從皺紋盤鮑鮑魚內(nèi)臟中分離的抗炎肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說生物活性肽領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及使用連續(xù)HPLC純化系統(tǒng)從鮑魚腸中分離的抗炎肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]炎癥表示允許組織響應(yīng)于損傷或感染的一組高度協(xié)調(diào)的事件，其需要各種細(xì)胞類型表達(dá)的參與和以順序的方式對(duì)各種各樣媒介物的反應(yīng)(Sebban&Courtois，2006)。巨噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中的主要免疫細(xì)胞。當(dāng)被病原體感染時(shí)，巨噬細(xì)胞的活化在炎癥響應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞可以通過吞噬作用直接地殺死病原體和通過分泌各種促炎癥媒介物間接地殺死病原體。巨噬細(xì)胞在涉及促炎癥細(xì)胞因子和炎癥媒介物的生成過剩的炎性疾病中起著重要的作用，促炎癥細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(IL-li3)、IL_6和腫瘤壞死因子(TNF-α)，炎癥媒介物包括由活化誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)生成的氧化物(NO) (Lee等人，2006;Walsh，Crotti，Goldring，&Gravallese，2005)。勵(lì)經(jīng)由L-精氨酸的末端胍氮的氧化由NOS生成，且涉及炎癥和致癌作用(Wong&Bi 11 iar，1995)。因此，通過阻斷iNOS表達(dá)來抑制NO生成過?？捎糜谥委煾鞣N炎性病癥。
[0003]脂多糖(LPS)，是革蘭氏陰性菌的主要成分，引起在炎癥響應(yīng)的發(fā)病機(jī)理中起到關(guān)鍵的作用的許多主要的細(xì)胞響應(yīng)，且已被用于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。在用LPS刺激之后，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)還調(diào)節(jié)關(guān)鍵的促炎癥途徑。MAPK(ERK 1/2，p38和JNK)是響應(yīng)于各種陣列的細(xì)胞外刺激而被活化且介導(dǎo)從細(xì)胞表面到核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一組絲氨酸/蘇氨酸激酶(Cobb&Goldsmith，1995)。此外，MAPK先前已經(jīng)涉及與LPS誘發(fā)的炎癥相關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路。已經(jīng)表明三種主要的MAPK的磷酸化和活化在LPS誘發(fā)的巨噬細(xì)胞中引起炎癥基因表達(dá)(Hommes，Peppelenbosch，&van Deventer，2004)。LPS處理導(dǎo)致經(jīng)由MAPK信號(hào)通路通過使p38、ERK和JNK磷酸化來調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)，p38、ERK和JNK是MAPK亞科的主要三個(gè)不同的組(Car1等人，2000)，被認(rèn)為在炎性疾病中以不同的性能起著不同的作用。因此，MAPK的參與經(jīng)常涉及疾病的發(fā)生和免疫或炎癥響應(yīng)的表達(dá)(Inoue&Kubo，2004)。
[0004]生物活性肽是對(duì)身體功能或狀況具有積極影響且最終可能影響人類健康的特定蛋白片段;其預(yù)期由安全、可靠和一致的口服遞送系統(tǒng)來提供。腸胃蛋白水解酶幫助在消化之后釋放肽，且這些被吸收的組分部分對(duì)人來說足以是生理學(xué)上活性的。此外，也已報(bào)道了源自胃消化液的生物活性肽對(duì)抗炎、抗高血壓、抗氧化、抗癌、抗菌和抗關(guān)節(jié)炎方面具有有益效果(Jung，Rajapakse，&Kim，2005; Rajapakse，Mendi s，Jung，Je，&Kim，2005; Ryu，Qian，&Kim，2010)。特別地，由于胃消化液肽為生產(chǎn)相當(dāng)大量的生物活性肽提供了迅速和可再現(xiàn)的方法，胃消化液肽可成為營(yíng)養(yǎng)制劑中潛在有益的成分(Kapsokefalou&Miller，1991)。
[0005]鮑魚是海洋腹足動(dòng)物，它們是亞洲、非洲、澳洲和美洲中大量海上養(yǎng)殖的重要漁業(yè)和食物工業(yè)資源之一。太平洋鮑魚，即皺紋盤鮑，已經(jīng)從二十世紀(jì)九十年代在東亞地區(qū)大量海上養(yǎng)殖。
[0006]海洋生物擁有具有許多營(yíng)養(yǎng)和藥物活性相關(guān)的生理功能的各種生物活性天然組分，所述生理功能例如抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗高血壓、抗凝、抗心血管疾病等(Mayer，Rodriguez，Berlinck，&Fusetani，2011)。然而，雖然已經(jīng)關(guān)于病理學(xué)、遺傳學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)對(duì)鮑魚的生物學(xué)性質(zhì)和生理性質(zhì)進(jìn)行了許多研究，但很少報(bào)告鮑魚對(duì)健康的有益影響(Sun等人，2OlO;Ekanayake等人，2008 ； Zoysa等人，2009 ； Wan，Whang，&Lee，2005)。
[0007]在本發(fā)明中，申請(qǐng)人公開了來自鮑魚內(nèi)臟蛋白中肽的純化和表征，并檢測(cè)了該肽對(duì)其通過誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)來抑制一氧化氮(NO)產(chǎn)生和減少巨噬細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄的效果。這些事件與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化一致。通過肽抑制該信號(hào)途徑可以調(diào)節(jié)LPS誘發(fā)的炎癥響應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]最近，通過蛋白水解獲得的生物活性肽由于其舒展結(jié)構(gòu)、組成和序列的性質(zhì)以及它們的生物學(xué)活性而受到大量關(guān)注。它們可用作生產(chǎn)人的營(yíng)養(yǎng)制品和醫(yī)藥品的通用原材料。生物活性肽已經(jīng)從包含高蛋白濃度的各種原材料中獲得(Vo，Ryu，&Kim，2013; Harnedy&FitZGerald，2012)。因此，鮑魚(皺紋盤鮑)被認(rèn)為是用于生產(chǎn)生物活性肽例如抗炎肽的主要來源。利用體外模擬胃腸道消化-包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和a-胰凝乳蛋白酶的胃腸肽鏈內(nèi)切酶水解。據(jù)信先前用肽鏈內(nèi)切酶水解可以增加活性肽的生物利用度并避免在胃腸道中進(jìn)一步消化。先前的研究已經(jīng)表明，與單酶消化相比，胃腸道酶消化導(dǎo)致更有效的肽(Vo，Ryu，&Kim，2013)。值得注意的是，具有低分子量的生物活性肽可能跨過腸屏障。大量研究已經(jīng)證實(shí)，低分子量肽顯示出有效的抗炎生物活性。Lee等人(2009)制備了具有1.3kDa以下的尺寸分布的蛋白肽，且這些肽減弱了炎性腸病的癥狀。來自極大螺旋藻(spirulinamaxima)的抗炎LDAVNR(683Da)和MMLDF(655Da)、來自長(zhǎng)牡頓(Crassostrea gigas)的QCQCAVEGGL( 1007.28Da)、和來自菲律賓蛤仔(Ruditapes phiIippinarum)的QCQQAVQSAV204( 1061.32Da)，呈現(xiàn)出抗炎效應(yīng)(Vo，Ryu，&Kim，2013 ;Hwang 等人，2012 ;Lee 等人，2012)。根據(jù)文獻(xiàn)，抗炎肽具有寬范圍的分子量。本發(fā)明者進(jìn)行了大量的研究使用連續(xù)HPLC純化系統(tǒng)從鮑魚(皺紋盤鮑)腸中分離出抗炎肽AAIP(Pro-Phe-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala_Ser，1175.2Da)，并發(fā)現(xiàn)其具有有效的抗炎效果。另一方面，本發(fā)明涉及該抗炎肽AAIP在抗炎療法中的用途，以及作為功能性保健食品的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明還涉及該抗炎肽AAIP在制備用于治療炎癥的藥物和保健性食品中的用途。
[0009 ] 具體地，本發(fā)明使用胃消化工藝(即Kapsokef al ou&Mi 11 er (1991)中描述的方法)，通過先后加入一定量的胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶在一定的溫度和PH下進(jìn)行水解。然后，通過UF膜生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)。隨后通過離子交換色譜法和HPLC進(jìn)行純化。與現(xiàn)有技術(shù)利用酶解方法相比，本發(fā)明的使用胃腸道酶消化將會(huì)獲得更有效的肽，本發(fā)明利用模擬胃腸道消化技術(shù)獲得的活性肽應(yīng)用于保健品比酶解獲得的活性肽更容易跨過腸屏障，容易吸收，活性效果更佳。
【附圖說明】
[0010]圖1.來自AIGID III的抑制NO生成的肽的純化。(A)通過Hiprep 16/10DEAE FF陰離子交換色譜法的AIGID III的快速蛋白液相色譜法(FPLC)，且使用20mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中的2.0M NaCl的線性梯度溶液(0-100 % )，以2.4mL/min的流速進(jìn)行洗脫。(B)使用FPLC在Hiprep 16/1ODEAE FF柱上各級(jí)分抑制NO生成的活性。誤差棒表示在從原始值減去背景值之后來自三份實(shí)驗(yàn)的平均值和S.D。
[0011]圖2.(A)Fr IV活性組分在Primesphere 1Ci8柱上的反相HPLC圖，且HPLC操作使用15%乙腈作為流動(dòng)相，以lmL/min的流速，使用UV探測(cè)器在215nm下進(jìn)行。(B)在Primesphere10C18柱色譜上具有反相HPLC圖的級(jí)分抑制NO生成的活性。誤差棒表示在從原始值減去背景值之后來自三份實(shí)驗(yàn)的平均值和S.D13(C)將具有最高生成活性的活性級(jí)分峰通過最后在Synchropak RPP-100分析柱上純化來進(jìn)一步分離。HPLC操作使用10%乙腈作為流動(dòng)相，以lmL/min的流速，使用UV探測(cè)器在215nm下進(jìn)行。(D)AAIP的分子質(zhì)量和氨基酸序列的識(shí)別。MS/MS實(shí)驗(yàn)在設(shè)置有納米-ESI源的Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀(Micromass C0.,Manchester，UK)上進(jìn)行。活性肽的測(cè)序在m/z范圍50-2500內(nèi)獲得，并通過使用P印Seq de nove測(cè)序算法來測(cè)序。
[0012]圖3.(A)AAIP對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的細(xì)胞相容性影響。細(xì)胞用指定濃度(0_500μΜ)的AAIP處理。在AAIP處理24h之后，細(xì)胞活力通過如文本中所描述的MTT測(cè)定來評(píng)估。結(jié)果是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。(B)AAIP對(duì)RAW264.7細(xì)胞中LPS誘發(fā)的NO生成的影響。在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞用不同濃度(10-500μΜ)的AAIP預(yù)處理lh，然后用LPS(100ng/mL)刺激。條件培養(yǎng)基在48h之后收集，且NO濃度使用格里斯反應(yīng)測(cè)量。
[0013]圖4.AAIP對(duì)RAW264.7細(xì)胞中LPS誘發(fā)的mRNA和iNOS蛋白表達(dá)的影響。在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞用不同濃度(10_500μΜ)的AAIP預(yù)處理lh，且然后用LPS(100ng mL—1)刺激。提取細(xì)胞溶解產(chǎn)物，且分別通過RT-PCR和蛋白印跡分析iNOS的基因和蛋白水平。GATOH和β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)分別用作RT-PCR和蛋白印跡中基因和蛋白的內(nèi)部對(duì)照。(A)提取細(xì)胞溶解產(chǎn)物，并通過RT-PCR分析基因(IL-Ιβ、TNF-a和IL-6 )0(B)提取細(xì)胞溶解產(chǎn)物，并分別通過蛋白印跡分析iNOS的蛋白水平。
[0014]圖