一種鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶及其用于合成紅景天苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一種鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶及其用于合成紅景天苷的方法。本發(fā)明所述的鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。其制備方法為S1.取20～50mg葡萄糖和500～800mg對(duì)羥基苯乙醇與20～50mg鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶；S2.再加入15～50ml有機(jī)溶劑及1～3ml緩沖溶液混合均勻；S3.密封，在50～80℃下，震蕩反應(yīng)36～72h，即得紅景天苷。本發(fā)明制備得到的新穎鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶在進(jìn)行紅景天苷合成中的催化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于從杏仁和蘋果籽中提取出來(lái)的β-葡萄糖苷酶；為工業(yè)化大生產(chǎn)紅景天苷提供了一種高效的催化劑。
【專利說(shuō)明】一種鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶及其用于合成紅景天苷的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶及其用于合成紅景天苷的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖苷酶作為纖維素酶的一個(gè)重要組成部分，在醫(yī)療、食品、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中有重要的應(yīng)用價(jià)值。在一定條件下，β_葡萄糖苷酶還可以進(jìn)行逆水解的轉(zhuǎn)糖基作用。因此國(guó)內(nèi)外利用β_葡萄糖苷酶在有機(jī)介質(zhì)中合成烷基糖苷成為新的熱點(diǎn)，現(xiàn)已成功合成了多種烷基糖苷化合物、低聚糖、抗生素的糖苷化合物等，這些產(chǎn)品在制藥、化工、化妝品、洗滌劑、食品添加劑等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。因此，尋找具有更高逆水解活性的β_葡萄糖苷酶或?qū)ΜF(xiàn)有的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行改造以提高其逆水解活性吸引了眾多研究者的目光。
[0003]β-葡萄糖苷酶于1837年首次發(fā)現(xiàn)與苦杏仁中，該酶在自然界中的分布廣泛，在植物的種子和微生物中尤為普遍，在動(dòng)物和真菌體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)該酶的存在。β -葡萄糖苷酶的植物來(lái)源有人參、大豆等；微生物來(lái)源的報(bào)道較多，如原核微生物來(lái)源的有腦膜膿毒性黃桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)、約氏黃桿菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物來(lái)源的有清酒酵母(Candidapeltata)、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)等；β -葡萄糖苷酶的動(dòng)物來(lái)源有蜜蜂、豬肝、豬小腸等。不同來(lái)源的β _葡萄糖苷酶其催化活性也各異。目前尚無(wú)對(duì)鮑魚(yú)內(nèi)臟β_葡萄糖苷酶的研究報(bào)道。
[0004]紅景天一般生長(zhǎng)于歐亞兩州高原地帶，為景天科多年生草本或亞灌木植物，具有“高原人參”的美譽(yù)。全世界共有紅景天屬植物96種，主要分布與東亞、中亞、西伯利亞和北美地區(qū)。我國(guó)有73種，主要分布于西南、西北、華北和東北地區(qū)。紅景天的主要有效成分為紅景天苷，化學(xué)名對(duì)羥基苯乙基-β -D-葡萄糖苷，是目前研究最多的紅景天中的主要活性成分，是評(píng)價(jià)紅景天品質(zhì)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。紅景天苷具有顯著的生物學(xué)活性，其效果優(yōu)于常用的人參和刺五加等中藥，在清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多自由基、抗缺氧、抗衰老、抗心肌缺血、提高機(jī)體免疫力等方面具有顯著效果，因此能同時(shí)發(fā)揮防輻射和抗疲勞的雙重作用。
[0005]紅景天苷的來(lái)源目前主要有三種途徑，第一為植物來(lái)源；第二為化學(xué)合成；第三為酶法合成。2004年，Tong等利用蘋果籽粉β-葡萄糖苷酶以對(duì)羥基苯乙醇和葡萄糖為底物首次進(jìn)行了合成，反應(yīng)完成后紅景天苷濃度可達(dá)11.8g/L，高于化學(xué)合成法與植物來(lái)源法。因此，酶法成為合成紅景天苷的一種有效方法。目前用于合成紅景天苷的β_葡萄糖苷酶并不多見(jiàn)，因此，開(kāi)發(fā)具有更高效率的用于合成紅景天苷的β -葡萄糖苷酶以及利用該酶摸索最佳反應(yīng)條件及具有極大地市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種新穎的鮑魚(yú)內(nèi)臟葡萄糖苷酶。
[0007]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，鮑魚(yú)內(nèi)臟β_葡萄糖苷酶用于合成紅景天苷的方法。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題，通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶，具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
[0009]SEQ ID N0.1的氨基酸序列如下:
Trp Gly Val Glu Tyr Ala Ser Tyr Leu Asn Glu Pro Gln Trp Asn Ser
Glu Trp Arg Glu Pro Asp His Phe Asp Thr Phe Ser Arg Asp Glu Lys
Thr Gly Tyr Asn Gly Asp Ala Cys Arg His Tyr Gly Gly His Tyr His
Arg Tyr Lys Thr Asp Val He His Arg Glu Glu Asp Gly Val Ala Leu
He Arg Phe Ser Lys Gly Trp Pro Arg He Val Ala Leu Glu Gly Lys
His His Leu Ala Gly Met Val He Pro Lys Arg Leu Val Trp Gly Lys
Leu Lys Gly Asn He Cys Ala Ser Ala Thr Ile He Gly Tyr Asp Leu
Val His Asp Ala Tyr Pro Gly Lys Gly Asp Ser Val Asn Arg Asn Lys
Arg Tyr Trp Tyr Val Glu Val Pro Lys Gly Leu Phe Glu Glu Met Leu
Tyr Asp Val He Pro Trp He Cys Ser Ala Glu Pro Trp Phe Leu Val
He Lys He Ser Tyr Gly He Gly Glu Ala Pro Asn His Asp Glu Tyr
Arg Glu Ala Leu He Val Gln He His He Leu Val Pro His Gly Glu
Ala Ser Lys He Phe Arg Glu Met Asn Phe Asp Lys Gly Ser Lys Ile
Ser Pro Thr Leu Asn Lys He Thr Ala Tyr Gly Val Ser Glu Leu Tyr
Asp Asp Lys Leu Ala Glu Tyr Tyr Ala Asn Ala Phe Ala Asn Glu Ala
Phe Leu Asp Pro He Phe Lys Arg He Lys Pro Glu Asp Met Met Glu
Glu His Lys Lys Ile He Asp Val Glu Val Phe He Lys Glu Asn Asp
Leu Lys Ser Thr He Val Asp Glu Asp Phe Leu Gly Val Asn Tyr Thr
Ser Glu Ser He Val Lys Asp Asn Asp Tyr Ser Met Leu Lys Ala Glu
Asp Glu Met Gly Pro Gly Lys Arg Thr Glu Met Gly Lys Glu Phe Trp
Pro Glu Ser Asp Leu He Leu Leu Lys Asn Glu Glu Phe Asp Tyr Thr
Lys Pro Gly Met Tyr He Thr Ser Asn Glu Asn Phe Phe Lys Asp Glu
Asp Gly Val Ala Ser Arg Val His Asn Asp Glu Tyr Trp Met Pro Lys
Glu Asn His Leu Lys Phe Lys He Lys Phe Glu Pro Phe Arg Gly Ile
Leu Met Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu Met Asp Lys He Phe
鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶用于催化合成紅景天苷的方法，包含如下步驟:
51.取2(T50mg葡萄糖和50(T800mg對(duì)羥基苯乙醇與2(T50mg鮑魚(yú)內(nèi)臟β- 葡萄糖苷酶；
52.再加入15飛Oml有機(jī)溶劑及f3ml緩沖溶液混合均勻；
53.密封，在5(T80°C下，震蕩反應(yīng)36?72h，即得紅景天苷。
[0010]作為一種優(yōu)選方案，S1.中所述的葡萄糖用量4(T50mg，對(duì)羥基苯乙醇的用量為70(T800mg ;鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶的用量為4(T50mg。
[0011]作為一種最優(yōu)選方案，S1.中所述的葡萄糖用量40mg，對(duì)羥基苯乙醇的用量為700mg ;鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶的用量為40mg。
[0012]作為一種優(yōu)選方案，S2.中所述有機(jī)溶劑用量為15?20ml ;所述緩沖溶液用量為I?2ml。
[0013]作為一種最優(yōu)選方案，S2.中所述有機(jī)溶劑用量為20ml ;所述緩沖溶液用量為2ml。
[0014]作為一種優(yōu)選方案，S2.中所述的有機(jī)溶劑為1，4_ 二氧六環(huán)；緩沖溶液為檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液。
[0015]作為一種優(yōu)選方案，S2.中所述朽1檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液的pH值為5.0?6.0。
[0016]作為一種最優(yōu)選方案，S2.中所述檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液的pH值為6.0。
[0017]作為一種優(yōu)選方案，S3.中所述的反應(yīng)溫度為70°C，反應(yīng)時(shí)間為48h。
[0018]本發(fā)明所述的鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶通過(guò)如下方法制備得到:
51.取鮑魚(yú)內(nèi)臟50g，加入適量石英砂及500ml經(jīng)過(guò)預(yù)冷的溫度為4°C檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(的PH值為6，離子強(qiáng)度為20mmol/L)，在0°C冰浴上充分研磨成勻漿；
52.將S1.制備得到的勻漿進(jìn)行高速離心，離心速度為12000r/min，取上清液，過(guò)10kDa I旲截留蛋白質(zhì)，超濾濃縮蛋白質(zhì)；
53.將濃縮后的蛋白質(zhì)上SephadexS-200分子篩凝膠柱進(jìn)行柱層析；凝膠柱層析用的洗脫液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(的PH值為6，離子強(qiáng)度為20mmol/L)，洗脫速度為0.5ml/min,用試管每1min收集I管。
[0019]S4.將S3.收集的樣品利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE進(jìn)行純度檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)第2(Γ25管收集的樣品為同一種樣品，將其合并、凍干得鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶凍干粉。利用MALD1-T0F等技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定，確定為權(quán)利要求1所述的鮑魚(yú)內(nèi)臟葡萄糖苷酶。
[0020]有益效果:(1)本發(fā)明通過(guò)研究，從鮑魚(yú)內(nèi)臟中發(fā)現(xiàn)了新穎的具有催化活性的鮑魚(yú)內(nèi)臟β_葡萄糖苷酶；(2)本發(fā)明制備得到的新穎鮑魚(yú)內(nèi)臟β_葡萄糖苷酶在進(jìn)行紅景天苷合成中的催化活性較已知的從杏仁中提取出來(lái)的葡萄糖苷酶要強(qiáng)；(3)本發(fā)明所述的鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶的提取方法新穎，步驟簡(jiǎn)單，得到的鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶純度較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)；(4)本發(fā)明是從鮑魚(yú)加工的廢棄物鮑魚(yú)內(nèi)臟中提取β-葡萄糖苷酶，解決了鮑魚(yú)內(nèi)臟污染環(huán)境的問(wèn)題，變廢為寶。

【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例對(duì)本發(fā)明不做任何形式的限定。
[0022]實(shí)施例1
51.取鮑魚(yú)內(nèi)臟50g，加入適量石英砂及500ml經(jīng)過(guò)預(yù)冷的溫度為4°C檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(的PH值為6，離子強(qiáng)度為20mmol/L)，在0°C冰浴上充分研磨成勻漿；
52.將S1.制備得到的勻漿進(jìn)行高速離心，離心速度為12000r/min，取上清液，過(guò)10kDa I旲截留蛋白質(zhì)，超濾濃縮蛋白質(zhì)；
53.將濃縮后的蛋白質(zhì)上S印hadexS-200分子篩凝膠柱進(jìn)行柱層析；凝膠柱層析用的洗脫液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(的PH值為6，離子強(qiáng)度為20mmol/L)，洗脫速度為
0.5ml/min,用試管每1min收集I管。
[0023]S4.將S3.收集的樣品利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE進(jìn)行純度檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)第2(Γ25管收集的樣品為同一種樣品，將其合并、凍干得鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶凍干粉。利用MALD1-T0F等技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定，確定為權(quán)利要求1所述的鮑魚(yú)內(nèi)臟葡萄糖苷酶。
[0024]實(shí)施例2
在10ml具塞試管中，加入40mg葡萄糖(C6H12O6), 700mg對(duì)羥基苯乙醇，2ml檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 6.0), 20ml 1，4-二氧六環(huán)和40mg鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶凍干粉(實(shí)施例1制備得到)，混合均勻后密封，放入搖床(160rpm，70°C)反應(yīng)。反應(yīng)48h后，檢測(cè)反應(yīng)達(dá)到平衡。用液相色譜儀(Inertsil 0DS-4column, GL Sciences Inc.)分析測(cè)定產(chǎn)物濃度，流動(dòng)相為甲醇/水(70/30，v/v，0.8ml/min),30°C，275nm紫外檢測(cè)。結(jié)果測(cè)得紅景天苷的濃度為68.6g/L。
[0025]實(shí)施例3
在10ml具塞試管中，加入20mg葡萄糖(C6H12O6)，500mg對(duì)羥基苯乙醇，Iml檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 5.0), 15ml 1，4-二氧六環(huán)和20mg鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶凍干粉(實(shí)施例1制備得到)，混合均勻后密封，放入搖床(160rpm，50°C)反應(yīng)。反應(yīng)72h后，檢測(cè)反應(yīng)達(dá)到平衡。用液相色譜儀(Inertsil 0DS-4column, GL Sciences Inc.)分析測(cè)定產(chǎn)物濃度，流動(dòng)相為甲醇/水(70/30，v/v，0.8ml/min)，30°C，275nm紫外檢測(cè)。結(jié)果測(cè)得紅景天苷的濃度為60.4g/L。
[0026]實(shí)施例4
在10ml具塞試管中，加入50mg葡萄糖(C6H12O6), 800mg對(duì)輕基苯乙醇,3ml梓檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 6.0), 50ml 1，4-二氧六環(huán)和50mg鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶凍干粉(實(shí)施例1制備得到)，混合均勻后密封，放入搖床(160rpm，70°C)反應(yīng)。反應(yīng)36h后，檢測(cè)反應(yīng)達(dá)到平衡。用液相色譜儀(Inertsil 0DS-4column, GL Sciences Inc.)分析測(cè)定產(chǎn)物濃度，流動(dòng)相為甲醇/水(70/30，v/v，0.8ml/min),30°C，275nm紫外檢測(cè)。結(jié)果測(cè)得紅景天苷的濃度為63.6g/L。
[0027]對(duì)比例I
在10ml具塞試管中，加入40mg葡萄糖(C6H12O6), 700mg對(duì)羥基苯乙醇，2ml檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH 6.0)，20ml 1，4_ 二氧六環(huán)和40mgi3 -葡萄糖苷酶(杏仁中提取，購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，產(chǎn)品CAS號(hào):9001-22-3 )，混合均勻后密封，放入搖床(160rpm,70°C)反應(yīng)。反應(yīng)48h后，檢測(cè)反應(yīng)達(dá)到平衡。用液相色譜儀(Inertsil0DS-4column, GL Sciences Inc.)分析測(cè)定產(chǎn)物濃度,流動(dòng)相為甲醇/水(70/30, v/v,
0.8ml/min)，30°C，275nm紫外檢測(cè)。結(jié)果測(cè)得紅景天苷的濃度為8.lg/L。
[0028]結(jié)論:本發(fā)明制備得到的鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶在催化合成紅景天苷時(shí)反應(yīng)體系中紅景天的濃度均大于60g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)中利用蘋果籽粉β -葡萄糖苷酶催化時(shí)的11.8g/L以及對(duì)比例中利用杏仁β -葡萄糖苷酶催化時(shí)的8.lg/L。本發(fā)明制備得到的鮑魚(yú)內(nèi)臟β_葡萄糖苷酶具有很高的催化合成紅景天苷作用。理論上紅景天苷濃度為
1.3g/L時(shí)即具有工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值，而經(jīng)本發(fā)明生物催化法合成的紅景天苷濃度可達(dá)50g/L，為工業(yè)化大生產(chǎn)紅景天苷提供了一種極高效的催化劑。
【權(quán)利要求】
1.一種鮑魚(yú)內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶，其特征在于，具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的鮑魚(yú)內(nèi)臟β_葡萄糖苷酶用于催化合成紅景天苷的方法，其特征在于，包含如下步驟: 51.取2(T50mg葡萄糖和50(T800mg對(duì)羥基苯乙醇與2(T50mg鮑魚(yú)內(nèi)臟β- 葡萄糖苷酶； 52.再加入15飛Oml有機(jī)溶劑及f3ml緩沖溶液混合均勻； 53.密封，在5(T80°C下，震蕩反應(yīng)36?72h，即得紅景天苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S1.中所述的葡萄糖用量 4(T50mg，對(duì)羥基苯乙醇的用量為70(T800mg ;鮑魚(yú)內(nèi)臟葡萄糖苷酶的用量為40^50mgo
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，S1.中所述的葡萄糖用量40mg， 對(duì)羥基苯乙醇的用量為700mg ;鮑魚(yú)內(nèi)臟β -葡萄糖苷酶的用量為40mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S2.中所述有機(jī)溶劑用量為15?20ml;所述緩沖溶液用量為f2ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，S2.中所述有機(jī)溶劑用量為20ml;所述緩沖溶液用量為2ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S2.中所述的有機(jī)溶劑為I，4-二氧六環(huán)；緩沖溶液為檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S2.中所述檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液的pH值為5.0?6.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，S2.中所述檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液的pH值為6.00
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S3.中所述的反應(yīng)溫度為70°C，反應(yīng)時(shí)間為48h。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK104404013SQ201410538493
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月14日
【發(fā)明者】張志山 申請(qǐng)人:莆田市匯龍海產(chǎn)有限公司