專利名稱：斷開分子間的非共價(jià)結(jié)合相互作用的手段和方法
斷開分子間的非共價(jià)結(jié)合相互作用的手段和方法本發(fā)明涉及結(jié)合分子的領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及斷開多聚蛋白質(zhì) 類分子的各成員之間非共價(jià)相互作用的手段和方法。非共價(jià)相互作用非常重要，特別是在生物學(xué)領(lǐng)域。非共價(jià)結(jié)合將DNA雙螺旋的兩條鏈保持在一起(氬鍵)，將多肽折疊成諸如a螺 旋和P構(gòu)象的二級結(jié)構(gòu)，使酶能夠結(jié)合其底物，使抗體能夠結(jié)合其 抗原，使轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合互相結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合DNA, 使蛋白質(zhì)(例如一些激素)能夠結(jié)合其受體，使諸如核糖體、肌動蛋白 纖絲、微管等等的大分子體系得以裝配。非共價(jià)力主要有三種，即離子相互作用、疏水相互作用和氫鍵。以蛋^灰*互#^7^辦的萄在任何特定pH下，蛋白質(zhì)都具有帶電荷基團(tuán)，它們可參與進(jìn)行 相互結(jié)合或結(jié)合到其它類型的分子。例如，天冬氨酸(Asp)和谷氨酸 (Glu)殘基上的帶負(fù)電荷的羧基被賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)殘基上的 帶正電荷的質(zhì)子化氨基吸引。離子相互作用對pH變化非常敏感。隨著pH的下降，H+會結(jié)合 天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)的羧基(COO-)而中和它們的負(fù)電荷，且 H+會結(jié)合賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)的氨基(NH2)氮原子上的未占用 電子對而賦予它們正電荷。結(jié)果是不僅分子上的凈電荷發(fā)生變化(分 子變得更加陽性)，而且分子的側(cè)鏈基團(tuán)或主鏈基團(tuán)所具有的與其它 分子和離子發(fā)生離子(靜電)相互作用的許多機(jī)會也被改變了 。隨著pH 的上升，H+從Asp和Glu的COOH基團(tuán)被除去而賦予它們負(fù)電荷 (COO-),且H+從Lys和Arg的NH3+基團(tuán)被除去而將它們的正電荷 除去。結(jié)果是分子上的凈電荷發(fā)生變化(分子變得更加陰性)，而且 分子的側(cè)鏈基團(tuán)或主鏈基團(tuán)所具有的與其它分子或離子發(fā)生靜電相 互作用的許多機(jī)會也被改變了 。離子相互作用也對鹽濃度敏感。鹽濃度增加會給帶電荷的殘基 提供竟?fàn)幮噪x子，從而減少離子結(jié)合的強(qiáng)度。以蛋冷I在K，^^辦的處^3^^氨基酸如苯丙氨酸和亮氨酸的側(cè)鏈(R基團(tuán))是非極性的，因此與極性分子如水的相互作用差。因此，球狀蛋白質(zhì)中的大多數(shù)非極性 殘基朝向分子的內(nèi)部，而諸如天冬氨酸和賴氨酸的極性基團(tuán)則在暴 露于溶劑的表面上。當(dāng)在兩種不同分子的表面處有非極性殘基暴露 時(shí)，從能量上來說更有利的是它們的兩個(gè)"油性"非極性表面緊密 靠在一起，而將它們之間的極性水分子排除掉。疏水相互作用的強(qiáng)度并不明顯受到pH變化和鹽濃度變化的影響。以蛋^^^J/，^^辨的產(chǎn)鍵只要強(qiáng)電負(fù)性原子(例如氧、氮)接近與另 一強(qiáng)電負(fù)性原子共價(jià)連 接的氫原子，就可形成氫鍵。一些普通實(shí)例是蛋白質(zhì)中各個(gè)分離肽鍵的-C二O基團(tuán)與H-N-基團(tuán)之間的氬鍵(產(chǎn)生a螺旋和|3構(gòu)型)；-C=0基團(tuán)與蛋白質(zhì)和糖類 中絲氨酸和蘇氨酸殘基的羥基(H-O-)及半胱氨酸的SH基團(tuán)之間的氫 鍵。非共價(jià)相互作用的特征是，它們單獨(dú)弱小，但集體強(qiáng)大。所有 三種形式的非共價(jià)相互作用單獨(dú)與共價(jià)鍵(鍵能為90-100 kcal/摩爾)相 比是弱的(鍵能為5 kcal/摩爾左右)。存在著中間鍵能(即15-70 kcal/摩 爾之間)的鍵類型。對于本發(fā)明，這種類型的鍵如果它們本身在一定 環(huán)境中不足以使兩個(gè)蛋白質(zhì)類分子發(fā)生締合，則認(rèn)為是非共價(jià)鍵。 換句話說，非共價(jià)鍵是需要其大量的相互作用一齊發(fā)揮才能將結(jié)構(gòu)
保持在一起的鍵。這些相互作用確實(shí)具有的有限強(qiáng)度要求相互作用 的基團(tuán)能夠緊密靠近在一起(一?；蚋木嚯x)。因此，包含兩個(gè)或更多個(gè)成員的多聚體在一方面如果其兩個(gè)或更多個(gè)成員通過至少3個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)各自鍵能小于90-100 kcal/ 摩爾的鍵連接的話，則可以說是通過非共價(jià)鍵保持在一起。典型的 連接兩條蛋白質(zhì)鏈的半胱氨酸二硫鍵其鍵能為約65 kcal/摩爾。但是， 這個(gè)鍵的強(qiáng)度非常依賴于還原/氧化環(huán)境。因此對于本發(fā)明來說，當(dāng) 將多聚體的兩個(gè)或更多個(gè)成員鏈連接在一起的鍵其各自的鍵能小于 65kcal/摩爾、通常小于20 kcal/摩爾時(shí)，則說該多聚體是通過非共價(jià) 鍵保持在一起的。通常每個(gè)所述鍵的結(jié)合能是5kcal/摩爾左右。因此， 多聚體中通過非共價(jià)鍵保持在一起的兩個(gè)或更多個(gè)成員具有的大量 非共價(jià)相互作用一齊發(fā)揮作用而將結(jié)構(gòu)保持在一起，且其具有的表 面狀況使得至少兩個(gè)相互作用的表面的大部分面積能夠相互緊密靠 近；也就是說，它們必須互相配合。本發(fā)明利用了這個(gè)特征為通過非共價(jià)相互作用的區(qū)域保持多 聚蛋白質(zhì)類分子中的結(jié)構(gòu)，需要許多弱鍵。在本發(fā)明中，通過切斷 至少一個(gè)多聚體成員中的至少一個(gè)共價(jià)鍵，多聚體中參與所迷非共 價(jià)相互作用的所述至少一個(gè)成員被斷開成至少兩個(gè)新成員。切割一 個(gè)共價(jià)鍵會產(chǎn)生出比原始多聚體多 一個(gè)成員的多聚體。切割兩個(gè)共 價(jià)鍵則產(chǎn)生出多了兩個(gè)成員的多聚體，依此類推。切割多聚體中的 至少一個(gè)共價(jià)鍵，會導(dǎo)致多聚體中每個(gè)成員的非共價(jià)相互作用數(shù)量 減少。在本發(fā)明中，該減少被用來使至少一個(gè)成員從多聚體上解離 下來。在本發(fā)明中，切割共價(jià)鍵用于減少多聚體中每個(gè)成員的非共 價(jià)鍵數(shù)量，使得非共價(jià)鍵不足以維持多聚體的完整性，或者切割共 價(jià)鍵用于改變其中發(fā)生該修飾的成員的構(gòu)象，從而使至少 一 個(gè)成員 從多聚體上釋放出來。釋放出至少一個(gè)成員后，余下的各成員可以是單體、多聚體或它們的組合。肽中共價(jià)鍵的切割可通過酶法、化 學(xué)法或物理法來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所用的共價(jià)鍵切割優(yōu)選為化學(xué)法或物
理法切割，即優(yōu)選為非酶法切割。更優(yōu)選的是通過化學(xué)法或光誘導(dǎo) 法來切割鍵。另外優(yōu)選的是切割肽骨架中的共價(jià)鍵。優(yōu)選切割的共 價(jià)鍵是位于肽鍵近鄰的鍵(因此是氮原子另 一側(cè)的鍵)。本文所用的術(shù)語多聚蛋白質(zhì)類分子指含有兩個(gè)或更多個(gè)通過非 共價(jià)相互作用區(qū)域互相締合的成員的蛋白質(zhì)類分子。至少有兩個(gè)成 員只通過非共價(jià)相互作用而不是通過共價(jià)相互作用互相連接。多聚 蛋白質(zhì)類分子和多聚蛋白質(zhì)這兩個(gè)術(shù)語在本文描述中可互換使用。 本發(fā)明的多聚蛋白質(zhì)類分子通常含有至少一個(gè)多肽。術(shù)語非共價(jià)相互作用區(qū)域指兩個(gè)或更多個(gè)成員通過至少3個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)非共價(jià)鍵發(fā)生締合和相互作用的區(qū)域。該非共價(jià)相互作用區(qū)域優(yōu)選不包含將所述兩個(gè)或更多個(gè)成員互相連接在一起的共 價(jià)鍵。明確知道的是，并非所有的原子都參與所述區(qū)域中的非共價(jià) 相互作用。同樣，如果該區(qū)域是兩條(多)肽發(fā)生締合的區(qū)域，并不要 求所有的氨基酸都參與該區(qū)域中的非共價(jià)相互作用。單體在本文中用以指當(dāng)所有的非共價(jià)鍵都被斷開時(shí)其中的結(jié)構(gòu) 單元仍共價(jià)締合在一起的分子。多聚體中的超過一個(gè)的單體可以相 同或相互不同。成員這個(gè)術(shù)語在本文中用以指與其另 一成員非共價(jià)連接的多聚體實(shí)體(entity)。這兩個(gè)成員不通過共價(jià)鍵來連接。成員優(yōu)選是但不一 定是蛋白質(zhì)類分子。成員通常是但不一定是多肽。本發(fā)明的多聚蛋 白質(zhì)類分子優(yōu)選是多聚蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多聚蛋白質(zhì)優(yōu)選包含有包 含肽的笫一成員和包含(多)肽和/或蛋白質(zhì)的至少第二成員。所述肽優(yōu) 選包含所述條"f牛反應(yīng)寸生基團(tuán)(conditionally reactive group)。蛋白質(zhì)類分子包含至少兩個(gè)通過肽鍵互相連接在一起的氨基 酸。它通常含有至少8個(gè)通過肽鍵互相連接在一起的氨基酸或其功 能等同物。在本發(fā)明中，多肽含有至少50個(gè)通過肽鍵互相連接在一起的氨 基酸或其功能等同物。多肽在其非折疊狀態(tài)通常是線性分子，但也可是(部分)圓形的。肽通常含有至少4-49個(gè)通過肽鍵互相連接在一 起的氨基酸。優(yōu)選地，肽含有3-49個(gè)氨基酸，優(yōu)選3-30個(gè)，更優(yōu)選 3-20個(gè)氨基酸。本發(fā)明所用的(多)肽可包含任何氨基酸或氨基酸鏈。 氨基酸可以是天然或合成氨基酸，例如a、 (3或Y或更高的(co)氨基酸， 即氨基和羧酸之間間隔1、 2、 3或更多個(gè)碳。氨基酸(鏈)可以是天然 氨基酸(鏈)或合成氨基酸(鏈)或它們的組合。肽是天然肽或合成肽或 它們的組合。同樣，肽在其非折疊狀態(tài)通常是線性的，但也可以是(部 分)圓形的。肽通常不具有顯著的三級結(jié)構(gòu)。它通常適應(yīng)多種三級結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所用的肽通常容易溶解于各種溶劑中。這種溶劑例如是 生理溶液如生理氯化鈉溶液。作為MHC-分子的配體的抗原肽通常具 有8-25個(gè)通過肽鍵連接的氨基酸。(多)肽可被修飾或不被修飾。典 型的修飾包括由細(xì)胞機(jī)制(cellular machinery)如聚糖添加和磷酸化產(chǎn) 生的修飾。但是，其它類型的修飾也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。氨基酸的功能等同物是能取代氨基酸鏈中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸 的分子。功能等同物優(yōu)選能夠在兩個(gè)單獨(dú)的位置與氨基酸成鍵，以 至于它能構(gòu)成(多)肽或模擬肽鏈的內(nèi)在部分。功能等同物并不必須具 有天然對等物。這種功能等同物可摻入到本發(fā)明的肽或多肽中。在本發(fā)明的一個(gè)方面，被切割的共價(jià)鍵優(yōu)選是連接一個(gè)成員鏈 中的兩個(gè)氨基酸或其衍生物/類似物的骨架鍵。共價(jià)鍵的切割優(yōu)選通 過將條件反應(yīng)性基團(tuán)摻入到其中需要斷開至少一個(gè)共價(jià)鍵的成員(優(yōu) 選肽成員)中來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，術(shù)語條件反應(yīng)性基團(tuán)用以指被摻 入到所述成員中的反應(yīng)性基團(tuán)。術(shù)語"條件性"用以表示反應(yīng)性基 團(tuán)能有條件地被活化，即響應(yīng)信號或觸發(fā)物而被活化。條件反應(yīng)性 基團(tuán)的數(shù)量可隨意變化。條件反應(yīng)性基團(tuán)也可例如通過將其摻入到 新生(多)肽鏈中而放置在該成員的精確位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，放 置所述一個(gè)或多個(gè)條件反應(yīng)性基團(tuán)，使得共價(jià)鍵在該成員與多聚體 中至少一個(gè)其它成員的非共價(jià)相互作用區(qū)域被斷開。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，放置所述一個(gè)或多個(gè)條件反應(yīng)性基團(tuán)，使得該配體(例如成
員)的優(yōu)選構(gòu)象被改變，以至于與多聚體的其它成員相互作用的親和 力減少。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少兩個(gè)通過非共價(jià)相互作用區(qū) 域互相結(jié)合的成員的多聚蛋白質(zhì)類分子，其中至少一個(gè)所述至少兩 個(gè)成員包含條件反應(yīng)性基團(tuán)，該基團(tuán)當(dāng)被活化時(shí)能切割所述成員當(dāng) 中的共價(jià)鍵，從而將所述成員切割成至少兩個(gè)更小的成員，而這又 會減少所述區(qū)域中的非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度。某成員中的共價(jià)鍵的 切割會導(dǎo)致所產(chǎn)生的鏈的折疊自由度更大，從而減少多聚體中所述 一個(gè)或多個(gè)所產(chǎn)生的鏈具有的任何非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述成員在所述非共價(jià)相互作用區(qū)域當(dāng)中被切 割。這會導(dǎo)致所述區(qū)域中的非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度下降得最多。被 所述條件反應(yīng)性基團(tuán)切割的鍵可通過將該反應(yīng)性基團(tuán)適當(dāng)安置在肽 鏈中來選擇。所述成員的切割導(dǎo)致產(chǎn)生尺寸更小的肽鏈。優(yōu)選最長的所述所產(chǎn)生的肽比所述成員短至少20%，優(yōu)選短至少30%。本發(fā)明還提供包含至少兩個(gè)通過非共價(jià)相互作用區(qū)域互相結(jié)合 的成員的多聚蛋白質(zhì)類分子(多聚體)，其中至少一個(gè)所述至少兩個(gè)成 員包含具有條件反應(yīng)性基團(tuán)的(多)肽鏈，且其中當(dāng)所述反應(yīng)性基團(tuán)被 活化時(shí)，所述成員當(dāng)中的共價(jià)鍵被斷開，導(dǎo)致所述(多)肽被切割成至 少兩個(gè)更小的(多)肽，從而減少所述非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述條件反應(yīng)性基團(tuán)包含光敏感基 團(tuán)或高碘酸鹽敏感基團(tuán)。在這些實(shí)施方案中，將反應(yīng)性基團(tuán)活化的 條件性步驟是存在著或不存在確定波長范圍內(nèi)的光線，或者是高碘酸鹽敏感基團(tuán)暴露于高碘酸鹽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述光 敏感反應(yīng)性基團(tuán)是紫外光敏感基團(tuán)。條件反應(yīng)性基團(tuán)優(yōu)選被摻入到(多) 肽中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述紫外光敏感基團(tuán)包含3-氨基-3-(2-石肖基苯基)丙酉吏(Carlos J. Bosques禾口 Barbara Imperiali. Journal of the American chemical society 2003第125巻第7530-7531頁)。該氨 基酸可從Alpha Aesar市售獲得(要用Fmoc保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)，以與固
相肽合成相容)，或者是鄰硝基苯基甘氨酸(Alvie L. Davis, David R.Smith和Tommy J. Mc Cord. Synthesis and microbiological properties of3-amino-l勿droxy-2-indolinone and related compounds. Journal of Medicinal Chemistry 1973,笫16巻第1043-1045頁)，或者是這種分子的功能等同物。3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸的功能等同物是3-氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸。鄰硝基苯基甘氨酸的功能等同物是對硝基苯基甘氨酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽敏感基團(tuán)包含1,2-二羥基部分或其功能等同物。存在著與高碘酸鹽和1,2-二羥基體系等 同的替代體系。這種體系是l-氨基-2-羥基體系和含有高碘酸鹽可切 割位點(diǎn)的多元醇、碳水化合物、糖-氨基酸雜合物。二羥基乙烯肽電 子等排物描述于Suvit Thaisrivongs， Alfredo G. Tomasselli, Joseph B. Moon， John Hui, Thomas J. McQuade, Steve R. Turner, Joseph W. Strohbach, W. Jeffrey Howe, W. Gary Tarpley, Robert L. Heinrikson. Inhibitors of the protease from human immunodeficiency virus: design and modelling of a compound containing a dihydroxyethylene isostere insert with high binding affinity and effective antiviral activity沐自人免疫缺陷病毒的蛋白酶的抑制劑具高度結(jié)合親和力和有效抗病毒活 性的含有二鞋基乙烯電子等排物插入片斷的化合物的設(shè)計(jì)和建模). Journal of Medicinal Chemistry 1991，第34巻第2344-2356頁；SuvitThaisrivongs, Steve R. Turner, Joseph W. Strohbach, Ruth E. TenBrink, W. Gary Tarpley, Thomas J.McQuade, Robert L. Heinrikson, Alfredo G. Tomasselli， Joseph B. Moon, John O Hui, W. Jeffrey Howe. Inhibitors of the protease from human immunodeficiency vims: synthesis, enzyme inhibition, and antiviral activity of a series of compounds containing the dihydroxyethylene transition-state isostere (來自人免疫擊夬陷病毒的蛋白酶的抑制劑含有二羥基乙烯過渡態(tài)電子等排物的一 系列化合物的 合成、酶抑制和抗病毒活性).Journal of Medicinal Chemistry 1993,笫 36巻第941-952頁；和Iwao Ojima， Hong Wang, Tao Wang and EdwardW. Ng. New approaches to the asymmetric synthesis of dipeptide isosteres via beta-lactam synthon method (通過|3內(nèi)酖胺合成子方法不對稱合成 二肽電子等排物的新方法)，Tetrahedron Letters 1998,第39巻第923-926頁。另一種高碘酸鹽敏感化合物4-氨基-4-脫氧-L-蘇糖酸(含二醇 的氨基酸結(jié)構(gòu)單元)的合成描述于James A.Musich和Henry Rapoport. Synthesis of Anthopleurine, the alarm pheromone from anthopleura elegantissim, Journal of the American Chemical Society 1978,笫100巻 第4865-4872頁。該技術(shù)可用于與蛋白質(zhì)性質(zhì)的配體(多聚體)發(fā)生相互作用的許多 不同的蛋白質(zhì)類分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多聚蛋 白質(zhì)包含至少兩個(gè)成員，其中第一成員包含有包含所迷條件反應(yīng)性 基團(tuán)的肽，且其中第二成員包含有多肽，其中所述第一和所述第二 成員通過非共價(jià)相互作用區(qū)域互相結(jié)合。優(yōu)選地，所迷多聚蛋白質(zhì) 是肽結(jié)合蛋白質(zhì)，優(yōu)選肽遞呈蛋白質(zhì)(peptide presenting pmtein)和結(jié) 合肽。這種肽結(jié)合蛋白質(zhì)的優(yōu)選實(shí)例是具有SH2^SHL結(jié)構(gòu)域的蛋白 質(zhì)、伴侶蛋白和主要組織相容性復(fù)合體分子。優(yōu)選的伴侶蛋白是熱 激蛋白。這些熱激蛋白的實(shí)例是HSP70、 gp96、 gpl00和鈣網(wǎng)蛋白。載有抗原(肽)的熱激蛋白例如用于特異性刺激免疫系統(tǒng)。該特異性刺 激有助于抗擊多種不同疾病，例如由乳頭瘤病毒或癌癥引起的各種 疾病(參見例如Parmiani等，2004)。優(yōu)選的多聚體是主要組織相容性 復(fù)合體(MHC)分子或其功能部分、衍生物和/或類似物。MHC能被T 細(xì)胞識別。T細(xì)胞在人免疫系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用，已開發(fā)出多種策略 來增強(qiáng)該天然防御系統(tǒng)，增加對病原體或惡性腫瘤的免疫。T細(xì)胞能 識別已結(jié)合特異性配體的MHC分子，故用以產(chǎn)生已結(jié)合特異性配體 的MHC分子的方法具有重大lt值。另外，MHC分子也能被一系列 的其它受體所識別，這為產(chǎn)生配體結(jié)合的MHC分子提供了另外的理 論基礎(chǔ)。此外，有關(guān)能結(jié)合MHC分子的疾病相關(guān)配體的確定對于診 斷目的和治療目的來說都具有價(jià)值。 配體-MHC復(fù)合物的一個(gè)重要用途由以下事實(shí)得到說明配體 占據(jù)的MHC分子的復(fù)合物在醫(yī)療領(lǐng)域中是非常有價(jià)值的工具，用于 鑒定和定量特異性T細(xì)胞群體及評估涉及疾病進(jìn)展的有效細(xì)胞免疫 是否已建立。MHC復(fù)合物非常大的潛在用途在于對臨床試驗(yàn)和獲準(zhǔn) 的治療干預(yù)的免疫監(jiān)測。另外，MHC復(fù)合物可應(yīng)用于分離針對病原 體或惡性腫瘤進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的特異性人T細(xì)胞，或者應(yīng)用于從 骨髓移植物除去不需要的T細(xì)胞。此外，MHC復(fù)合物還可用于選擇 性除去T細(xì)胞介導(dǎo)疾病中不需要的特異性T細(xì)胞群體。占據(jù)有確定配體的MHC分子有效應(yīng)用的一個(gè)主要障礙是目前的 生產(chǎn)方法效率低下。MHC分子特別是I類MHC分子當(dāng)沒有結(jié)合抗 原時(shí)其穩(wěn)定性低。因此，MHC分子主要是在生產(chǎn)過程中配體結(jié)合的 過程中產(chǎn)生的。已運(yùn)用過將該結(jié)合配體換成替代性配體，但這個(gè)過 程效率低下，因?yàn)樵跍睾蜅l件下(即接近中性pH和生理鹽濃度)配體 解離慢。結(jié)合配體的解離可通過將MHC分子暴露于更為苛刻的條件 (例如酸性或堿性pH)來促進(jìn)，但這也會導(dǎo)致MHC分子的去穩(wěn)定化。 因此，現(xiàn)在最廣為接受的產(chǎn)生重組MHC分子的技術(shù)是為每種單一配 體單獨(dú)產(chǎn)生一批配體占據(jù)的MHC分子。這導(dǎo)致生產(chǎn)過程非常費(fèi)時(shí)和 昂貴，產(chǎn)生的是只對一個(gè)應(yīng)用有特異性的小批量。Bakker AH— Schumacher TN. MHC multimer technology: current status and future prospects. Curr Opin Immunol. 2005年8月；17(4):428-33綜述。MHC分子可分成兩類I類和II類MHC分子。這兩種類型的 MHC分子都能結(jié)合肽并將其呈遞給T細(xì)胞。視MHC分子而定，負(fù) 責(zé)結(jié)合肽的結(jié)構(gòu)域具有不同的名稱。通常需要兩個(gè)結(jié)構(gòu)域來特異性 地結(jié)合肽，例子是I類MHC分子的al和a2結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域被 認(rèn)為是MHC分子的功能部分。因此功能部分通常含有MHC分子中 參與肽結(jié)合的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。天然MHC分子通常含有幾個(gè)其它的不直 接參與肽結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域通常具有其它功能。例如，存 在著跨膜結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。另外，這種結(jié)構(gòu)域可在肽結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的折疊構(gòu)象的形成中起作用。其它結(jié)構(gòu)域如肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是 胞外的。所有這些其它結(jié)構(gòu)域共有一個(gè)特征。它們不直接參與肽結(jié)合。因此對于本發(fā)明，它們可存在于或不存在于MHC分子的某一部 分中，只要所述部分包含至少兩個(gè)參與MHC分子中的肽結(jié)合的結(jié)構(gòu) 域。優(yōu)選地，所述MHC分子是可溶性MHC分子，優(yōu)選如Garboczi DN， Hung DT, Wiley DC. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc Natl Acad Sci USA. 1992年4月， 15;89(8):3429-33中所述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MHC分子是MHC復(fù)合物分子。 MHC分子的功能衍生物是這樣的分子，它不是從自然界衍生， 不過與MHC分子在性質(zhì)上但并不一定在數(shù)量上共有至少某種肽結(jié)合 特性。例如，與天然MHC分子有一個(gè)或多個(gè)氨基酸差異但保持了肽 結(jié)合功能的修飾MHC分子，在本發(fā)明情形中是功能衍生物。類似地， 包含來自兩個(gè)或更多個(gè)MHC分子的(部分)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域且能夠結(jié)合 肽的分子也被認(rèn)為是功能衍生物。通常能容忍的修飾是不在肽結(jié)合 結(jié)構(gòu)域的修飾。其它能容忍的突變或修飾在MHC分子的肽結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的可變結(jié)構(gòu)域中。這種修飾通常會改變MHC分子的結(jié)合特異性(即 哪種肽被結(jié)合)。這種修飾因此也被認(rèn)為是本發(fā)明的MHC分子的功 能衍生物。有幾種分子共有MHC分子的肽結(jié)合特性，但已進(jìn)化成在細(xì)胞中 充當(dāng)另外的用途。這種分子被認(rèn)為是本發(fā)明的MHC分子的功能類似 物。參與多肽結(jié)合的結(jié)構(gòu)域可與來自MHC分子的這種結(jié)構(gòu)域結(jié)合。 MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類似物還可含有通常不與MHC 分子有關(guān)的其它部分。這種其它部分可例如包括標(biāo)簽、標(biāo)記物、締 合和/或多聚化結(jié)構(gòu)域和其它元件。本發(fā)明的技術(shù)能用來特異性地使結(jié)合MHC分子或其功能部分、 衍生物和/或類似物的配體去穩(wěn)定化。MHC結(jié)合配體的去穩(wěn)定化然后
會導(dǎo)致產(chǎn)生無配體的MHC分子而不用暴露于苛刻條件。所產(chǎn)生的無 配體MHC分子然后可以無配體形式使用，或者可加載一個(gè)或多個(gè)選 擇的配體。因此在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，MHC分子或其功能部分、衍生 物和/或類似物在其肽結(jié)合溝中包含肽抗原(也稱配體)?？蒳f導(dǎo)的攻擊 基團(tuán)或條件反應(yīng)性基團(tuán)優(yōu)選存在于肽抗原中，因?yàn)檫@樣能保證肽抗 原從在其它方面不被修飾的MHC分子或其功能部分、衍生物和/或 類似物釋放出來。所產(chǎn)生的無配體MHC分子然后可直接使用，或者 可加載一個(gè)或多個(gè)其它配體。為此，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的多 聚蛋白質(zhì)的組合物。這種組合物可提供待加載到MHC分子上的配 體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子或其 功能部分、衍生物和/或類似物，其中至少一個(gè)所述成員是在所述分 子的肽結(jié)合溝中的肽抗原，且其中所述肽抗原包含所述可誘導(dǎo)可切 割基團(tuán)或條件反應(yīng)性基團(tuán)。組合物還可包含另外的肽。在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，所述另外的肽是能夠在所述MHC分子的肽結(jié)合溝結(jié) 合的抗原肽，即所述MHC分子的配體。肽的攻擊基團(tuán)可被誘導(dǎo)，從 而導(dǎo)致從多聚體釋放出肽片斷。如果組合物中還存在該另外的肽， 該肽此時(shí)可代替離去的片斷。所產(chǎn)生的MHC分子或其功能部分、衍 生物和/或類似物由此加載上該另外的肽。因此組合物含有新加載的 MHC分子(或其功能部分、衍生物和/或類似物)和離去肽的片斷。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生MHC分子或其功能部分、衍生 物和/或類似物或者包含另外的肽的MHC分子復(fù)合物的方法，所述 方法包括產(chǎn)生包含具有可誘導(dǎo)可切割基團(tuán)或條件反應(yīng)性基團(tuán)的臨時(shí) 肽的MHC分子，所述基團(tuán)當(dāng)被活化時(shí)會將所述臨時(shí)肽切割成至少兩 個(gè)顯示出對所述MHC分子的結(jié)合親和力減少的更小肽。所述臨時(shí)肽 優(yōu)選存在于所述MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類似物的肽 結(jié)合溝中。所述方法優(yōu)選還包括使所述可切割基團(tuán)或條件反應(yīng)性基 團(tuán)活化。由于活化，臨時(shí)肽或離去肽被切成更小的肽(或氨基酸)，從 而減少非共價(jià)相互作用區(qū)域中的非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度。這使得離去肽(或其片斷)容易從MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類似物 中除去。除去操作并不要求苛刻的條件，因此不會或只最低程度地 干擾分子的活性?？蓪⑺璧碾奶峁┙o游離的MHC分子。使用本發(fā) 明的方法，可以產(chǎn)生出大量的具有離去肽的MHC分子。該制品隨后子。這僅需要對可切割基團(tuán)進(jìn)行活化(誘導(dǎo))，其切割離去肽以便與所 需的抗原肽交換?？汕懈罨鶊F(tuán)或條件反應(yīng)性基團(tuán)的誘導(dǎo)、離去肽片 段的解離和所需肽與MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類似物 的締合可在一個(gè)步驟中進(jìn)行。因此本發(fā)明還提供這樣的本發(fā)明方法， 其進(jìn)一步包括將所述MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類似物 與所述所需的肽在能有效地將被切割的臨時(shí)肽從所述MHC分子中除 去的條件下進(jìn)行溫育。還提供了這樣的本發(fā)明方法，其進(jìn)一步包括 檢測所述所需的肽與所述MHC分子的結(jié)合情況。這個(gè)方面例如可用 于診斷目的。結(jié)合情況可用各種方式來檢測，例如通過對在所述MHC 分子的背景中呈遞的所述肽具有特異性的T細(xì)胞受體或抗體來檢測。 結(jié)合情況優(yōu)選通過檢測與所述肽有關(guān)的標(biāo)記物來檢測。這可通過將 所述肽標(biāo)記上隨后可通過例如標(biāo)記鏈霉親和素或其類似物顯示的特 異性結(jié)合分子如生物素來進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽 包含所述標(biāo)記物。這樣，任何與所述MHC分子結(jié)合的肽都可直接檢 測。對結(jié)合情況的檢測優(yōu)選出于篩選目的來進(jìn)行，優(yōu)選在高通量環(huán) 境中進(jìn)行。優(yōu)選的篩選目的是篩選能影響所述肽與所述MHC分子的 結(jié)合的化合物。例如，試驗(yàn)肽或者小分子能竟?fàn)幩鲭呐c所述MHC 分子的結(jié)合。竟?fàn)幥闆r可通過檢測所述肽結(jié)合的減少來檢測出。檢進(jìn)行測量。這樣就可減少對其中進(jìn)行所述結(jié)合的樣品的操縱。樣品 操縱的減少是高通量環(huán)境所需的特性。檢須'J所述肽的結(jié)合的其它優(yōu) 選方法是監(jiān)測放射性或者監(jiān)測MHC構(gòu)象依賴性結(jié)合體(binding body),優(yōu)選抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的結(jié)合情況。其胞受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，測量對所述肽與所述MHC分子 的結(jié)合的抑制情況或增強(qiáng)情況。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方 法用來測定在試驗(yàn)或參考化合物存在下所述所需的肽的結(jié)合情況。明提供包含本發(fā)明的MHC分子的組合物，其中所迷組合物含有包含 肽或其衍生物(包含條件反應(yīng)性基團(tuán))的MHC分子復(fù)合物和包含另外 的肽的MHC分子復(fù)合物。本發(fā)明的多聚體可進(jìn)一步摻入到更大的結(jié) 構(gòu)中，這些結(jié)構(gòu)另外稱為MHC多聚體的復(fù)合物或者稱為MHC四聚 體，以與本發(fā)明的多聚體相區(qū)別。這種復(fù)合物比單個(gè)MHC多聚體對 攜帶T細(xì)胞受體的顆粒和細(xì)胞具有更高的親和力。這種復(fù)合物因此 是T細(xì)胞群體的分析中的重要工具。本發(fā)明因此進(jìn)一步提供包含至 少兩個(gè)本發(fā)明多聚體或者至少兩個(gè)本發(fā)明MHC分子或其功能部分、 衍生物和/或類似物或者這兩者組合的復(fù)合物。用以產(chǎn)生含有兩個(gè)、 三個(gè)、四個(gè)和五個(gè)MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類似物的 復(fù)合物的手段和方法是本領(lǐng)域可獲得的。因此本發(fā)明進(jìn)一步提供包 含兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)和五個(gè)MHC分子或其功能部分、衍生物和/或 類似物的復(fù)合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述復(fù)合物包含具有 相同T細(xì)胞受體特異性的MHC分子。但是不必總是如此。鑒于用本 發(fā)明方法可相對容易地給MHC分子提供不同的肽，包含兩種或更多 種T細(xì)胞受體特異性的復(fù)合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步提 供包含至少兩種本發(fā)明多聚體、本發(fā)明組合物或本發(fā)明MHC分子或 其功能部分、衍生物和/或類似物的固體表面。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案中，為所述固體表面提供本發(fā)明的復(fù)合物，優(yōu)選包含與相同疾病 或病原體有關(guān)的單個(gè)肽或多個(gè)肽的復(fù)合物。固體表面可以是珠粒。固體表面可以是玻璃或金屬表面。表面在涂敷本發(fā)明的多聚體、組 合物或復(fù)合物前可進(jìn)行過預(yù)處理。這種預(yù)處理可包括但不限于Soen
等(PLoS biology; 20(B:笫1巻第429-438頁)所描述的聚丙烯酰皿 膜。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明的多聚體、組合物或復(fù)合物的孩史 陣列。用以產(chǎn)生包含偶聯(lián)到抗原肽的MHC分子復(fù)合物的(孩么)陣列的 手段和方法由以上提到的Soen等描迷。技術(shù)人員可參考上述文獻(xiàn)獲 得有關(guān)產(chǎn)生本發(fā)明的(孩i)陣列的指導(dǎo)。本發(fā)明意外地在H5N1流感毒^朱發(fā)現(xiàn)新的流感A核蛋白T細(xì)胞 表位。有趣的是，該新表位的免疫原性比H5N1毒抹和許多其它流感 A毒抹中所見的經(jīng)典表位要大得多。此外，該新表位為前幾年的各 IBN1毒抹所共有，但與較老的流感A毒抹不同，這使得它成為比經(jīng) 典表位更適合于目前和將來的診斷和治療目的的表位。本發(fā)明提供 包含所述H5N1表位序列的肽。本發(fā)明因此提供包含氨基酸序列 AMDSNTLEL的分離和/或合成肽。此外，本發(fā)明提供包含氨基酸序 列AMDSNTLEL的分離和/或合成肽在疫苗中的用途。還提供包含氨 基酸序列AMDSNTLEL的分離和/或合成肽用于制備抗流感疫苗的用 途。本發(fā)明的肽例如在包含所述肽和免疫增強(qiáng)劑的疫苗中呈遞給個(gè) 體的免疫系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使個(gè)體免疫以抵抗 流感的方法，所述方法包括給所述個(gè)體提供包含氨基酸序列 AMDSNTLEL的分離和/或合成肽和任選的免疫增強(qiáng)劑和/或合適的添 加劑。本文所用的"使個(gè)體免疫"是指個(gè)體發(fā)展出抵抗所述肽的免 疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供含有包含氨基酸序列AMDSNTLEL的肽的融 合蛋白。本發(fā)明還提供編碼所述AMDSNTLEL肽或所迷融合蛋白的 核酸。本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中提供含有包含氨基酸序列 AMDSNTLEL的分離和/或合成肽的本發(fā)明MHC分子。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述本發(fā)明MHC分子用于檢測表位特異性T細(xì)胞。 所述流感優(yōu)選是H5N1。待診斷的流感病毒優(yōu)選是流感病毒的現(xiàn)行變 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的MHC分子用于制備流 感診斷用組合物的用途。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供診斷個(gè) 體中的流感的方法，所述方法包括給所述個(gè)體的血液樣品提供本發(fā)明的MHC分子，并分析所述MHC分子與所述血液樣品中細(xì)胞的結(jié) 合。所述血液樣品中的所述細(xì)胞優(yōu)選是T細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，診斷個(gè)體中的流感的方法還包括檢測T細(xì)胞反應(yīng)。實(shí)施例方法MHC多聚體和MHC多聚體的復(fù)合物(MHC四聚體)的產(chǎn)生 I類MHC復(fù)合物(MHC多聚體)按先前的描迷制備，略有改動(l)。 HLA-A2.1-肽多聚體用以下三種肽產(chǎn)生流感A基質(zhì)蛋白58-66 (序 列GILGFVFTL)及兩種流感A基質(zhì)蛋白58-66變體GIL*FVFTL和 GILGFVF*L,其中*為3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸。隨后將I類固C-肽多聚體純化，用BirA生物素化，純化并在16。/。甘油中-20。C下保 藏。紫外線誘導(dǎo)的肽釋放和肽交換將含有野生型流感A基質(zhì)蛋白58-66表位或者此表位的G4+或 丁8*變體的MHC多聚體或在指明情況下MHC多聚體的四聚復(fù)合物， 在20mM Tris-HCl, pH7.0/150mM NaCl/ 0.5mM 二硫蘇糖醇(DTT) 中，在I類MHC結(jié)合肽存在或者不存在下，暴露于紫外光(CAMAG, 366nm) 1小時(shí)。隨后，將復(fù)合物暴露于37°C 15-45分鐘，以誘導(dǎo)無 肽的I類MHC復(fù)合物的解離(2)。然后將樣品進(jìn)行凝膠過濾色譜分析 以測定MHC解離情況，或者與藻紅素標(biāo)記的鏈霉親和素溫育以產(chǎn)生 MHC多聚體的四聚復(fù)合物(MHC四聚體)。將MHC四聚體進(jìn)行凝膠 過濾色譜純化，在16。/。甘油中-20。C下保藏備用。MHC四聚體染色將解凍的外周血單核細(xì)胞(PBMC)樣品和CTL克隆與PE標(biāo)記的 MHC四聚體在37°C下溫育5分鐘，加入FITC標(biāo)記的抗CD8抗體， 繼續(xù)在室溫下溫育"分鐘。細(xì)胞在進(jìn)行FACS分析前，先用碘化丙 錠染色，以便能夠排除(gate out)死細(xì)胞。用FACScalibur和CellQuest 軟件(Becton Dickinson)對樣品進(jìn)行流式細(xì)月包術(shù)分析。用前向散射和側(cè) 向散射參數(shù)定義淋巴細(xì)胞群體。結(jié)果可任意解離的肽-MHC多聚體的形成為試驗(yàn)產(chǎn)生其結(jié)合肽可隨意釋放的MHC多聚體的可行性，我們 用野生型流感A基質(zhì)蛋白58-66表位或者其中氨基酸4或8被紫外 線敏感|3氨基酸3 (圖l)取代的兩種此表位變體來產(chǎn)生HLA-A2.1多 聚體。對于所有三種肽，I類MHC多聚體形成都有效，將所形成的 多聚體進(jìn)行凝膠過濾色譜純化。為評估所產(chǎn)生的肽-MHC多聚體是否 會被誘導(dǎo)解離，將三種類型的多聚體暴露于紫外線，在37°C下溫育 以誘導(dǎo)剩余的無肽I類MHC分子的解離，然后通過凝膠過濾色傳進(jìn) 行分析。含有親本流感A表位的肽-MHC多聚體對紫外線暴露完全 不敏感(圖2A上小圖)，而含有G^表位(數(shù)據(jù)未顯示)或丁8*表位(圖 2A下小圖)的I類MHC多聚體的暴露則導(dǎo)致所回收的MHC復(fù)合物 數(shù)量大大減少。此外，剩余的材料極有可能至少部分由游離的I類 MHC重鏈而不是肽-I類MHC多聚體組成，該點(diǎn)由剩余材料的洗脫 時(shí)間略大于原料的事實(shí)所暗示。添加HLA A2.1結(jié)合肽對I類MHC解離的保護(hù) 為評估I類MHC結(jié)合配體的添加是否能保護(hù)紫外線敏感MHC 復(fù)合物在暴露于紫外線時(shí)免于解離，在兩種不同HLA A2.1-結(jié)合肽 (HY 311-319; MART I 26-35 (A2L突變體)之一或HLA A3-結(jié)合肽 GP100 (614-622)存在下，進(jìn)行相同的反應(yīng)。含有親本流感A表位的I 類MHC分子不管是否暴露于紫外線，將任何三種肽添加到這種多聚 體都不影響其回收，這符合此親本MHC多聚體在兩種條件下都穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未顯示)的見解。重要的是，雖然添加預(yù)期不會與HLA-A2.1發(fā) 生相互作用的HLA A3-結(jié)合肽并不導(dǎo)致含紫外線敏感G^肽(未顯示) 或丁8*舦(圖2B)的MHC多聚體的回收率極大提高，但添加HLA A2.1 結(jié)合肽卻導(dǎo)致回收率大大增加(圖2B)。這些數(shù)據(jù)符合以下見解，即 含G4+或G8"々MHC多聚體暴露于紫外線時(shí)所產(chǎn)生的無肽MHC分 子能有效地結(jié)合已知的HLA-A2.1配體，卻不能結(jié)合對照肽。從紫外線敏感MHC多聚體產(chǎn)生的MHC多聚體功能四聚復(fù)合物 為直接確定已通過添加HLA-A2.1配體保護(hù)的紫外線敏感I類 MHC多聚體是否已結(jié)合這些配體，將在MART I 26-35 (A2L突變體)、 流感A基質(zhì)蛋白58-66、 HY (SMCY) 311-319或CMV pp65 495-503 肽存在下產(chǎn)生的MHC多聚體進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)化成MHC多聚體的四聚 復(fù)合物。所產(chǎn)生的MHC四聚體隨后用來染色來自供體的MART 1特 異性T細(xì)胞克隆(圖3)或外周血單核細(xì)胞，其具有CMV pp65 495-503 和流感A基質(zhì)蛋白58-66特異性CD8+ T細(xì)胞(圖4)。在所有試驗(yàn)的 情況中，與常規(guī)MHC四聚體相比在肽交換后產(chǎn)生的MHC四聚體結(jié) 合抗原特異性T細(xì)胞的靈敏度和特異性相等。這些實(shí)驗(yàn)提供了正式 的證據(jù)，證明通過肽交換產(chǎn)生的MHC多聚體與常規(guī)的肽-MHC多聚 體在結(jié)構(gòu)上不能區(qū)別，能被用來探測pMHC-TCR相互作用(在該情況 下是在寡聚化之后)。從紫外線敏感MHC四聚體產(chǎn)生的功能MHC四聚體為確定肽交換是否也能在I類MHC多聚體的紫外線敏感四聚復(fù) 合物上進(jìn)行,將含了8*的MHC多聚體轉(zhuǎn)化成四聚復(fù)合物，隨后在CMV pp65 495-503、 MART I 26-35 (A2L突變體)或HY (SMCY) 311-319肽 存在下暴露于紫外線。所產(chǎn)生的四聚MHC復(fù)合物隨后不經(jīng)進(jìn)一步純 化即用來染色CMV陽性供體的外周血單核細(xì)胞。引人注目的是，通 過將含TW的MHC四聚體在CMV pp65 495_503表位存在下進(jìn)行紫
外線暴露所產(chǎn)生的MHC四聚體，能以與常規(guī)的CMV pp65 495-503 特異性MHC四聚體相等的頻率和類似的強(qiáng)度檢測CMV特異性T細(xì) 胞(圖5)。該結(jié)合的特異性得到了以下事實(shí)的有力支持在平行反應(yīng) 中用MART I 26-35 (A2L突變體)或HY (SMCY) 311-319肽制備的 MHC四聚體并不顯示出與此供體的CD8+淋巴細(xì)胞有可測量的結(jié) 合。MHC交換技術(shù)的其它方面用紫外線交換技術(shù)來產(chǎn)生對攜帶標(biāo)記物的配體的結(jié)合有接受力 的MHC分子。MHC交換反應(yīng)在已用四曱基羅丹明染料標(biāo)記的肽配 體存在下進(jìn)行。如圖6所示，隨后對這些反應(yīng)進(jìn)行的分析揭示，此 技術(shù)可用來使標(biāo)記配體(在這個(gè)情況下是熒光肽)的結(jié)合得以發(fā)生。因 此，MHC交換技術(shù)也可用來篩選能增強(qiáng)或干擾這種結(jié)合的化合物(例 如肽和其它小分子)。圖7概述了這種篩選的原理，在這里用菱光各 向異性作為例子。對已知的MHC結(jié)合肽的修飾使得可以產(chǎn)生對化學(xué)切割敏感的配 體，產(chǎn)生出其中摻入了含二醇結(jié)構(gòu)單元的流感A基質(zhì)蛋白58-66肽 的變體。這種修飾配體的一個(gè)實(shí)例在圖8中給出。如圖9所例示， 將這種修飾配體暴露于高碘酸鹽會導(dǎo)致這些配體被切割。討論現(xiàn)有數(shù)據(jù)描述了產(chǎn)生被選擇的肽占據(jù)的MHC復(fù)合物的新方法。 產(chǎn)生這種復(fù)合物的主要限制因素曾在于無肽MHC分子的不穩(wěn)定性。 因此，現(xiàn)在廣為接受的產(chǎn)生重組MHC分子的技術(shù)是為每種單一配體 單獨(dú)產(chǎn)生一批配體占據(jù)的MHC分子。這導(dǎo)致生產(chǎn)過程非常費(fèi)時(shí)和昂 貴，只產(chǎn)生具體針對一個(gè)應(yīng)用的小批量。這里我們證明，可通過對 MHC分子原先結(jié)合的配體進(jìn)行選擇性釋放，通過暴露于不直接影響 MHC復(fù)合物本身的穩(wěn)定性的條件，來產(chǎn)生被選擇的配體占據(jù)的MHC分子。在目前的實(shí)驗(yàn)組中，通過使用光敏感肽變體實(shí)現(xiàn)了 MHC結(jié)合 配體的解離。但顯然的是，這種解離肯定同樣可通過使用對其它確 定條件敏感的肽變體來實(shí)現(xiàn)。具體的說，用對化學(xué)切割敏感的肽變 體開發(fā)肽-MHC復(fù)合物在這方面來說似乎是有用的。另外，也可不通 過肽切割，而是通過化學(xué)或光誘導(dǎo)的修飾誘導(dǎo)結(jié)合配體對MHC的親 和力減少來實(shí)現(xiàn)解離。此外，雖然進(jìn)行配體交換的方法在這里是為I 類MHC分子開發(fā)的，但這個(gè)方法應(yīng)同樣可用于制備配體占據(jù)II類 MHC分子或非經(jīng)典的MHC分子(以CD1和Qal分子為例)。通過化學(xué)或光誘導(dǎo)肽釋放產(chǎn)生的重組MHC分子，對于產(chǎn)生目前 用于臨床和臨床前研究的一大批MHC復(fù)合物來說是極為有用的。另 外，能夠通過簡單交換產(chǎn)生被所需配體占據(jù)的MHC配體的該能力， 對試圖產(chǎn)生可用于選擇性進(jìn)行抗原特異性T細(xì)胞排除或富集的GMP 級MHC分子的努力應(yīng)會有極大的促進(jìn)作用。最后，能夠?qū)︻A(yù)形成的 MHC復(fù)合物進(jìn)行肽交換的該能力，構(gòu)成了據(jù)以產(chǎn)生被一大批肽抗原 占據(jù)的MHC復(fù)合物微陣列的可行策略。這種MHC微陣列可形成用 于對抗原特異性T細(xì)胞庫(repertoire)進(jìn)行高通量分析的有用工具(3)。參考文獻(xiàn)1. Altman, J. D.， Moss, P. A., Goulder, P. J., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G., Bell, J. I.， McMichael, A.丄，and Davis, M. M. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes (抗原特異性T 淋巴細(xì)胞的表型分析).Science, 274: 94-96 (1996).2. Schumacher, T.N.M., H隨els, M-T, Ne咖s, J.J., Kast, W.M., Melief, C丄M. and Ploegh， H.L. Direct binding of peptide to empty MHC class I molecules on intact cells and in vitro (肽與空I類MHC分子在完 整細(xì)胞上和體內(nèi)的直接結(jié)合).Cell 62; 563-567 (1990).3. Soen Y, Chen DS, Kraft DL, Davis MM, Brown PO. Detection and Characterization of Cellular Immune Responses Using Peptide曙MHC Microarrays (使用肽MHC孩i測定的細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測和鑒定).PLoS Biol. l:E65:pp 429-438 (2003).4. Parmiani G， Testori A, Maio M, Castelli C, Rivoltini L, Pilla L, Belli F， Mazzaferro V， Coppa J, Patuzzo R, Sertoli M.R., Hoos A, Srivastava P.K. and Santinami M. Heat shock proteins and their use as anticancer vaccines (熱'激蛋白及其作為抗癌疫苗的用途).Clinical Cancer Research, 10; 8142-8146 (2004).附圖簡述

圖1.光切割策略1A).未修飾的流感A58-66表位I的結(jié)構(gòu)。1B). 光切割反應(yīng)。1C). 了8*修飾的光可切割流感A 58-66表位III的結(jié)構(gòu)。圖2.紫外線誘導(dǎo)的肽交換的生化分析。2A).含有紫外線敏感配 體的MHC多聚體對紫外線暴露敏感。2B).暴露于紫外線的紫外線 敏感MHC多聚體可通過添加MHC結(jié)合肽而得到穩(wěn)定化。圖3.從紫外線敏感MHC多聚體產(chǎn)生的MHC四聚體將抗原特異 性CTL克隆染色。將紫外線敏感MHC多聚體在指定肽的存在下暴 露于紫外線，轉(zhuǎn)化成MHC多聚體的四聚復(fù)合物。因此所產(chǎn)生的含有 HY (SMCY) 311-319肽(左下小圖)或MART I 26-35 (A2L突變體)肽(右 下小圖)的四聚體被用來染色MART I 26-35特異性CTL克隆。作為 對照，相同的克隆用含有相同表位的經(jīng)典I類MHC四聚體(上小圖) 染色。圖4.從紫外線敏感MHC多聚體產(chǎn)生的MHC四聚體將抗原特異 性外周血T細(xì)胞染色。將紫外線敏感MHC多聚體在指定肽的存在下 暴露于紫外線，轉(zhuǎn)化成MHC四聚體。因此所產(chǎn)生的含有CMV pp65 495-503肽(左下小圖)或流感A基質(zhì)蛋白58-66肽(右下小圖)的四聚 體被用來染色來自供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，其具有CMVpp65 495-503和流感A基質(zhì)蛋白58-66特異性CD8+ T細(xì)胞。作為對照， 相同的PBMC用含有相同表位的經(jīng)典I類MHC四聚體(上小圖)染色。圖5.從紫外線敏感MHC多聚體產(chǎn)生的MHC四聚體將抗原特異 性外周血T細(xì)胞染色。將紫外線敏感MHC四聚體在指定肽的存在下 暴露于紫外線，并不經(jīng)進(jìn)一步純化即用來染色抗原特異性T細(xì)胞。含有CMV pp65 495-503肽(笫二左小圖)或MART I 26-35 (A2L突變 體)或HY (SMCY) 311-319肽(兩個(gè)最右邊小圖)的MHC四聚體被用 來染色來自具有CMV pp65 495-;503 CD8+ T細(xì)胞的供體的外周血單 核細(xì)胞。作為對照，相同的PBMC用含有CMV pp65 495- 503肽的 經(jīng)典I類MHC四聚體(上小圖)染色。圖6.光不穩(wěn)定肽/HLA A2.1復(fù)合物在照射前(l)、不加拯救的照 射后(2)、在肽FLPSDC*FPSV (其中e用四甲基羅丹明染料標(biāo)記)存 在下照射后(3)的凝膠過濾譜。左小圖)在230 nm處的紫外線檢測， 右小圖)熒光檢測(激發(fā)530 nm，發(fā)射550nm)。圖7.熒光各向異性篩選。無肽的MHC分子通過切割條件性配 體來產(chǎn)生。熒光表位的結(jié)合通過測量熒光各向異性測量或熒光檢測 來監(jiān)測。通過這個(gè)方法，可鑒定出能干擾或促進(jìn)這種結(jié)合的肽配體 或非肽配體。圖8.基于二醇的化學(xué)可切割條件性肽和相應(yīng)的切割產(chǎn)物。含二 醇的單元力口框表示。圖9. Nal04對MHC-結(jié)合肽的切割。在8位(上)或4位(未顯示)具 有含二醇結(jié)構(gòu)單元的HLA-A2.1結(jié)合M1肽的肽變體通過化學(xué)合成來 產(chǎn)生。然后在暴露于1 mMNal04達(dá)l小時(shí)之前(下)或之后(上)，通過 LC-MS對肽進(jìn)行分析。
權(quán)利要求
1. 一種多聚蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)通過非共價(jià)相互 作用區(qū)域互相結(jié)合的成員，其中第一個(gè)所述成員包含條件反應(yīng)性基 團(tuán)，該基團(tuán)當(dāng)被化學(xué)或物理信號活化時(shí)切割所述第一成員當(dāng)中的共 價(jià)鍵，而減少所述非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度，其中所述第一成員包含 肽，第二成員包含多肽。
2. 權(quán)利要求1的多聚蛋白質(zhì)，其中所述多聚蛋白質(zhì)包含主要組 織相容性復(fù)合體(MHC)分子或其功能部分、衍生物和/或類似物。
3. 權(quán)利要求1或2的多聚蛋白質(zhì)，其中所述條件反應(yīng)性基團(tuán)包 括光敏感基團(tuán)或高碘酸鹽敏感基團(tuán)或它們的功能等同物。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多聚蛋白質(zhì)，其中所述光敏感基團(tuán) 包含3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸或其功能等同物。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多聚蛋白質(zhì)，其中所述高碘酸鹽敏感基團(tuán)包含二羥基部分。
6. 權(quán)利要求5的MHC分子，所述MHC分子在其或其功能部分、 衍生物和/或類似物的肽結(jié)合溝中包含肽抗原，其中所述肽抗原包含 所述條件反應(yīng)性基團(tuán)。
7. —種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多聚蛋白質(zhì)。
8. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述多聚蛋白質(zhì)包含主要組織相 容性復(fù)合體(MHC)分子或其功能部分、衍生物和/或類似物，且其中 至少一個(gè)所述成員是所述MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類 似物的肽結(jié)合溝中的肽抗原。
9. 權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的組合物，其中所述肽抗原包含所 述條件反應(yīng)性基團(tuán)。
10. 權(quán)利要求8的組合物，所述組合物還包含另外的肽。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述另外的肽是能夠結(jié)合在所述MHC分子的肽結(jié)合溝中的抗原肽。
12. —種產(chǎn)生MHC分子或其功能部分、衍生物和/或類似物的方 法，所述方法包括產(chǎn)生包含具有至少一個(gè)條件反應(yīng)性基團(tuán)的臨時(shí)肽 的MHC分子，所述條件反應(yīng)性基團(tuán)當(dāng)被活化時(shí)將所述臨時(shí)肽切割成
13. 權(quán)利要求12的方法，所述方法還包括將所述條件反應(yīng)性基 團(tuán)活化。
14. 權(quán)利要求13的方法，所述方法還包括為所述MHC分子或 其功能部分、衍生物和/或類似物提供結(jié)合所述MHC分子的肽結(jié)合 溝的所需肽。
15. 權(quán)利要求14的方法，所述方法還包括在能有效地將被切割 的臨時(shí)肽從所述MHC分子中除去的條件下，將所述MHC分子與所 述所需肽進(jìn)行溫育。
16. —種MHC分子，所述MHC分子可通過權(quán)利要求12-15中 任一項(xiàng)的方法獲得。
17. —種包含權(quán)利要求16的MHC分子的組合物，其中所述組 合物含有包含另外肽的MHC分子復(fù)合物和包含肽或其衍生物的MHC 分子復(fù)合物，所述肽或其衍生物包含條件反應(yīng)性基團(tuán)。
18. —種復(fù)合物，所述復(fù)合物包含至少兩個(gè)權(quán)利要求1-6中任一 項(xiàng)的多聚體或至少兩個(gè)權(quán)利要求16的MHC分子。
19. 一種固體表面，所述固體表面包含至少兩個(gè)權(quán)利要求1-6中 任一項(xiàng)的多聚體、權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)的組合物或權(quán)利要求16的 MHC分子。
20. 權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括檢測所述 所需的肽與所述MHC分子的結(jié)合。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述結(jié)合通過檢測與所述肽有關(guān) 的標(biāo)i己物來^r測。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述肽包含所述標(biāo)記物。
23. 權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述肽與所述MHC 分子的所述結(jié)合通過熒光各向異性的手段來測量。
24. 權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)的方法，所述方法用以測定所述所 需的肽在試驗(yàn)或參考化合物存在下的結(jié)合情況。
25. 包含氨基酸序列AMDSNTLEL的分離和/或合成肽在疫苗中 的用途。
26. 包含氨基酸序列AMDSNTLEL的分離和/或合成肽用于制備 抗流感疫苗的用途。
27. 權(quán)利要求16的MHC分子，所述MHC分子含有包含氨基酸 序列AMDSNTLEL的分離和/或合成肽。
28. 權(quán)利要求27的MHC分子，所述MHC分子用以檢測對所述 肽有特異性的T細(xì)胞。
29. 權(quán)利要求27的MHC分子用于制備T細(xì)胞組合物的用途， 所述T細(xì)胞對所述肽有特異性。
30. —種診斷個(gè)體中的流感的方法，所述方法包括為所述個(gè)體的 血液樣品提供權(quán)利要求27的MHC分子，并分析所述MHC分子與 所述血液樣品中的細(xì)胞的結(jié)合。
31. —種使個(gè)體免疫以抵抗流感的方法，所述方法包括為所述個(gè) 體提供包含氨基酸序列AMDSNTLEL的分離和/或合成肽和任選的免 疫增強(qiáng)劑和/或合適的添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及多聚蛋白質(zhì)類分子，所述蛋白質(zhì)類分子包含至少兩個(gè)通過非共價(jià)相互作用區(qū)域互相結(jié)合的成員，其中第一個(gè)所述成員包含條件反應(yīng)性基團(tuán)，該基團(tuán)當(dāng)被活化時(shí)能切割所述第一成員當(dāng)中的共價(jià)鍵。共價(jià)鍵的切割導(dǎo)致所述至少兩個(gè)成員據(jù)以通過所述非共價(jià)相互作用區(qū)域互相結(jié)合的結(jié)合強(qiáng)度減少。結(jié)合強(qiáng)度的減少能導(dǎo)致各成員在溫和條件下分離。
文檔編號C07K14/705GK101146824SQ200680009470
公開日2008年3月19日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日
發(fā)明者A·N·M·舒馬徹, H·奧瓦 申請人:荷蘭癌癥研究所;?？蜓汗?yīng)基金會