、Β 液(pH5，25mM NaAC、1.3M NaCl )、C 液(pH5，25mMNaAC、0.5M NaCl)、D液(pH5，25mM NaAC、0.07M NaCl)洗脫，收集D液的洗脫液，即為百日咳桿菌粘附素粗品，一次洗脫的層析圖譜如圖1所示；
53.透析:將百日咳桿菌粘附素粗品在pH5.5、25mMNaAc溶液中進(jìn)行透析脫鹽，得透析液；
54.二次洗脫:將透析液上樣于用20mM NaAC，pH5.0的溶液平衡好的Capto SP ImRes層析柱，用pH 5.5、25mM NaAc、0.2M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液即為純化的百日咳桿菌粘附素，二次洗脫的層析圖譜如圖2所示。
[0013]實施例3:—種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，它包括以下步驟:
51.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)液降溫至4°C，離心去除上清液，收集菌體，將收集到的菌體在pH8.3、100mM Tris、140mM NaCl緩沖液中重懸，每克菌體加入10ml緩沖液，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/12，用48%的醋酸調(diào)pH值到7.0 ；
52.一次洗脫:將上清液上樣于用磷酸鹽緩沖液平衡好的Capto Adhere層析柱上，依次用 A 液(pH7.0、18mM ΡΒ、1.0Μ NaCl )、Β 液(ρΗ4.5，20mM NaAC、1.0M NaCl )、C 液(ρΗ4.5，20mM NaAC、0.2M NaCl )、D 液(pH4.5，20mM NaAC、0.04M NaCl)洗脫，收集 D 液的洗脫液，SP為百日咳桿菌粘附素粗品，一次洗脫的層析圖譜如圖1所示；
53.透析:將百日咳桿菌粘附素粗品在pH5.0、18mM NaAc溶液中進(jìn)行透析脫鹽，得透析液；
54.二次洗脫:將透析液上樣于用20mM NaAC，pH5.0的溶液平衡好的Capto SP ImRes層析柱，用pH 5.0、18mM NaAc、0.15M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液即為純化的百日咳桿菌粘附素，二次洗脫的層析圖譜如圖2所示。
[0014]實施例4:一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，它包括以下步驟:
S1.樣品處理:百日咳桿菌培養(yǎng)液降溫至6°C，離心去除上清液，收集菌體，將收集到的菌體在pH8.7、108mM Tris、160mM NaCl緩沖液中重懸，每克菌體加入11ml緩沖液，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/14，用53%的醋酸調(diào)pH值到7.0 ； 52.一次洗脫:將上清液上樣于用磷酸鹽緩沖液平衡好的Capto Adhere層析柱上，依次用 A 液(pH7.0、22mM ΡΒ、1.2Μ NaCl )、Β 液(ρΗ4.8，18mM NaAC、1.2M NaCl )、C 液(ρΗ4.8，23mM NaAC、0.3M NaCl )、D 液(pH4.3，23mM NaAC、0.06M NaCl)洗脫，收集 D 液的洗脫液，SP為百日咳桿菌粘附素粗品，一次洗脫的層析圖譜如圖1所示；
53.透析:將百日咳桿菌粘附素粗品在pH5.2、18mM NaAc溶液中進(jìn)行透析脫鹽，得透析液；
54.二次洗脫:將透析液上樣于用20mM NaAC，pH5.0的溶液平衡好的Capto SP ImRes層析柱，用pH 4.8、23mM NaAc、0.18M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液即為純化的百日咳桿菌粘附素，二次洗脫的層析圖譜如圖2所示。
實施例5:純度分析(SDS-PAGE)
1.實驗方法:SDS-PAGE銀染法。
[0015]1.1樣品處理:待檢樣品為實施例3離純化的百日咳桿菌粘附素(PRN)先將樣品稀釋，一般可以將待檢樣品稀釋成每毫升0.3-0.5毫克，上樣樣品含四分之三的待檢品，四分之一的樣品處理液，不需水浴。上樣量一般為每道含待檢樣品PRN 2微克，百日咳標(biāo)準(zhǔn)品(PRN)蛋白2-3微克，分子量標(biāo)準(zhǔn)品蛋白(Maker) 2微克。
[0016]1.2電泳并染色:本實驗采用垂直電泳，開始濃縮膠電壓低些(70-80V，大約20分鐘)，分離膠時電壓高些(150-200V)，全過程電泳時間大約60-80分鐘。待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)電泳槽底部(陽極)時，切斷電源，打開電泳槽上蓋，取出電泳槽支架并倒掉內(nèi)槽內(nèi)的液體，小心取下玻板并把兩片玻板分開，輕輕地將玻板上的濃縮膠與分離膠分開并舍去濃縮膠部分，將分離膠小心地取下放入已準(zhǔn)備好的存有固定液的容器里(或大平皿內(nèi))開始染色，染色為銀染法。
[0017]2.實驗結(jié)果:還原電泳凝膠蛋白質(zhì)經(jīng)掃描，計算待檢樣品PRN相對于的條帶占總蛋白的百分比。
[0018]電泳圖如圖3所示:
圖中:M:maker ；
PRN1為一次洗脫的百日咳桿菌粘附素粗品；
PRN2為二次洗脫的純化的百日咳桿菌粘附素。
[0019]由圖3可知:PRN分子量為66KD，電泳圖譜顯示與文獻(xiàn)報道一致，經(jīng)本發(fā)明方法得到的PRN純度達(dá)到99%。
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，其特征在于，它包括以下步驟: 51.樣品處理:收集百日咳桿菌菌體，菌體經(jīng)重懸、浸提、離心去除沉淀，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/15?1/10，并調(diào)pH值到7.0 ； 52.一次洗脫:將上清液上樣于用磷酸鹽緩沖液平衡好的Capto Adhere層析柱上，依次用A液、B液、C液、D液洗脫，收集D液的洗脫液，即為百日咳桿菌粘附素粗品； 其中，所述 A 液為 ρΗ7.0、15 ?25mM PB,0.7 ?1.3M NaCl，B 液為 pH4 ?5，15 ?25mMNaAC,0.7 ?1.3M NaCl，C 液為 pH4 ?5，15 ?25mM NaAC,0.1 ?0.5M NaCl，D 液為 pH4 ?5,15 ?25mM NaAC,0.03 ?0.07M NaCl ； 53.透析:將百日咳桿菌粘附素粗品在pH4.5?5.5、15?25mM NaAc溶液中進(jìn)行透析脫鹽，得透析液； 54.二次洗脫:將透析液上樣于平衡好的Capto SP ImRes層析柱，用pH 4.5?5.5、15?25mM NaAc,0.1?0.2M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液即為純化的百日咳桿菌粘附素。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，其特征在于，步驟SI所述樣品處理的具體操作為:百日咳桿菌培養(yǎng)液降溫至2?8°C，離心去除上清液，收集菌體，將收集到的菌體在PH8?9、90?IlOmM Tris、130?170mM NaCl緩沖液中重懸，每克菌體加入8?12ml緩沖液，將上清液用30KD截留分子量膜包超濾濃縮至原體積的1/15?1/10，用40?60%的醋酸調(diào)pH值到7.0。
3.如權(quán)利要求1所述的一種分離純化百日咳桿菌粘附素的方法，其特征在于，步驟S4中所述Capto SP ImRes層析柱采用20mM NaAC, pH5.0的溶液平衡。
【文檔編號】C07K14/235GK104262469SQ201410516831
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】陳道遠(yuǎn), 吳強, 馬禮耕, 伍長華, 陳克平 申請人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司