專利名稱：：來自尿路病原性大腸桿菌的免疫原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于大腸桿菌CE.co/Z)生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及能引起對(duì)腸外病原性大腸桿菌(ExPEC)菌株的免疫的免疫原。
背景技術(shù)：
：很少有微生物具有如大腸桿菌般的多用途。同時(shí)作為哺乳動(dòng)物正常腸道微生物區(qū)系的重耍成員，其已被廣泛用作重組DNA技術(shù)的宿主。然而，大腸桿菌也可能成為致命病原體。大腸桿菌菌株通常被分為共牛性或病原性，病原性菌株再分成腸內(nèi)或腸外菌株。更新的分類技術(shù)如多基因座酶電泳法(MLEE)將大腸桿菌分為5類系統(tǒng)發(fā)生組(A、Bl、B2、D和E)，這些分組與傳統(tǒng)的分類不匹配。例如MLEEB1組包括共生性和病原性菌株，D組包括腸內(nèi)和腸外菌株。大腸桿菌的腸外病原性菌株(或'ExPEC'菌株[l])落入MLEEB2組和D組中，包括尿路病原性(UPEC)菌株和腦膜炎服毒癥相關(guān)性(MNEC)菌株。UPEC菌株引起尿路感染(UTI)，為膀胱炎的最普遍形式。它們還引起腎盂腎炎(及其并發(fā)癥如膿毒癥)和尿?qū)Ч芟嚓P(guān)感染。MNEC菌株引起病例致死率范圍在25%-40%的新生兒腦膜炎(每1000個(gè)活新生兒中出現(xiàn)O.l例)，還引起大約1/6的膿毒癥病例。最早的ExPEC疫苗基于細(xì)胞裂解物或細(xì)胞結(jié)構(gòu)。SOLCOUROVACtm包括10種不同的熱殺細(xì)菌，包括6種ExPEC菌株，參考文獻(xiàn)2中報(bào)道了成功的II期臨床實(shí)驗(yàn)。URO-VAXOMTM是一種含有18種選擇的大腸桿菌菌株的凍干細(xì)菌裂解物的口服片劑疫苗[3]。BaxterVaccines研制出一種基于6-10種不同菌株來源的菌毛的UTI疫苗，但該產(chǎn)品已被放棄。Medlmmune研制出一種基于FimH粘附素復(fù)合物的名為MEDI516的產(chǎn)品[4]，但是II期臨床實(shí)驗(yàn)顯示效力不夠。而且，這種疫苗存在影響正常腸道菌叢中的非病原性FimH+ve菌株的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，由于其膀胱特異性粘附機(jī)制，預(yù)計(jì)這種疫苗僅對(duì)UPEC菌株有效，而其它ExPEC菌株不受它的控制。因此，需要一種改良的ExPEC疫苗，還需要從天然細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到更明確的分子，還需要鑒定適于包含入疫苗的其它抗原，尤其是那些在臨床ExPEC菌株中很普遍、而在共生性菌株中不存在的抗原。參考文獻(xiàn)5報(bào)道了滿足上述需要的一種方法，其發(fā)明人尋找在MLEEB2類型和D類型的基因組中存在但在MLEEA類型和B1類型中不存在的基因?；诳鄢s交的其它比較方法參見參考文獻(xiàn)6和7。參考文獻(xiàn)8中也鑒定了ExPEC菌株的毒力基因。參考文獻(xiàn)9分析了UPEC大腸桿菌菌株536中的四種致病性島(island)。參考文獻(xiàn)10采用UPEC(06:K2:H1)菌株CFT073的基因組序列[l1,12]來鑒定在非病原性大腸桿菌菌株中不存在的序列。參考文獻(xiàn)13比較了大腸桿菌人腎盂腎炎分離物536(06:K15:H31)(—種UPEC)的基因組序列與菌株CFT073(UPEC)、EDL933(腸出血性)和MG1655(非病原性實(shí)驗(yàn)菌株)的序列數(shù)據(jù)。病原性菌株的基因組序列獲自數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)AE005174、BA000007和NC-004431。非病原性菌株的序列獲自登錄號(hào)U00096。本發(fā)明的目的是提供用于引起對(duì)病原性大腸桿菌菌株、具體是ExPEC菌株、更具體是UPEC菌株的免疫的其它抗原。發(fā)明概要發(fā)明人確定了能包含入對(duì)病原性大腸桿菌菌株有特異性的免疫原性組合物中的各種基因。所述基因來自尿路病原性菌株(UPEC)，然而在非病原性菌株中不存在，并且其編碼蛋白的細(xì)胞定位使它們可受免疫系統(tǒng)的影響。--方面，本發(fā)明涉及一種多肽，其包含(a)選自下組的氨基酸序列SEQIDNO22、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、17、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、〗56、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、楊、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598和599;(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80。/。并包含氨基酸序列(a)中至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明這方面的多肽包含一種片段，其包含至少一個(gè)(a)的B細(xì)胞表位。另一方面，本發(fā)明涉及一種多肽，其包含(a)選自下組的氨基酸序列SEQIDNO22、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598和599;(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性節(jié)少為80。/。并包含氨基酸序列(a)中至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。在-個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明這方面的多肽包含一種片段，其包含至少一個(gè)(a)的B細(xì)胞表位。本發(fā)明的多肽可用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物及藥物的制備。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受載體混合的本發(fā)明多肽。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含兩種或多種與藥學(xué)上可接受載體混合的本發(fā)明多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明藥物組合物還包含疫苗佐劑。本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其包含表達(dá)或過表達(dá)包含如下氨基酸序列的一種或多種多肽的一種或多種外膜泡(OMV):(a)選自下組的氨基酸序列SEQIDNO22、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598和599;(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80。/。并包含氨基酸序列(a)中至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明這方面的免疫原性組合物包含一種或多種多肽，所述多肽含有包含至少一個(gè)(a)的B細(xì)胞表位的片段。本發(fā)明還涉及一種在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述患者本發(fā)明的藥物組合物或免疫原性組合物的步驟。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述免疫應(yīng)答能保護(hù)對(duì)象不受ExPEC感染。本發(fā)明的其它方面描述如下。附圖簡要說明圖1顯示用熱滅活CFT073進(jìn)行免疫后，用CFT073刺激后小鼠的存活率。發(fā)明詳述本發(fā)明人鑒定了可包含在對(duì)病原性大腸桿菌菌株特異性的免疫原性組合物中的各種基因。所述基因來自UPEC菌株，然而在非病原性菌株中不存在，并且其編碼蛋白的細(xì)胞定位使它們可受免疫系統(tǒng)的影響。微本發(fā)明提供多肽，其包含實(shí)施例中公開的氨基酸序列。序列表中的SEQIDNO1-596和SEQIDNO597-599給出了這些氨基酸序列。SEQIDNO1-596中的優(yōu)選序列在表2、表3和表5中給出。本發(fā)明還提供包含與實(shí)施例中公開的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。針對(duì)特定序列，序列相同性程度優(yōu)選大于50%(如60%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96。％、97%、98%、99。％或更高)。這些多肽包括同源物、直向同源物、等位基因變體和突變體。一般地，兩種多肽序列之間相同性為50%或更高被認(rèn)為是功能等效的標(biāo)志。優(yōu)選用MPSRCH程序(OxfordMolecular)中運(yùn)行的Smith-Waterman同源性檢索算法來確定多肽間的相同性，其采用帶有參數(shù)欽"開及罰分=72和欽"延辦^分二/的仿射缺口檢索來進(jìn)行。與實(shí)施例的序列相比，這些多肽可包含一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO等)保守的氨基酸取代，即用具有相關(guān)側(cè)鏈的另一種氨基酸取代原有氨基酸。遺傳編碼氨基酸通常分成4種家族(l)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時(shí)將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起稱為芳族氨基酸。通常，這些家族中的單個(gè)氨基酸的替換不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生重要影響。相對(duì)于參比序列，所述多肽可以有一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)單個(gè)氨基酸的缺失。相對(duì)于參比序列，所述多肽還可包含一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(如1、2、3、4或5個(gè)氨基酸)。優(yōu)選的多肽包含那些脂質(zhì)化的、位于外膜中的、位于內(nèi)膜中的、或位于周質(zhì)中的多肽。尤其優(yōu)選的多肽是同時(shí)屬于這些范疇中1種以上的多肽，如位于外膜中的脂質(zhì)化多肽。翻譯后加工信號(hào)肽后脂蛋白的N端半胱氨酸共價(jià)連接于脂質(zhì)?？梢赃M(jìn)行脂質(zhì)化的多肽包括SEQIDNO:1、2、7、12、13、14、15、16、17、18、22、26、28、29、33、34、38、40、45、50、51、59、67、68、69、71、77、80、82、83、84、92、98、103、104、105、120、121、124、125、126、127、130、131、133、134、138、142、147、159、160、176、184、185、186、187、192、206、210、215、222、223、225、226、228、233、234、246、251、252、268、272、273、275、284、287、293、295、297、298、299、300、302、303、304、305、310、311、312、314、315、320、326、327、330、331、336、340、359、360、364、366、367、369、370、371、374、378、379、386、387、388、389、390、395、400、401、407、408、"8、419、422、423、425、429、431、433、434、435、436、438、441、442、444、447、453、464、465、472、478、492、500、506、509、517、518、519、523、526、531、536、540、543、544、546、548、551、557、559、560、562、563、564、565、566、568、569、574、577、583、584、585、586、593和594。優(yōu)選多肽為表2、表3和表5列出的多肽，尤其是表3列出的多肽。本發(fā)明還提供包含實(shí)施例中公開的氨基酸序列的片段的多肽。所述片段包含該序列中至少n個(gè)連續(xù)氨基酸，針對(duì)特定序列，；i為7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更大)。所述片段可包含該序列的至少一個(gè)T細(xì)胞表位，或優(yōu)選地，B細(xì)胞表位。T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位可憑經(jīng)驗(yàn)鑒定(如采用PEPSCAN[14、15]或類似方法)或預(yù)觀ij(如采用Jameson-Wolf抗原性指數(shù)[16]、矩陣基方法[17]、TEPITOPE[18]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[19]、OptiMer&EpiMer[20、21]、ADEP丁[22]、Tsites[23]、親水性[24]、抗原性指數(shù)[25]或參考文獻(xiàn)26公開的方法等)。其它優(yōu)選片段為(a)本發(fā)明多肽的N端信號(hào)肽、(b)不具有N端信號(hào)肽的本發(fā)明多肽、(c)不具有其N端氨基酸殘基的本發(fā)明多肽。其它優(yōu)選的片段為以可能的起始密碼子(ATG、GTG、TTG)編碼的氨基酸開始的那些片段。從所示起始密碼子下游的起始密碼子編碼的甲硫氨酸處開始的片段為本發(fā)明多肽。其它優(yōu)選的片段為那些與本發(fā)明多肽以及與由參考文獻(xiàn)5、6、8、10和11中的任一篇鑒定的多肽相同的片段。本發(fā)明多肽可以許多方式制備，如化學(xué)合成(全部或部分)、用蛋白酶消化較長多肽、對(duì)RNA進(jìn)行翻譯、從細(xì)胞培養(yǎng)物(如重組表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物)或生物體本身(如經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)或直接來自患者的生物體)進(jìn)行純化等。制備長度<40個(gè)氨基酸的多肽的優(yōu)選方法包括體外化學(xué)合成[27、28]。尤其優(yōu)選固相的肽合成，如基于tBoc或Fmoc[29]化學(xué)的方法。也可部分或全部采用酶合成[30]。作為對(duì)化學(xué)合成的替代方法，還可采用生物合成，例如可以通過翻譯來制備多肽。這可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。生物學(xué)方法通常限于制備L氨基酸多肽，然而操控翻譯機(jī)器(如氨?；鵷RNA分f)可用于引入D氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、疊氮高丙氨酸等)[31]。然而，含有D氨基酸時(shí)，優(yōu)選采用化學(xué)合成方法?？稍贑末端和/或N末端對(duì)本發(fā)明多肽進(jìn)行共價(jià)修飾。本發(fā)明多肽可采取各種形式(如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂質(zhì)化、非脂質(zhì)化、磷酸化、非磷酸化、十四垸基化、非十四烷基化、單體、多聚體、顆粒、變性等)。優(yōu)選提供純化或基本純化形式，即基本上不含其它多肽(如不含天然產(chǎn)生的多肽)，尤其是不含其它ExPEC或宿主細(xì)胞多肽的本發(fā)明多肽，通常至少約50%純(重量)，通常至少約卯％純，即其它表達(dá)多肽占該組合物的約50%以下，更優(yōu)選約10%以下(如5%或更少)。本發(fā)明的多肽優(yōu)選為ExPEC多肽。本發(fā)明多肽可連接于固相載體。本發(fā)明多肽可包含檢測標(biāo)記(如放射性或熒光標(biāo)記或生物素標(biāo)記)。術(shù)語"多肽"指任何長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直鏈或支鏈，它可包含修飾氨基酸，并且可被非氨基酸所中斷。所述術(shù)語還涵蓋經(jīng)天然修飾或介入(intervention)修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙酰化、磷酸化或任何其它操控或修飾，如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。該定義還包括(例如)含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括(如)非天然氨基酸等)以及其它本領(lǐng)域公知修飾的多肽。多肽可以單鏈或結(jié)合鏈的形式存在。本發(fā)明多肽可以是天然或人工糖基化的多肽(即所述多肽的糖基化模式與在相應(yīng)的天然產(chǎn)生多肽中發(fā)現(xiàn)的糖基化模式不同)。本發(fā)明多肽的長度可以是至少40個(gè)氨基酸(如至少40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500或更多)。本發(fā)明多肽可短于500個(gè)氨基酸(如不超過40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400或450個(gè)氨基酸)。本發(fā)明提供的多肽包含序列-X-Y-或-Y-X-，其中-X-為上述定義的氨基酸序列，-Y-并非上述定義的序列，即本發(fā)明提供融合蛋白。當(dāng)多肽編碼序列的N末端密碼子并非ATG時(shí)，所述密碼子將會(huì)按照該密碼子的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行翻譯而不是翻譯成Met，這種情況發(fā)生在該密碼子翻譯成起始密碼子時(shí)。本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明多肽的方法，包括在誘導(dǎo)多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的步驟。本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化學(xué)方法合成。本發(fā)明提供一種含有兩種或多種本發(fā)明多肽的組合物。本發(fā)明還提供一種以通式NH2-A-[-X-L-]-B-COOH表示的雜交多肽，其中X為上述定義的本發(fā)明多肽，L為任選的接頭氨基酸序列，A為任選的N末端氨基酸序列，B為任選的C末端氨基酸序列，n為大于l的整數(shù)。M值在2和x之間，x值一般為3、4、5、6、7、8、9或10。優(yōu)選地，"為2、3或4;更優(yōu)選地為2或3;最優(yōu)選地，n=2。在每種"的例子中，-X-可以相同或不同。在[-X-L-]的每種n的例子中，接頭氨基酸序列-L-可有或無。例如，當(dāng)n二2時(shí)，該雜交體可以是NH2-X廣L廣X2-L2-COOH、NH2-X!-X2-COOH、NH2-X!-L廣X2-COOH、NH2-X,-X2-L2-COOH等。接頭氨基酸序歹i」-L-一般為短序列(如20個(gè)或更少氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè))。例子包括有助于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接頭(即G1k，其中"=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)、和組氨酸標(biāo)簽(即His，其中"=3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合適的接頭氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。-A-和-B-為任選序列，一般為短序列(如40個(gè)或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè))。例子包括指導(dǎo)多肽運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列，或有助于克隆或純化的短肽序列(如組氨酸標(biāo)簽，即His。，其中"=3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合適的N末端和C末端氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的?？刹捎酶鞣N試驗(yàn)來評(píng)估本發(fā)明多肽的體內(nèi)免疫原性。例如，多肽可重組表達(dá)并通過免疫印跡法用來篩選患者血清。多肽和患者血清之間發(fā)生陽性反應(yīng)說明患者以前對(duì)所研究蛋白產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，即該蛋白為免疫原。這種方法還可用來鑒定優(yōu)勢(shì)免疫蛋白。拔體本發(fā)明提供與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體。它們可以是多克隆或單克隆抗體，并可由任何合適方法制備(如通過重組表達(dá))。為了增加其與人免疫系統(tǒng)的相容性，所述抗體可以是嵌合抗體或人源化抗體[如，參考文獻(xiàn)32和33]，或可采用完全人抗。所述抗體可以包含檢測標(biāo)記(如用于診斷試驗(yàn))。本發(fā)明抗體可以連接于固相載體。本發(fā)明抗體優(yōu)選為中和抗體。單克隆抗體對(duì)鑒定和純化與之結(jié)合的單獨(dú)多肽尤其有用。本發(fā)明的單克隆抗體也可以用作免疫測定、放射性免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等的試劑。在這些應(yīng)用中，可用分析檢測試劑如放射性同位素、熒光分子或酶標(biāo)記抗體。以上述方法制備的單克隆抗體還可用于本發(fā)明多肽的分子鑒定或表征(表位作圖)。本發(fā)明抗體優(yōu)選對(duì)大腸桿菌的ExPEC菌株具有特異性，即，相對(duì)于其它細(xì)菌(如，相對(duì)于非ExPEC大腸桿菌和相對(duì)于非大腸桿菌細(xì)菌)，它們優(yōu)選地與ExPEC大腸桿菌結(jié)合。更優(yōu)選地，所述抗體對(duì)UPEC菌株具有特異性，即，相對(duì)于其它細(xì)菌，包括其它ExPEC大腸桿菌，它們優(yōu)選地與UPEC細(xì)菌結(jié)合。本發(fā)明抗體優(yōu)選地以純化或基本純化形式提供。一般地，抗體存在于基本上不含其它多肽的組合物中，如組合物中其它多肽少于90。/。(重量)，通常少于60%，更通常少于50%。本發(fā)明抗體可以是任何同種型(如IgA、IgG、IgM，即a、Y或y重鏈)，然而通常為IgG。在IgG同種型中，抗體可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4亞類。本發(fā)明抗體可具有k或A輕鏈。本發(fā)明抗體可具有各種形式，包括完整抗體，抗體片段如F(ab')2和F(ab)片段、Fv片段(非共價(jià)異二聚體)、單鏈抗體(如單鏈Fv分子(scFv))、小抗體、寡抗體(oligobody)等。術(shù)語"抗體"不暗指任何特定來源，并包括由非常規(guī)方法(如噬菌體呈現(xiàn))所獲得的抗體。本發(fā)明提供一種檢測本發(fā)明多肽的方法，包括如下步驟(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下將生物樣品與本發(fā)明抗體接觸；和(b)檢測所述復(fù)合物。本發(fā)明提供一種檢測本發(fā)明抗體的方法，包括如下步驟(a)在適于形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下將生物樣品(如血液或血清樣品)與本發(fā)明多肽接觸；和(b)檢測所述復(fù)合物。優(yōu)選抗體與本發(fā)明多肽結(jié)合的親和力明顯大于本領(lǐng)域公知抗體。優(yōu)選地，該親和力至少比本領(lǐng)域公知抗體強(qiáng)1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍等。微本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明還提供包含與所述核苷酸序列有序列相同性的核苷酸序列的核酸。序列之間的相同性優(yōu)選用上述Smith-Waterman同源檢索算法確定。本發(fā)明還提供可與這些核酸雜交的核酸。雜交反應(yīng)可以在不同"嚴(yán)格"條件>一進(jìn)行。本領(lǐng)域眾所周知并公開了提高雜交嚴(yán)格性的條件[如參考文獻(xiàn)34第7.52頁]。相關(guān)條件的例子包括(以嚴(yán)格性遞增的順序》培育溫度25°C、37°C、50°C、55。C禾Q68°C;緩沖液濃度IOXSSC、6XSSC、1XSSC、O.IXSSC(其中SSC為0.15MNaCl和15mM檸檬酸鹽的緩沖液)及采用其它緩沖體系的等效物；甲酰胺濃度0%、25%、50%和75%;培育時(shí)間從5分鐘到24小時(shí)；1次、2次或更多次洗滌步驟；1分鐘、2分鐘或15分鐘的洗滌培育時(shí)間；洗滌溶液6XSSC、1XSSC、O.IXSSC或去離子水。雜交技術(shù)及其優(yōu)化為本領(lǐng)域公知[如見參考文獻(xiàn)34-37等]。一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸在低嚴(yán)格條件下與靶點(diǎn)雜交；在其它實(shí)施方式中它在中等嚴(yán)格條件下雜交；優(yōu)選實(shí)施方式中，它在高度嚴(yán)格條件下雜交。低嚴(yán)格雜交條件的示例性參數(shù)組為5(TC和IOXSSC。中等嚴(yán)格雜交條件的示例性參數(shù)組為55。C禾Q1XSSC。高度嚴(yán)格雜交條件的示例性參數(shù)組為68。C和O.IXSSC。還提供了包含這些序列片段的核酸。它們應(yīng)該包含序列中的至少n個(gè)連續(xù)核苷酸，根據(jù)特定序列，n為IO或更多(如12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、卯、100、150、200或更多)。優(yōu)選的片段為與本發(fā)明核酸序列和參考文獻(xiàn)5、6、8、IO和11中任一篇所鑒定的核苷酸序列相同的那些片段。本發(fā)明提供通式5'-X-Y-Z-3'的核酸，其中-X-為由x個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列；-Z-為z個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列；-Y-為由以下片段組成的核苷酸序列(a)編碼SEQIDNO:1-596之一的核酸序列的片段；或(b)編碼SEQIDNO:597-599之一的核苷酸序列的片段；或(c)(a)或(b)的互補(bǔ)物；所述核酸5'-X-Y-Z-3'不是(i)編碼SEQIDNO:1-596之一或編碼SEQIDNO:597-599之一的核酸序列的片段，也不是(ii)(i)的互補(bǔ)物。-乂-和/或7-部可包含啟動(dòng)子序列(或其互補(bǔ)序列)。本發(fā)明包括包含與這些序列互補(bǔ)的序列的核酸(如作為反義鏈或探針，或用作本發(fā)明核酸可用于雜交反應(yīng)(如Northern雜交或Southern印跡、或用于核酸微陣列或'基因芯片')、擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)和其它核苷酸技術(shù)。本發(fā)明核酸可具有各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標(biāo)記等)。本發(fā)明核酸可以是環(huán)狀或支鏈，然而通常為直鏈。除非另有限定或要求，采用核酸的本發(fā)明任何實(shí)施方式均可采用雙鏈形式和組成該雙鏈形式的兩條互補(bǔ)的單鏈形式。引物和探針通常為單鏈，反義核苷酸通常也是單鏈。優(yōu)選以純化或基本純化的形式，即基本上不含其它核酸(如不含天然產(chǎn)生的核酸)、尤其不含其它ExPEC或宿主細(xì)胞核酸的形式提供本發(fā)明核酸，通常為至少約50%純(重量)，通常至少約卯％純。本發(fā)明核酸優(yōu)選地為ExPEC核酸。本發(fā)明核酸可以多種方式制備，如完全或部分采用化學(xué)合成(如DNA的亞磷酰胺合成)，用核酸酶消化較長核酸(如限制性酶)，連接基因組或cDNA文庫中的較短核酸或核苷酸(如采用連接酶或聚合酶)等。本發(fā)明核酸可以連接于固相載體(如珠子、平板、濾紙、膜、玻片、微陣列載體、樹脂等)。可用(如)放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記、或生物素標(biāo)記標(biāo)記本發(fā)明核酸。當(dāng)該核酸用于檢測技術(shù)，如該核酸是引物或探針時(shí)，標(biāo)記特別有用。術(shù)語"核酸"通常包括任何長度的核苷酸的聚合形式，其包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體。它還包括DNA或RNA類似物，如含有修飾主鏈(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酉旨)或修飾堿基的類似物。因此本發(fā)明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重組核酸、支鏈核酸、質(zhì)粒、載體、探針、引物等。當(dāng)本發(fā)明的核酸采用RNA形式時(shí)，它可能或可能不帶有5'帽。本發(fā)明核酸包含序列，然而它們還可以包含非ExPEC序列(如上述通式5'-X-Y-Z-3'的核酸)。這對(duì)探針而言尤其適用，從而可使探針包含與耙核酸互補(bǔ)的第一序列和不與靶核酸互補(bǔ)的第二序列。引物中的任何此類非互補(bǔ)序列優(yōu)選位于互補(bǔ)序列的5'。典型的非互補(bǔ)序列包含限制性位點(diǎn)或啟動(dòng)子序列。本發(fā)明的核酸可用許多方法制備，如化學(xué)合成(至少一部分)，用核酸酶(如限制性酶)消化較長核酸，連接基因組或cDNA文庫中的較短核酸(如采用連接酶或聚合酶)等。本發(fā)明核酸可以是載體的一部分，即設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染一種或多種細(xì)胞類型的核酸構(gòu)建物的一部分。載體可以是，例如，設(shè)計(jì)用來分離、增殖和復(fù)制插入核苷酸的"克隆載體"，設(shè)計(jì)用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列的"表達(dá)載體"，設(shè)計(jì)用來生產(chǎn)重組病毒或病毒樣顆粒的"病毒載體"，或包括超過一種類型的載體的屬性的"穿梭載體"。優(yōu)選的載體為質(zhì)粒。"宿主細(xì)胞"包括單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可以作為或已經(jīng)作為外源核酸的受體。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突變和/或改變，所述后代不一定與原始親代細(xì)胞完全相同(形態(tài)萬面或總DNA互補(bǔ)物(complement)方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明核酸在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。當(dāng)核酸為DNA時(shí)，應(yīng)理解，RNA序列中的"U"會(huì)被DNA中的"T"取代。相似地，當(dāng)核酸為RNA時(shí)，應(yīng)理解，DNA序列中的"T"會(huì)被RNA中的"U"取代。當(dāng)術(shù)語"互補(bǔ)物"或"互補(bǔ)"用于核酸時(shí)，指Watson-Crick堿基配對(duì)。因此C的互補(bǔ)物為G，G的互補(bǔ)物為C，A的互補(bǔ)物為T(或U)，T(或U)的互補(bǔ)物為A。還可能使用如I(嘌呤肌苷)這樣的堿基，與嘧啶(C或T)互補(bǔ)。所述術(shù)語還暗示了方向，即5'-ACAGT-3'的互補(bǔ)物為5'-ACTGT-3'而不是5'-TGTCA-3'。本發(fā)明核酸可用于，如制備多肽；作為在生物樣品中檢測核酸的雜交探針；產(chǎn)生核酸的額外拷貝；產(chǎn)生核酶或反義寡核苷酸；作為單鏈DNA引物或探針；或作為三鏈形式寡核苷酸。本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明核酸的方法，其中所述核酸為部分或全部采用化學(xué)方法合成的。本發(fā)明提供包含本發(fā)明核苷酸序列的載體(如，克隆或表達(dá)載體)和轉(zhuǎn)染有所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供包含用于擴(kuò)增ExPEC核酸序列內(nèi)所含模板序列的引物(如PCR引物)的試劑盒，所述試劑盒包括第一引物和第二引物，其中所述第一引物與所述模板序列基本互補(bǔ)，所述第二引物與所述模板序列的互補(bǔ)物基本互補(bǔ)，其中基本互補(bǔ)的所述引物部分確定了待擴(kuò)增模板序列的末端。所述第一引物和/或第二引物可包括可檢測標(biāo)記(如熒光標(biāo)記)。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包括第一和第二單鏈寡核苷酸，其可以擴(kuò)增單鏈或雙鏈核酸(或其混合物)內(nèi)所含的ExPEC模板核酸序列，其中(a)所述第一寡核苷酸包含與所述模板核酸序列基本互補(bǔ)的引物序列；(b)所述第二寡核苷酸包含與所述模板核酸序列的互補(bǔ)物基本互補(bǔ)的引物序列；(c)所述第一寡核苷酸和/或所述第二寡核苷酸包含不與所述模板核酸互補(bǔ)的序列；和(d)所述引物序列確定了待擴(kuò)增模板序列的末端。所述特征(c)的非互補(bǔ)序列優(yōu)選位于所述引物序列的上游(即其5'方向)。(c)序列中一種或兩種可包含限制性位點(diǎn)[如參考文獻(xiàn)38]或啟動(dòng)子序列[如39]。第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸可包括可檢測標(biāo)記(如熒光標(biāo)記)。本發(fā)明提供檢測本發(fā)明核酸的方法，包括如下步驟(a)在雜交條件下將生物樣品與本發(fā)明核酸探針接觸以形成雙鏈體；和(b)檢測所述雙鏈體。本發(fā)明提供檢測生物樣品(如血液)的方法，包括如下步驟在雜交條件下將生物樣品與本發(fā)明核酸接觸。所述方法可以包括核酸擴(kuò)增(如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)或雜交(如微陣列、印跡、在溶液中與探針雜交等)。已經(jīng)報(bào)道過用PCR檢測臨床樣品中的ExPEC[如，見參考文獻(xiàn)40]。在參考文獻(xiàn)41中總體描述了基于核酸的臨床試驗(yàn)。本發(fā)明提供一種制備靶序列片段的方法，其中通過延伸核酸引物制備所述片段。所述靶序列和/或引物為本發(fā)明的核酸。所述引物延伸反應(yīng)可包括核酸擴(kuò)增(如，PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增可以是定量和/或?qū)崟r(shí)擴(kuò)增。就本發(fā)明的某些實(shí)施方式而言，核酸長度優(yōu)選為至少7個(gè)核苷酸(如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、卯、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300個(gè)核苷酸或更長)。就本發(fā)明的某些實(shí)施方式而言，核酸長度優(yōu)選為至多500個(gè)核苷酸(如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15個(gè)核苷酸或更短)。本發(fā)明的引物和探針，以及其它用于雜交的核酸的長度優(yōu)選為10-30個(gè)核苷酸(女口10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸)。稀參考文獻(xiàn)42描述了通過敲除m/"(胞壁質(zhì)溶解性糖基轉(zhuǎn)移酶)或大腸桿菌Tol-Pal復(fù)合物的一種或多種組分(如to/丄M/g、禱、戸/和/或to/Z)從尿路病原性(UPEC)菌株中制備小泡的方法?？梢詫?duì)細(xì)菌染色體進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)遺傳改變或插入附加型元件(如表達(dá)載體)來增加小泡表面保護(hù)性抗原的量和/或免疫可及性，從而改進(jìn)小泡。獲得此類改進(jìn)的一種方法是上調(diào)本發(fā)明多肽的表達(dá)。本領(lǐng)域熟知增加靶蛋白表達(dá)的多種不同遺傳方案，它們可能分成兩大類一類依賴對(duì)染色體的修飾(如用較強(qiáng)的啟動(dòng)子替換野生型啟動(dòng)子、使天然抑制基因失活等)以增加內(nèi)源性基因的表達(dá)，另一類則基于附加型元件(如高拷貝數(shù)質(zhì)粒、攜帶工程改造的靶基因的載體等)或染色體中整合外源性基因進(jìn)行的重組表達(dá)。這些方法的實(shí)施例可以在參考文獻(xiàn)44-50中找到。提高小泡免疫原性和選擇性的另一種方法是下調(diào)免疫優(yōu)勢(shì)非保護(hù)性抗原的表達(dá)或下調(diào)與共生菌株中找到的蛋白同源的蛋白?？梢酝ㄟ^對(duì)LPS的脂質(zhì)A部分進(jìn)行脫毒而獲得進(jìn)一步改進(jìn)。先前描述了相似的改變，以從其它革蘭陰性病原體中產(chǎn)生改進(jìn)小泡(參見參考文獻(xiàn)51和52)。所有上述方案均可單獨(dú)使用或聯(lián)用以獲得用于免疫原性組合物的改進(jìn)小泡。本發(fā)明提供一種敲除了m/"和/或其7W-尸"/復(fù)合物的組分和下組中一種或多種的病原性大腸桿菌(尤其是UPEC):(i)在一種與編碼本發(fā)明多肽的基因天然相連的啟動(dòng)子相比使本發(fā)明多肽表達(dá)水平升高的啟動(dòng)子的控制下編碼本發(fā)明多肽的染色體基因；(ii)編碼本發(fā)明多肽的自主復(fù)制的染色體外元件；和/或(iii)相對(duì)于野生型LPS減弱大腸桿菌LPS的脂質(zhì)A部分毒性的遺傳修飾。本發(fā)明還提供可通過培育此類細(xì)菌獲得的小泡，例如在細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，釋放入培養(yǎng)基中的小泡。藥激蘊(yùn)合欽本發(fā)明提供的組合物含有(a)本發(fā)明的多肽、抗體、小泡和/或核酸；和(b)藥學(xué)上可接受的載體。這些組合物可能適合用作免疫原性組合物，例如，或者用作診斷試劑，或者用作疫苗。本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性疫苗或治療性疫苗，但一般是預(yù)防性疫苗。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供包含表達(dá)或過表達(dá)一種或多種本發(fā)明多肽的一種或多種外膜泡(OMV)的免疫原性組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含表達(dá)或過表達(dá)一種或多種多肽的一種或多種OMV的免疫原性組合物，所述多肽包含(a)選自SEQIDNO:22、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598或599的氨基酸序列；(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為來自氨基酸序列(a)的至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80。/。并包含氨基酸序列(a)中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，所述免疫原性組合物包含含有片段的多肽，所述片段含有選自下組的氨基酸序列的至少一個(gè)B細(xì)胞表位SEQIDN022、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598和599。'藥學(xué)上可接受的載體'包括自身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體一般為大的、代謝緩慢的大分子如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳塘和脂質(zhì)聚集體(如油滴或脂質(zhì)體)。此類載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知技術(shù)。所述疫苗還可包含稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，可存在助劑，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。無菌無熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是典型的載體。對(duì)藥學(xué)上可接受賦形劑的詳細(xì)討論參見參考文獻(xiàn)296。本發(fā)明的組合物可包含抗微生物劑、尤其是以多劑量形式包裝時(shí)。本發(fā)明的組合物可包含去污劑，如吐溫(聚山梨醇酯)，例如吐溫80。去污劑的含量通常很低，如<0.01%。本發(fā)明的組合物可包含鈉鹽(如氯化鈉)以提供漲度(tonicity)。NaCl濃度一般為10±2mg/ml。本發(fā)明的組合物通常包含緩沖液。一般為磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的組合物，尤其是當(dāng)其將被凍干或當(dāng)它們包含由凍干材料重建獲得的物質(zhì)時(shí)，可包含(如)約15-50mg/ml(如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)。在凍干前可將用于凍干的組合物的pH調(diào)整為約6.1。本發(fā)明的多肽可與其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給藥。具體說，組合物通常包含疫苗佐劑。所述佐劑可選自TH1佐劑和TH2佐劑中的一種或多種，下面進(jìn)行進(jìn)一步論述。可用于本發(fā)明組合物的佐劑包括，但不限于丄才礦激質(zhì)游斂^激適合用作本發(fā)明佐劑的含礦物質(zhì)的組合物包括無機(jī)鹽、如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括無機(jī)鹽，如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如羥磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如參見參考文獻(xiàn)53的第8和9章]或不同無機(jī)化合物的混合物(如磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選地磷酸鹽過量)，該化合物采用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優(yōu)選吸附于鹽。含礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽顆粒[54]d典型的磷酸鋁佐劑為無定形羥基磷酸鋁，其PCVA1摩爾比為0.84-0.92，包括約0.6mgAl3+/ml?？梢圆捎玫蛣┝苛姿徜X進(jìn)行吸附，如每劑量每個(gè)偶聯(lián)物采用50-100txgAl3+。當(dāng)采用磷酸鋁并且不希望使抗原吸附于佐劑時(shí)，宜在溶液中包含游離磷酸根離子(如通過采用磷酸鹽緩沖液)。磷酸鋁的零電荷點(diǎn)(PZC)與磷酸基團(tuán)取代羥基的程度負(fù)相關(guān)，所述取代程度可能取決于用于以沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度。也可通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸離子=更偏酸性的PZC)或通過添加緩沖液如組氨酸緩沖液(使得PZC更偏堿性)來改變PZC。本發(fā)明采用的磷酸鋁的PZC通常為4.0-7.0，更優(yōu)選5.0-6.5，如約5.7。用于制備本發(fā)明組合物的鋁鹽懸液可以包含緩沖液(如磷酸鹽緩沖液或組氨酸緩沖液或Tris緩沖液)，但并非必須包含。所述懸液優(yōu)選為無菌且無熱原的。懸液可以含有游離水相磷酸根離子如其濃度是1.0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約lOmM的磷酸根離子。所述懸液還可包含氯化鈉。本發(fā)明可采用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。此時(shí)磷酸鋁比氫氧化鋁多，如重量比為至少2:1，如》5:1、》6:1、》7:1、》8:1、》9:1等。本發(fā)明疫苗中可含有鋁鹽，使A產(chǎn)的劑量為每劑量0.2-1.0mg。適合用作本發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包括鯊烯-水乳劑，如MF59(采用微流化機(jī)將5°/。鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%Span85制成亞微米顆粒)[參考文獻(xiàn)53的第10章；還參見參考文獻(xiàn)55-57,參考文獻(xiàn)58的第12章]。MF59用作FLUADtm流感病毒三價(jià)亞基疫苗的佐劑。所述乳劑宜包含檸檬酸根離子，如10mM檸檬酸鈉緩沖液。用于該組合物中的尤其優(yōu)選佐劑為亞微米水包油乳劑。本發(fā)明采用的優(yōu)選的亞微米水包油乳劑為鯊烯/水乳劑，任選地包含不同量的MTP-PE，如含有4-5%(重量/體積)鯊烯、0.25-1.0%(重量/體積)吐溫80(聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)、和/或0.25-1.0%的Span85(山梨聚糖三油酸酯)以及任選的N-乙酰胞壁?；?L-丙氨?；?0-異谷氨酰氨酰基七-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚?；?311-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳劑。參考文獻(xiàn)55和59-60中詳細(xì)描述了用于組合物的亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫刺激劑如胞壁酰肽?？梢圆捎悯徬⑸雍屯聹?0的乳劑。所述乳劑可包含磷酸鹽緩沖鹽水。還可包含Span85(如1%)和/或卵磷脂。這些乳劑可含有2-10%的鯊烯、2-10%的生育酚和0.3-3%的吐溫80，并且鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選《1，以提供更穩(wěn)定的乳劑。此類乳劑中的一種可以通過以下方法制備將吐溫80溶于PBS以獲得2%溶液，然后將90ml所述溶液與5gDL-a-生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后微流化所述混合物。得到的乳劑可含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴?？梢圆捎悯徬⑸雍蚑riton去污齊"(如TritonX-100)的乳劑?？梢圆捎悯徬⒕凵嚼娲?0和泊洛沙姆401("PluronicTML121")的乳劑。可用磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4配制所述乳劑。所述乳劑可用作胞壁酰二肽的遞送載體，并與蘇氨酰-MDP—起用于"SAF-1"佐劑[61](0.05-o/。丁hr-MDP、5%鯊烯、2.5%普朗尼克(Pluronic)L121和0.2%聚山梨醇80)。它還可以在沒有蘇氨酰-MDP的情況下用作"AF"佐劑[62](5%鯊烯、1.25。/。普朗尼克(Pluronic)L121和0.2%聚山梨醇80)。優(yōu)選進(jìn)行微流化。還可將完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)用作本發(fā)明佐劑。C.啟^劍##參考文淑W第22章_/皂苷制劑也可用作本發(fā)明的佐劑。皂苷為甾醇糖苷和三萜糖苷的異種組，其發(fā)現(xiàn)于廣泛的植物種類的樹皮、葉、莖、根甚至花中。分離自皂樹(2"http:///&"S，o冊(cè)n'",Molina)樹皮的皂苷作為佐劑已廣泛研究。在商業(yè)上，皂苷還可獲自麗花菝葜(5V",7flxom"ta)(墨西哥菝葜)、滿天星(G^;wo一/〃fl;^m'cw/flfa)(婚紗花)和月巴皂草0SV^onar/flOj^c/flmz/W(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21和脂質(zhì)制劑如ISCOM。皂苷組合物采用HPLC和RP-HPLC純化。已鑒定出采用這些技術(shù)特別純化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。優(yōu)選地，皂苷為QS21。制備QS21的一種方法示于參考文獻(xiàn)63。皂苷制劑還可包含甾醇，如膽固醇[64]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)53第23章]。ISCOM通常也包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知皂苷均可用于ISCOM。優(yōu)選地，ISCOM包含一種或多種QuilA、QHA和QHC。ISCOM在參考文獻(xiàn)64-66中進(jìn)一步描述。任選地，ISCOM不含另外的去污劑[67]。有關(guān)皂苷基佐劑的進(jìn)展的綜述可見參考文獻(xiàn)68和69。D.嫁毒沐或瘋毒摔厥粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含一種或多種來自病毒的蛋白，所述病毒任選結(jié)合磷脂或用磷脂配制。它們通常為不致病、不復(fù)制且通常不含有任何天然病毒基因組。所述病毒蛋白可由重組方法制備或從完整病毒中分離。這些適用于病毒體或VLP的病毒蛋白包括由如下病毒衍生的蛋白流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心蛋白或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒(Sindbis)、輪狀病毒、口蹄疫病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、諾沃克病毒(Norwalk)、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA噬菌體、Q0噬菌體(如外被蛋白)、GA噬菌體、fr噬菌體、AP205噬菌體、和Ty(如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl)。VLP在參考文獻(xiàn)70-75中進(jìn)一步討論。病毒體在參考文獻(xiàn)76中進(jìn)一步討論。￡.,智度或微生激好f激適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，如腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的非毒性衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和3-0-脫?；疢PL(3dMPL)。3dMPL為帶有4、5或6條酰化鏈的3脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A的混合物。優(yōu)選的"小顆粒"形式的3脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A在參考文獻(xiàn)77中公開。此類3dMPL"小顆粒"足夠小，能通過0.22"m膜進(jìn)行無菌過濾[77]。其它非毒性LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[78、79]。脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌來源的脂質(zhì)A的衍生物，如OM174。OM174在參考文獻(xiàn)80和81中進(jìn)行了描述。適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通過磷酸鍵與鳥嘌呤連接的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯現(xiàn)出免疫刺激性。CpG可包括核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸修飾并可為雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn)82、83和84公開了可能的類似物取代，如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷代替鳥苷。CpG寡核苷酸的佐劑效果在參考文獻(xiàn)85-90中進(jìn)一步討論。CpG序列可指向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[91]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，如CpG-AODN，或可更特異性地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，如CpG-BODN。CpG-A和CpG-BODN在參考文獻(xiàn)92-94中討論。優(yōu)選的CpG為CpG-AODN。優(yōu)選地，構(gòu)建CpG寡核苷酸使5'端能進(jìn)行受體識(shí)別。可選地，兩種CpG寡核苷酸以其3'端相連以形成"免疫聚體(immunomers)"。參見例如，參考文獻(xiàn)91和95-97。其它免疫刺激性寡核苷酸包括雙鏈RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選地，蛋白獲自大腸桿菌(大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素"LT")、霍亂("CT")或百日咳("PT")。采用脫毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑在參考文獻(xiàn)98中描述，作為腸道外佐劑在參考文獻(xiàn)99中描述。毒素或類毒素優(yōu)選為包含A和B亞基的全毒素形式。優(yōu)選地，A亞基包含脫毒突變；B亞基優(yōu)選不突變。優(yōu)選地，佐劑為脫毒LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。采用ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作為佐劑可參見參考文獻(xiàn)100-107。氨基酸取代的參比數(shù)字優(yōu)選根據(jù)參考文獻(xiàn)108中所列的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基的比對(duì)得到。式I、II或III化合物或其鹽也可以用作佐劑HO—，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>23如參考文獻(xiàn)109所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442，、'ER804680'、'ER804764，、'ER803022'或'ER804057'例如<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>0ER-803022:K乂i資源勞y^/適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)制劑包括細(xì)胞因子如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[1IO]等)[111]、干擾素(如干擾素Y)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1a(MIP-1a)和MIP-1P[112]。G.生激搭^*//7搭蘑搭^^/生物粘合劑和粘膜粘合劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化透明質(zhì)酸微球體[113]或粘膜粘合劑如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[114]。緒教微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選為可生物降解及無毒性物質(zhì)(如聚(a羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)材料形成的顆粒(即直徑在100nm-150"m的顆粒，更優(yōu)選直徑在~200nm-30um，最優(yōu)選直徑在500nm—10wm)，優(yōu)選具有丙交酯乙交酯共聚物，任選處理以具有帶負(fù)電表面(如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。/.應(yīng)廣沐(^參考,肅W靂/3,〃萄適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子如參考文獻(xiàn)115-117中所述。J.聚奢乙媒發(fā)//7衆(zhòng)奪乙^潔劍^/適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[118]。此類制劑進(jìn)一步包括結(jié)合有辛苯昔醇的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑[119]和結(jié)合有至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯昔醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[120]。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰醚、聚氧乙烯-S-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。K.鏵患〃尸C尸P磷腈佐劑包括參考文獻(xiàn)121和122中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷月青](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene],"PCPP")。丄.應(yīng)壁微適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(去甲MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-犯-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。似.欲增;^壁脈"AmWazo《w/"o/owe)眾#激咪唑并喹啉佐劑包括咪喹莫特("R-837")[123、124]、雷西莫特("R-848")[125]及其類似物；和它們的鹽(如鹽酸鹽)。關(guān)于免疫刺激性咪唑并喹啉的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在參考文獻(xiàn)126-130中找到。w.藏/e裙嚴(yán)基,眾^激硫代縮氨基脲化合物的例子以及適合用作本發(fā)明佐劑的化合物的配制方法、制備方法和篩選方法包括如參考文獻(xiàn)131所述的內(nèi)容。所述硫代縮氨基脲對(duì)刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(如TNF-a)特別有效。ag嚴(yán)廚眾^激色胺酮化合物的例子以及適合用作本發(fā)明佐劑的化合物的配制方法、制備方法和篩選方法包括如參考文獻(xiàn)132所述的內(nèi)容。所述色胺酮化合物對(duì)刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(如TNF-a)特別有效。尸.樣艘雄各種核苷類似物可用作佐劑，如(a)Isatorabine(ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷)及其前藥(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)如參考文獻(xiàn)133-135公開的化合物；(f)具有下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>R,和R2各自獨(dú)立地是H、鹵素、-NRaRb、-OH、d—6垸氧基、取代C,-6垸氧基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、CV,o芳基、取代C6—1(5芳基、C,-6烷基或取代C^垸基；R3不存在，或者是H、q—6烷基、取代Cl6院基、<36_1()芳基、取代<:6.1()芳基、雜環(huán)基或取代雜環(huán)基；R4和Rs各自獨(dú)立地是H、鹵素、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、-C(0)-Rd、Cl6院基、取代C^烷基、或結(jié)合在一起形成如114.5所示的5元環(huán)在^表示的化學(xué)鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合X,和X2各自獨(dú)立地是N、C、O或S;R8為H、鹵素、-OH、C,-6烷基、C2-6烯基、C2—6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-0-Rc、-O-(Cw烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;R9為H、d—6垸基、取代C,-6烷基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基或R9a，其中R9a為:~眾！RiO和Rh各自獨(dú)立地是H、鹵素、C!-6烷氧基、取代d—6垸氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自獨(dú)立地是H、C,-6烷基、取代Q—6烷基、-C(O)Rd、C6-,q芳基；Rc各自獨(dú)立地是H、磷酸、二磷酸、三磷酸、C,-6烷基或取代CL6烷基；Rd各自獨(dú)立地是H、鹵素、CL6烷基、取代Cl6院基、C,-6垸氧基、取代C,-6烷氧基、-NH2、-NH(Cw烷基)、-NH(取代d.6垸基)、-N(Q.6垸基)2、-N(取代d_6垸基)2、C6—1()芳基或雜環(huán)基；Re各自獨(dú)立地是H、6烷基、取代Q-6烷基、C6.h)芳基、取代CVk)芳基、雜環(huán)基或取代雜環(huán)基；Rf各自獨(dú)立地是H、d—6垸基、取代C,—6烷基、-C(0)Rd、磷酸、二磷酸或三磷酸；n各自獨(dú)立地是0、1、2或3;p各自獨(dú)立地是0、1或2;或^4-5表示的化學(xué)鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合或(g)(a)-(f)中任---項(xiàng)的藥學(xué)上可接受的鹽、(a)-(b)中任一項(xiàng)的互變異構(gòu)體、或所述互變異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽。e.遂，#錄凝無萃主紙游廢廣包含連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質(zhì)的佐劑包括TLR4拮抗劑E5564[136、137]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>SMIP包括N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2，N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺;2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2基](甲基)氨基]乙醇；乙酸2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2基](甲基)氨基]乙酯；4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氫-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；'N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l基}-2-甲基丙-2醇；l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l基]-2-甲基丙-2醇；N4，N4-二節(jié)基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-cI喹啉-2,4-二:胺。一種佐劑為由第一革蘭陰性菌制備的外膜蛋白蛋白體制備物和由第二革蘭陰性菌制備的脂糖類(liposaccharide)制備物的組合，其中所述外膜蛋白蛋白體和脂糖類制備物形成穩(wěn)定的非共價(jià)佐劑復(fù)合物。此類復(fù)合物包括"IVX-卯8"，它是由腦膜炎奈瑟球菌(A^ber/Gme"/wg/"&"外膜和脂多糖組成的復(fù)合物。它們已被用作流感疫苗的佐劑[138]。作為免疫刺激劑的其它物質(zhì)公幵于參考文獻(xiàn)53和58。有用的佐劑物質(zhì)還包括甲基肌苷5'單磷酸("MIMP")[139〗。一種多羥基化的吡咯烷士定化合物[140]，如下式化合物式中R選自氫，直鏈或支鏈的、未取代或取代的、飽和或不飽和的?；?、垸基(如環(huán)垸基)、烯基、炔基或芳基、或者其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物。例子包括，但不限于木麻黃素(casuarine)、木麻黃素-6-a-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黃素、7-表-木麻黃素、3,7-二表-木麻黃素等。Y菊糖[141]或其衍生物，如algammulin。參考文獻(xiàn)142中公開的化合物。參考文獻(xiàn)143中公開的化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氫異喹啉(tetrahydraisoquinoline，THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氮基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[144、145]、氫化鄰苯二甲酰胺(hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、異噁唑化合物、甾醇化合物、喹唑啉酮化合物、吡咯化合物[146]、蒽醌化合物、喹噁啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和吲哚化合物[147]。羅唑利賓(7-烯丙基-8-氧代鳥苷)[148]。陽離子脂類和(通常為中性的)共脂如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻酰氧基-溴化丙銨-二植垸?；字；?乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-雙-十二烷氧基-溴化丙銨-二油?；字；?乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制劑。優(yōu)選含有(±)^-(3-氨基丙基)-^>1-二甲基-2,3-雙(順式-9-四癸烯氧基)-1-丙銨鹽的制劑。本發(fā)明還包含上述一種或多種佐劑的組合。例如，以下組合物可用作本發(fā)明佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑[150];(2)皂苷(如QS21)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)[151];(3)皂苷(如QS21)+無毒性LPS衍生物(如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(可選地+甾醇)[152];(5)3dMPL與QS21和/或水包油乳劑的組合[153];(6)SAF，含有10%角鯊垸、0.4。/。吐溫80tm、5%普朗尼克嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，經(jīng)微流化形成亞微米乳劑或經(jīng)渦旋形成較大粒度的乳劑。(7)RibiTM佐劑體系(RAS)(Ribi免疫化學(xué))，其含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80，和選自下組的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分單磷酰基脂質(zhì)A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選為MPL+CWS(Detox);(8)—種或多種無機(jī)鹽(如鋁鹽)+無毒性LPS衍生物(如3dMPL);禾B(9)—種或多種無機(jī)鹽(如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(如包含CpG基序的核苷酸序列)。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地引起細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答以有效地應(yīng)對(duì)尿路病原性感染。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選地誘導(dǎo)出長效(如中和)抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力從而在遇到UPEC-相關(guān)抗原時(shí)能夠快速應(yīng)答。通常認(rèn)為兩類T細(xì)胞CD4和CD8細(xì)胞是啟動(dòng)和/或增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫和體液免疫必需的。CD8T細(xì)胞能夠表達(dá)CD8共受體，通常被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。CD8細(xì)胞能夠識(shí)別MHCI類分子呈現(xiàn)的抗原或與之相互作用。CD4T細(xì)胞可表達(dá)CD4共受體，通常被稱為T輔助細(xì)胞，CD4細(xì)胞能夠識(shí)別與MHCII類分子結(jié)合的抗原性肽。通過與MHCII類分子相互作用，CD4細(xì)胞可分泌諸如細(xì)胞因子這樣的因子。這些分泌的細(xì)胞因子可激活B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和參與免疫應(yīng)答的其它細(xì)胞。輔助T細(xì)胞或CD4+細(xì)胞可進(jìn)一步分成兩種功能不同的亞組TH1表型和TH2表型，其不同之處在于細(xì)胞因子和效應(yīng)器功能?；罨腡H1細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞免疫(包括增加抗原特異性CTL的產(chǎn)量)并因此對(duì)細(xì)胞內(nèi)感染的應(yīng)答具有特殊價(jià)值?；罨腡H1細(xì)胞可以分泌IL-2、IFN-Y和TNF-e中的一種或多種。TH1免疫應(yīng)答可通過激活巨噬細(xì)胞、NK(自然殺傷)細(xì)胞和CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)而導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)。TH1免疫應(yīng)答還可通過以IL-12來刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞的生長，從而擴(kuò)展免疫應(yīng)答。經(jīng)TH1剌激的B細(xì)胞可分泌IgG2a?；罨腡H2細(xì)胞增加抗體產(chǎn)生并因此對(duì)細(xì)胞外感染的應(yīng)答具有特殊價(jià)值?；罨腡H2細(xì)胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一種或多種。TH2免疫應(yīng)答會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生IgGl、IgE、IgA和記憶B細(xì)胞，用于將來的防衛(wèi)。增強(qiáng)的免疫應(yīng)答可包括增強(qiáng)的TH1免疫應(yīng)答和TH2免疫應(yīng)答中的一種或多種。增強(qiáng)的TH1免疫應(yīng)答可包括CTL增加，一種或多種TH1免疫應(yīng)答相關(guān)性細(xì)胞因子(如IL-2、IFN-Y和TNF-P)的增加、活化巨噬細(xì)胞的增加、NK活性的增加或IgG2a產(chǎn)量的增加中的一種或多種反應(yīng)。優(yōu)選地，增強(qiáng)的TH1免疫應(yīng)答包括IgG2a產(chǎn)量的增加。增強(qiáng)的TH2免疫應(yīng)答可包括一種或多種TH2免疫應(yīng)答相關(guān)性細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的增加、或IgGl、IgE、IgA和記憶B細(xì)胞的產(chǎn)量的增加中的一種或多種反應(yīng)。優(yōu)選地，增強(qiáng)的TH2免疫應(yīng)答包括IgGl產(chǎn)量的增加。采用TH1佐劑會(huì)引起TH1免疫應(yīng)答。TH1佐劑通常引起IgG2a產(chǎn)量相對(duì)于無佐劑抗原免疫增加。適用于本發(fā)明的TH1佐劑可包括例如皂苷制劑、病毒體和病毒樣顆粒、腸桿菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸，為優(yōu)選的用于本發(fā)明的TH1佐劑。采用TH2佐劑會(huì)引起TH2免疫應(yīng)答。TH2佐劑通常引起IgGl產(chǎn)量相對(duì)于無佐劑抗原免疫增加。適用于本發(fā)明的TH2佐劑包括例如含礦物質(zhì)的組合物、油乳劑和ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物。含礦物質(zhì)的組合物，如鋁鹽為優(yōu)選的適用于本發(fā)明的TH2佐劑。優(yōu)選地，本發(fā)明包括含有TH1佐劑和TH2佐劑的組合的組合物。優(yōu)選地，此類組合物引起增強(qiáng)的TH1和增強(qiáng)的TH2應(yīng)答，即相對(duì)于無佐劑免疫，IgGl和IgG2a的產(chǎn)量均有增加。更優(yōu)選地，包含TH1和TH2的組合的所述組合物相對(duì)于單佐劑免疫(即相對(duì)于單以THI佐劑或單以TH2佐劑進(jìn)行免疫)引起增強(qiáng)的TH1和/或增強(qiáng)的TH2免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可以是TH1免疫應(yīng)答和TH2免疫應(yīng)答中的一種或兩種。優(yōu)選地，免疫應(yīng)答為增強(qiáng)的TH1應(yīng)答和增強(qiáng)的TH2應(yīng)答中的一種或兩種。所述增強(qiáng)的免疫應(yīng)答可以是全身性和粘膜性免疫應(yīng)答中的一種或兩種。優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答為增強(qiáng)的全身性和增強(qiáng)的粘膜性免疫應(yīng)答中的一種或兩種。優(yōu)選地，粘膜性免疫應(yīng)答為TH2免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，粘膜性免疫應(yīng)答包括IgA產(chǎn)量的增加。尤其優(yōu)選采用氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑，抗原通常吸附于此類鹽。磷酸鈣為另一種優(yōu)選佐劑。本發(fā)明的組合物的pH優(yōu)選在6-8之間，優(yōu)選地為大約7。采用緩沖液維持pH的穩(wěn)定。當(dāng)組合物包含氫氧化鋁鹽時(shí)，優(yōu)選采用組氮酸緩沖液[154]。組合物可以是無菌和/或無熱原的。本發(fā)明的組合物可與人體等滲。所述組合物可裝在小瓶中，或者它們可裝在預(yù)填充的注射器中。所述注射器口丁以帶有或不帶有針頭。注射器包括單劑量的組合物，而小瓶可包括單劑量或多劑量?？勺⑸浣M合物通常為液體溶液或懸液?；蛘?，其可以固態(tài)形態(tài)存在(如凍干)，在注射前用液態(tài)載體溶解或懸浮。本發(fā)明的組合物可以單位劑量形式或以多劑量形式包裝。就多劑量形式而言，小瓶優(yōu)于預(yù)填充注射器?？梢猿Ｒ?guī)方法得到有效劑量體積，但注射用組合物的人體劑量一般為0.5ml。當(dāng)本發(fā)明的組合物需要在臨用前臨時(shí)制備(如一組分以凍干形式存放)并以藥盒形式存放時(shí)，所述藥盒可包括兩個(gè)小瓶，或者可包括一個(gè)預(yù)填充的注射器和一個(gè)小瓶，注射之前用注射器中的內(nèi)容物將小瓶中的內(nèi)容物再激活。因此本發(fā)明提供一種試劑盒，包括第一組分和第二組分，其中所述第一組分包含一種或多種本發(fā)明的多肽、抗體、小泡和/或核酸；所述第二組分包含下組中的一種或多種將組合物給予患者的說明書、注射器或其它遞送裝置、佐劑和/或藥學(xué)上可接受的配制溶液。本發(fā)明還提供一種預(yù)填充有本發(fā)明的免疫原性組合物的遞送裝置(如注射器)。用作疫苗的免疫原性組合物包括免疫學(xué)有效量的抗原、和其它任何所需組分。'免疫學(xué)有效量'指將所述量(以單劑量給藥或作為連續(xù)劑量的一部分給藥)給予個(gè)體能有效治療或預(yù)防。所述量取決于待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類組(如非人靈長類、靈長類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需保護(hù)程度、疫苗的劑型、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)狀況的評(píng)估和其它相關(guān)因素。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過常規(guī)試驗(yàn)確定的相對(duì)寬的范圍內(nèi)，每個(gè)劑量中每種腦膜炎球菌糖抗原的含量一般為每抗原1yg-10mg。齊激鄉(xiāng)本發(fā)明還提供一種治療患者的方法，包括給予患者治療有效量的本發(fā)明組合物?；颊呖赡茏陨硖幱诨荚摬〉娘L(fēng)險(xiǎn)中或可能為孕婦('母體免疫'[155])。本發(fā)明提供用作藥劑(如作為免疫原性組合物或作為疫苗)或用作診斷試劑的本發(fā)明的核酸、多肽、小泡或抗體。它還提供使用本發(fā)明的核酸、多肽、小泡或抗體來制造(i)治療或預(yù)防由ExPEC細(xì)菌引起的疾病和/或感染的藥劑；(ii)檢測針對(duì)ExPEC細(xì)菌的抗體是否存在的診斷試劑；禾卩/或(iii)能產(chǎn)生針對(duì)ExPEC細(xì)菌的抗體的試劑。所述ExPEC細(xì)菌可以是任何血清型或菌株。優(yōu)選地，所述ExPEC細(xì)菌為UPEC菌株。本發(fā)明可用于預(yù)防和/或治療疾病如菌血癥、腦膜炎、尿路感染、腎盂腎炎和/或膀胱炎等。本發(fā)明尤其適用于治療尿路感染。所述患者優(yōu)選為人。所述人優(yōu)選為成人(年齡在20-55之間)。打算施用于兒童或青少年的疫苗也可給予成人，(例如)以評(píng)估其安全性、劑量、免疫原性等。優(yōu)選女性患者，尤其優(yōu)選年齡在20-55歲有性生活的女性。另一組患者為年齡在12-20歲之間的女性，具體用于預(yù)防。其它可能的動(dòng)物患者包括犬，其可能為ExPEC攜帶者[156、157]。一種檢驗(yàn)治療性治療效果的方法包括在給予本發(fā)明組合物之后監(jiān)控感染情況。一種檢驗(yàn)預(yù)防治療效果的方法包括在給藥后監(jiān)控針對(duì)給予的多肽的免疫應(yīng)答情況。本發(fā)明的組合物的免疫原性可通過如下方法確定將它們給予測試對(duì)象(如12-16個(gè)月大的兒童、或動(dòng)物模型如小鼠模型)，然后確定包括ELISA效價(jià)(GMT)在內(nèi)的IgG的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。通常在給予該組合物大約4周后測定這些免疫應(yīng)答情況，并與給予組合物之前測定的值進(jìn)行比較。當(dāng)給予一個(gè)以上劑量的組合物時(shí)，可進(jìn)行一次以上的給藥后測定?？色@得各種UTI小鼠模型[如，參考文獻(xiàn)158和159-160]。給予多肽抗原為一種優(yōu)選的誘導(dǎo)免疫的治療方式。給予本發(fā)明的抗體為另一種優(yōu)選的治療方式。這種被動(dòng)免疫方式尤其適用于新生嬰兒或懷孕婦女。這一方法一般采用單克隆抗體，如人源化抗體或完整的人抗體。本發(fā)明的組合物通常直接給予患者。直接遞送可通過如下方式實(shí)現(xiàn)胃腸道外注射(如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或組織間隙)、直腸施用、口服(如片劑、噴霧劑)、陰道施用、局部施用、經(jīng)皮施用、經(jīng)皮膚施用、鼻內(nèi)施用、舌下施用、眼部施用、耳部施用、肺部施用或其它粘膜施用。優(yōu)選肌肉內(nèi)施用到大腿或上臂。注射可通過針頭(如皮下注射針頭)實(shí)現(xiàn)，然而還可使用無針注射。典型的肌肉內(nèi)劑量為0.5ml。本發(fā)明可用于引起全身性和/或粘膜性免疫。優(yōu)選地，所述全身性和/或粘膜性免疫表現(xiàn)為增強(qiáng)的TH1禾B/或TH2免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答包括IgGl禾口/或IgG2a和/或IgA的產(chǎn)量增加。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可用于初次免疫方案和/或用于加強(qiáng)免疫方案。加強(qiáng)劑量方案可接在初次劑量方案之后。在多劑量方案中，可采用同樣或不同的途徑，如胃腸道外初次免疫和粘膜加強(qiáng)免疫、粘膜初次免疫和胃腸道外加強(qiáng)免疫等給予各種劑量。初次劑量之間的合適間隔(如4-16周)、以及初次和加強(qiáng)免疫之間的合適間隔可用常規(guī)方法確定。例如，疫苗接種的初次療程包括l-10個(gè)單獨(dú)劑量，之后以維持和/或加強(qiáng)免疫應(yīng)答所必需的時(shí)間間隔給予其它劑量，例如，第二劑在l-4個(gè)月時(shí)給予，當(dāng)需要時(shí)，幾個(gè)月后給予后續(xù)劑量。細(xì)菌感染影響身體的各個(gè)部分，因此組合物可以制備成各種形式。例如，組合物可以制備為液體溶液或懸液形式的注射劑。還可制備適于在注射前溶解或懸浮于液體載體中的固體形式(如凍干或噴霧冷凍干燥的組合物)。該組合物可制備成局部給藥劑型，如軟膏劑、乳膏劑或粉末劑。該組合物可制備稱口服給藥劑型，如片劑或膠囊、噴霧劑或糖漿(任選地進(jìn)行調(diào)味)。所述組合物可制備成肺部給藥劑型，如使用細(xì)粉或噴霧的吸入器。所述組合物可制備成栓劑或陰道栓劑。所述組合物可制備成鼻、耳或眼給藥劑型，如噴霧劑、滴劑、凝膠或粉末[如參考文獻(xiàn)161和162]。所述組合物可以為藥盒形式，設(shè)計(jì)成臨近給予患者前重建成混合的組合物。此類藥盒可包括一種或多種液體形式的抗原和一種或多種凍干抗原。本發(fā)明的組合物可以在與其它疫苗基本上相同的時(shí)間(如在相同的醫(yī)療咨詢或問診期間)給予患者，如基本上與下述疫苗相同的時(shí)間麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百曰咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的b型流感嗜血桿菌(//./"/7"e"加e)疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗、滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗等。類似地，它們可在與抗生素，尤其是對(duì)UPEC有活性的抗生素化合物基本上相同的時(shí)間(如在相同的醫(yī)療咨詢或問診期間)給予患者。本發(fā)微合辦將貧微分本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明多肽和一種或多種下述其它抗原的組合物-腦膜炎奈瑟球菌(W.mem'"g/We"血清組A、C、W135禾P/或Y(優(yōu)選所有四種)的糖抗原，如在參考文獻(xiàn)163中公開的血清組C的寡糖[還參見參考文獻(xiàn)164]或參考文獻(xiàn)165中的寡糖。-腦膜炎奈瑟球菌血清組B的抗原，如參考文獻(xiàn)166-174等公開的抗原。-肺炎鏈球菌0^"/^0""^/"^附0"/06)的糖抗原[如175、176、177]。-甲肝病毒抗原，如滅活病毒[如178、179]。-乙肝病毒抗原，如表面抗原和/或核心抗原[如179、180〗。-丙肝病毒的抗原[如181]。-HIV抗原[182]。-白喉抗原，如白喉類毒素[如參考文獻(xiàn)183第3章]如CRM,97突變體。-破傷風(fēng)抗原，如破傷風(fēng)類毒素[如參考文獻(xiàn)183第4章]。-百日咳博德特菌(50^^//0perto^)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，任選地還與百日咳桿菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3混合[如參考文獻(xiàn)185和186]。-流感嗜血桿菌B(//aem，/7ia/"/7we/^fleS)的糖抗原[如164]。-骨髓灰質(zhì)炎抗原[如187、188]如IPV。-麻疹、腮腺炎禾n/或風(fēng)疹抗原[如參考文獻(xiàn)183第9、10和11章]。-水痘抗原。-流感抗原[如參考文獻(xiàn)183第19章]，如血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。流感抗原可衍生自大規(guī)模流行性(每年)流感毒株。流感抗原可衍生自有可能引起大規(guī)模爆發(fā)的毒株(即與目前循環(huán)毒株的血凝素相比具有新的血凝素的流感毒株，或者對(duì)家禽具有病原性并且有可能橫向傳播給人群的流感毒株，或?qū)θ司哂胁≡缘牧鞲卸局?。流感抗原可衍生自在雞蛋或細(xì)胞培養(yǎng)物中生長出來的病毒。-卡他莫拉菌(肘0^//"cator/zafe)的抗原[如189]。-無乳鏈球菌(&";^^0"^aga/acn'ae)(B型鏈球菌)的糖抗原。-無乳鏈球菌(&/^^0"^agfl/tf"&e)(B型鏈球菌)的蛋白抗原[如1卯-195]。-淋病奈瑟球菌(Mgo朋/^/2oeae)的抗原[如196-199]。-肺炎衣原體(677^附;^'0p朋wmom'ae)的抗原[如參考文獻(xiàn)200-206]或來自肺炎衣原體的抗原的組合[如207]。-沙眼衣原體(CWflm_y￡//arac/zomato)的抗原，或來自沙眼衣原體的抗原的組合[如208]。-牙齦炎卟啉單胞菌(尸ow;zFomomwg/"g/vfl/W的抗原[如209]。-狂犬病抗原[如210]，如凍千的滅活病毒[如211,RabAvert]。-副粘病毒如呼吸道合胞病毒0^￥[212、213])和/或副流感病毒(PIV3[214])的抗原。-炭疽桿菌(Bfl"7/w朋/zracW抗原[如215、216、217]。陽釀膿鏈球菌(&^/^coccw"oge"")(A型鏈球菌)的抗原[如191、218、219]。-金黃色葡萄球菌(5^;/^/0"^az^ew力的抗原[如220]。-黃病毒屬病毒的抗原，如黃熱病病毒、日本腦炎病毒、登格熱病毒的四種血清型、蜱傳播性腦炎病毒、西尼羅河病毒的抗原。-瘟病毒抗原，如經(jīng)典豬熱病病毒、牛病毒性腹瀉病毒和/或邊界病病毒的抗原。-細(xì)小病毒，如細(xì)小病毒B19的抗原。-人乳頭瘤病毒(HPV)抗原[221]。本組合物可包含一種或多種這些其它抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將本發(fā)明抗原與適用于經(jīng)設(shè)計(jì)能保護(hù)女性不得泌尿系統(tǒng)和/或性傳播疾病的疫苗中的一種或多種其它非大腸桿菌抗原混合。例如，所述抗原可與衍生自下組的抗原混合無乳鏈球菌、沙眼衣原體、淋病奈瑟球菌、乳頭瘤病毒和單純皰疹病毒。使用人乳頭狀瘤病毒抗原時(shí)，它們可能來自HPV16、HPV18、HPV6禾口/或HPV11中的一種或多種。優(yōu)選的淋球菌抗原包括ngsl3(OmpA)、OmpH、ngs576(肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶(PPI酶)蛋白)、ngs41和ngsl17中的一種或多種。優(yōu)選的HPV抗原包括HPV16、HPV18、HPV6和HPV11中的一種或多種。優(yōu)選的沙眼衣原體抗原包括下組的一種或多種CT045、CT089、CT242、CT316、CT381、CT396、CT398、CT444、CT467、CT547、CT587、CT823、CT761和這些抗原的特定組合，其公開于WO05/002619。優(yōu)選的肺炎衣原體抗原包括下組的一種或多種CPn0324、CPn0301、CPn0482、CPn0503、CPn0525、CPn0558、CPn0584、CPn0800、CPn0979、CPn0498、CPn0300、CPn0042、CPn0013、CPn0450、CPn0661、CPn0557、CPn0904、CPn0795、CPn0186和CPn0604以及這些抗原的特定組合，其公開于WO05/084306。優(yōu)選的GBS抗原包括GBS80、GBS104、GBS59、GBS67、GBS322和GBS276中的一種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗原組合與適用于經(jīng)設(shè)計(jì)能保護(hù)老年人或免疫削弱個(gè)體的疫苗中的一種或多種其它非大腸桿菌抗原混合。例如，所述抗原組合可與衍生自下組的抗原混合糞腸球菌(五WMococc^/aeca/^)、金黃色葡萄球菌(5"〖a//z少/ococci^awreiw)、表皮葡萄球菌(&a;/iy/ococci^e;fc/erm&)、銅綠假單胞菌(尸5ewfifowc^(xsflerwgz'"c^a)、嗜月市軍團(tuán)菌(Aeg/o"e〃a/wewmo;/n7a)、單核細(xì)胞增生禾U其i牛寺菌(^/Wen.amonoc;v/ogenes)、月畝月莫炎奈瑟球菌(iVe/^weWawem,"g/"(i/es)、荒感病毒和副流感病毒('PIV')。在需要時(shí)可對(duì)毒性蛋白抗原進(jìn)行脫毒(如通過化學(xué)和/或遺傳方法對(duì)百日咳毒素進(jìn)行脫毒[186])。該組合物中含有白喉抗原時(shí)，優(yōu)選還包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。類似地，在包含破傷風(fēng)抗原的情況下，優(yōu)選還包含白喉抗原和百日咳抗原。類似地，在包含百日咳抗原的情況下，優(yōu)選還包含白喉抗原和破傷風(fēng)抗原。因此優(yōu)選DTP組合物。糖抗原優(yōu)選為偶聯(lián)物形式。偶聯(lián)物的載體蛋白包括細(xì)菌毒素(例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素)、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[222]、合成肽[223、224]、熱激蛋白[225、226]、百H咳蛋白[227、228]、來自流感嗜血桿菌的蛋白D[229、230]、細(xì)胞因子[231]、淋巴因子[231]、流感嗜血桿菌蛋白、激素[231]、生長因子[231]、來自艱難梭菌(C.c/;y/d/e)的毒素A或毒素B[232]、攝鐵蛋白[233]、含有各種病原體衍生抗原的多個(gè)人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[234]例如N19蛋白[235]、肺炎球菌表面蛋白PspA[236]、肺炎球菌溶血素[237]等。優(yōu)選的載體蛋白為CRM197蛋白[238]。該組合物中各抗原的濃度一般為至少lyg/ml?？傮w而言，任何給定抗原的濃度都足以引起針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，抗原吸附于鋁鹽。拔發(fā)督上述免疫原性組合物包括來自UPEC的多肽抗原。作為將蛋白抗原用于本發(fā)明免疫原性組合物的替代方法，可以采用編碼該抗原的核酸(優(yōu)選為DNA，如質(zhì)粒形式)，以提供基于核酸免疫的組合物、方法和用途。目前核酸免疫已經(jīng)是一個(gè)成熟的領(lǐng)域(如，參考文獻(xiàn)239-246等)，已應(yīng)用于許多疫苗。編碼免疫原的核酸在被遞送到患者體內(nèi)后進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)的免疫原進(jìn)而刺激免疫系統(tǒng)?；钚猿煞滞ǔ２捎冒韵陆M件的核酸載體形式(i)啟動(dòng)子；(ii)編碼免疫原的序列，其操作性連接于所述啟動(dòng)子；和任選的(iii)選擇性標(biāo)記。優(yōu)選的載體還可包含(iv)復(fù)制起點(diǎn)；和(v)位于(ii)下游并與之操作性連接的轉(zhuǎn)錄終止子。通常，(i)和(v)為真核來源，而(iii)和(iv)為原核來源。優(yōu)選的啟動(dòng)子為病毒啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子。除了啟動(dòng)子外，該載體還可包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(如增強(qiáng)子)，其在功能上與啟動(dòng)子相互作用。優(yōu)選的載體包括立即早期CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，更優(yōu)選的載體還包括CMV內(nèi)含子A。啟動(dòng)子操作性連接于編碼免疫原的下游序列，從而對(duì)免疫原編碼序列的表達(dá)進(jìn)行控制。使用標(biāo)記時(shí)，其優(yōu)選在微生物宿主中(如在原核生物中、在細(xì)菌中、在酵母中)起作用。所述標(biāo)記優(yōu)選為原核選擇性標(biāo)記(如在原核啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)錄)。方便起見，標(biāo)記一般為抗生素抗性基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選為自主復(fù)制附加型載體或自主復(fù)制染色體外載體，如質(zhì)粒。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選地，所述復(fù)制起點(diǎn)在原核生物中有活性而在真核生物中無活性。因此，優(yōu)選的載體包括用于選擇該載體的原核標(biāo)記、原核性復(fù)制起點(diǎn)，還包括用于驅(qū)動(dòng)免疫原編碼序列轉(zhuǎn)錄的真核啟動(dòng)子。因此所述載體(a)在原核宿主中擴(kuò)增并選擇而不表達(dá)多肽，但(b)在真核宿主中表達(dá)而不擴(kuò)增。這種安排對(duì)核酸免疫載體很理想。本發(fā)明的載體可包含位于編碼序列下游的真核轉(zhuǎn)錄終止子序列。這將提高轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)編碼序列自身不具有聚腺苷酸化序列時(shí)，本發(fā)明的載體優(yōu)選具有該序列。優(yōu)選的聚腺苷酸化序列來自牛生長激素。本發(fā)明的載體可包含多克隆位點(diǎn)。除了編碼免疫原和標(biāo)記的序列外，該載體可包含第二真核編碼序列。所述載體在所述第二序列的上游還可包含IRES，以便從與免疫原相同的轉(zhuǎn)錄物翻譯出第二真核多肽。或者，所述免疫原編碼序列可以在IRES下游。本發(fā)明的載體可包含未甲基化CpG基序，如未甲基化DNA序列，它們的共同之處在于胞嘧啶后接鳥苷、側(cè)接兩個(gè)5'嘌呤和兩個(gè)3'嘧啶。這些DNA基序的非甲基化形式被證明為幾種類型的免疫細(xì)胞的有效刺激物?？梢园邢蚍绞竭f送載體。受體介導(dǎo)的DNA治療技術(shù)描述于(如)參考文獻(xiàn)247-252中。在基因治療方法中，以約100ng-200mg的DNA量給予含有核酸的治療組合物，以進(jìn)行局部給藥。在基因治療方法中，DNA濃度范圍還可以是約500ng-50mg、約1Pg-2mg、約5ug-500"g和約20ug-100"g。各種因素如作用方式(如提高或抑制編碼基因產(chǎn)物的水平)以及轉(zhuǎn)化和表達(dá)效力均被認(rèn)為會(huì)影響達(dá)到最終效力所需的劑量。當(dāng)需要在較大組織面積上表達(dá)得更多時(shí)，為了達(dá)到陽性治療結(jié)果，可能需要施用更大量的載體、或通過連續(xù)給藥方式再次施用同樣量載體、或多次施用于鄰近或附近組織部位。所有這些情況中，臨床試驗(yàn)中的常規(guī)試驗(yàn)可以確定達(dá)到最優(yōu)療效所需的特定范圍?？赏ㄟ^基因遞送載體進(jìn)行遞送載體。所述基因遞送載體可以是病毒或非病毒來源(大致參見參考文獻(xiàn)253-256)。用于遞送所需核酸并在所需細(xì)胞中的表達(dá)的病毒載體為本領(lǐng)域公知。示例性病毒載體包括但不限于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(如參考文獻(xiàn)257-267)、a病毒載體(如辛德比斯病毒載體、塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67;ATCCVR-1247)、羅斯河病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCCVR-923;ATCCVR-1250;ATCCVR-1249;ATCCVR-532);還可采用這些病毒的雜交體或嵌合體)、痘病毒載體(如牛痘病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、修飾的安卡拉牛痘病毒等)、腺病毒載體、和腺伴隨病毒(AAV)載體(如見參考文獻(xiàn)268-273)。還可采用與殺死的腺病毒相連的DNA進(jìn)行給藥[267]。還可采用非病毒遞送載體和方法，包括但不限于，單獨(dú)與殺死的腺病毒連接或不連接的聚陽離子凝聚DNA[如274]、配體連接的DNA[275]、真核細(xì)胞遞送載體細(xì)胞[如，參考文獻(xiàn)276-280]和核電荷(nucleiccharge)中和或與細(xì)胞膜發(fā)生融合。還可使用裸露DNA。示例性裸露DNA引入方式描述于參考文獻(xiàn)281和282中。可作為基因遞送載體的脂質(zhì)體(如免疫脂質(zhì)體)描述于參考文獻(xiàn)283-287中。其它方式描述于參考文獻(xiàn)288和289中。適用于本發(fā)明的其它非病毒遞送包括機(jī)械遞送系統(tǒng)，如描述于參考文獻(xiàn)289中的方式。而且，所述編碼序列及其表達(dá)產(chǎn)物可通過光聚合水凝膠物質(zhì)的沉積或采用電離輻射進(jìn)行遞送[如參考文獻(xiàn)290和291]?？捎糜谶f送編碼序列的其它基因遞送常規(guī)方法包括，例如，采用手持式基因轉(zhuǎn)移顆粒槍[292]或采用電離輻射以激活轉(zhuǎn)移基因[290和293],采用PLG(丙交酯-乙交酯共聚物)微粒遞送DNA為尤其優(yōu)選的方法，如，通過將DNA吸附到經(jīng)任選處理以具有負(fù)電荷表面(如用SDS處理)或正電荷表面(如用陽離子去污劑如CATB)的微粒上。瓶述所述術(shù)語"包含"涵蓋"包括"及"由...組成"，如"包含"X的組合物可僅由X組成或可包括其它附加物，如X+Y。涉及數(shù)值x的術(shù)語"約"指(例如)X土10。/0。所述術(shù)語"基本上"并不排除"完全地"，如"基本上不含"Y的組合物可以是完全不含Y。在需要時(shí)，術(shù)語"基本上"可從本發(fā)明的定義中省略。序列表中的氨基酸序列的N端殘基為由對(duì)應(yīng)核苷酸序列的第一個(gè)密碼子編碼的氨基酸。當(dāng)?shù)谝幻艽a子不是ATG時(shí)，應(yīng)該理解為當(dāng)密碼子為起始密碼子時(shí)應(yīng)該翻譯成甲硫氨酸，而當(dāng)該序列位于融合伙伴的C端時(shí)應(yīng)該翻譯為所示的非甲硫氨酸氨基酸。本發(fā)明特別公開并涵蓋序列表中每一種以N端甲硫氨酸殘基(如甲酰-甲硫氨酸殘基)代替任何所示非甲硫氨酸殘基的氨基酸序列。它還特別公開并涵蓋序列表中每一種從序列內(nèi)部的任何甲硫氨酸殘基開始的氨基酸序列。如h所述，本發(fā)明的核酸和多肽可包括如下序列(a)與序列表中公開的序列相同(即100%相同)的序列；(b)與序列表中公開的序列有序列相同性的序列；(c)與序列(a)或(b)相比，具有分離或連續(xù)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或IO個(gè)單核苷酸或氨基酸改變(缺失、插入、取代)的序列；和(d)當(dāng)采用逐對(duì)比對(duì)算法與序列表的特定序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，x個(gè)單體(氨基酸或核苷酸)的移動(dòng)窗口從起點(diǎn)(N端或5')移到終點(diǎn)(3'C端)，從而對(duì)延長至p個(gè)單體(p〉x)的比對(duì)而言，有p-x+l個(gè)此類窗口，每個(gè)窗口有至少x.y個(gè)相同的比對(duì)單體，其中x選自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、卯、100、150、200;y選自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99;并且當(dāng)x.y不是整數(shù)時(shí)四舍五入為整數(shù)。優(yōu)選的逐對(duì)比對(duì)算法為Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法[294],采用默認(rèn)參數(shù)(如開口開放罰分=10.0,開口延伸罰分=0.5，釆用EBLOSUM62評(píng)分距陣)的。用EMBOSS軟件包中的Needle工具很方便地實(shí)施該算法[295]。本發(fā)明的核酸和多肽還可能在序列(a)-(d)的N端/5'和/或C端/3'處連有其它序列。除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┑某Ｒ?guī)的化學(xué)方法、生物化學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和藥理學(xué)方法。此類技術(shù)已在參考文獻(xiàn)中得到充分闡述。見，如，參考文獻(xiàn)296-303等。實(shí)驗(yàn)下面是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方式的例子。所述例子僅為說明性使用，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。我們努力保證所用數(shù)值(如量、溫度等)的精確性，然而還是應(yīng)該允許一些實(shí)驗(yàn)性誤差和偏差。實(shí)施本發(fā)明的方式采用基于計(jì)算機(jī)的比較和預(yù)測工具鑒定596種多肽，其為(a)在至少兩種UPEC菌株中常見但在非病原性菌株中未找到的多肽，和(b)表面相關(guān)或膜相關(guān)性多肽。所述596種多肽列于表1，其氨基酸序列是序列表中的SEQIDNO:l-596。表l給出所述596種序列的'gi'(基因信息標(biāo)示符)登錄號(hào)[ll]，該信息可用來檢索如下信息(a)多肽的全序列數(shù)據(jù)庫記錄和(b)大腸桿菌基因組中對(duì)應(yīng)的編碼序列。例如，能夠以'26111674'在NCBIe/幼？z系統(tǒng)[304]中進(jìn)行查詢，得到一條記錄[305]，可點(diǎn)擊該記錄中的'CDS'鏈接，以獲得相應(yīng)的編碼序列[306]。由于本發(fā)明的多肽序列已經(jīng)能夠從公共數(shù)據(jù)庫中獲得，也可獲得其標(biāo)注的功能。在當(dāng)前注釋中，所述596種多肽中有些還沒有公認(rèn)的功能(如在數(shù)據(jù)庫中它們被標(biāo)注為M叚擬蛋白')。盡管本發(fā)明人并未闡明這些多肽的基本生物學(xué)功能，但現(xiàn)在本發(fā)明確實(shí)為這些多肽提供了可靠的應(yīng)用，即提供了本文所述的免疫原性組合物。表4報(bào)道了SEQIDNO:l-596與菌株MG1655[307]、W3110和DH10B的非病原性K12序列的最接近匹配。表5顯示在兩種不同的UPEC基因組間具有最強(qiáng)匹配的414種多肽(總共596種)，其中帶有下劃線的SEQIDNO為100%保守序列。剩下的182種多肽為在UPEC菌株之間保守性較低的多肽，因此，優(yōu)選表5中的多肽(尤其優(yōu)選帶有下劃線的多肽)。這596種序列中，優(yōu)選156種(表2)。表6顯示這156種序列的各種信息。由于其在非病原性菌株中不存在、表面相關(guān)、在至少兩種UPEC菌株中存在、以及從未被鑒定為抗原，選出了66種更優(yōu)選的抗原(表3)D選擇其中的19種進(jìn)行初步試驗(yàn)(表3中以'+'標(biāo)記)?？寺?、表達(dá)并純化所述多肽。所述純化抗原用于免疫小鼠，通過Western印跡、ELISA和FACS分析其血清，并用體外和體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步檢測。合適的體外試驗(yàn)包括檢測抗體誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌殺傷的能力和/或調(diào)理吞噬作用的活性、阻斷ExPEC菌株(或純化抗原)與人上皮細(xì)胞(如膀胱細(xì)胞)或其它細(xì)胞系結(jié)合的能力、和/或抑制大腸桿菌(如Kl菌株)粘附/侵入腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)的能力。合適的體內(nèi)試驗(yàn)包括在UTI小鼠模型(成年小鼠)中進(jìn)行主動(dòng)和/或被動(dòng)的全身性免疫和刺激、用大腸桿菌K1菌株刺激的5日齡大鼠中通過主動(dòng)或被動(dòng)免疫保護(hù)其不患菌血癥和腦膜炎、和用ExPEC菌株免疫和腹膜內(nèi)感染成年小鼠。所述蛋白對(duì)細(xì)菌生活周期的重要性通過建立等基因敲除突變體來進(jìn)行檢驗(yàn)。所述突變體還可用于確?？乖a(chǎn)生的血清對(duì)該抗原的特異性。采用微陣列研究表達(dá)模式。通過對(duì)來自多種不同ExPEC菌株的序列進(jìn)行測序來評(píng)估保守和變異。進(jìn)行試驗(yàn)以選出預(yù)測的表面暴露蛋白，其對(duì)UPEC菌株具有特異性并在非病原性菌株(共生菌株和試驗(yàn)菌株)中不存在。一旦選中，即表達(dá)并純化這些蛋白，并用于免疫小鼠。從參考文獻(xiàn)43中可知，大腸桿菌任一tol-pal基因的突變都會(huì)導(dǎo)致含有天然外膜蛋白的小泡的形成。通過比較UPEC菌株和非病原性菌株的小泡中存在的蛋白，可能選出一小組可用作潛在抗原的蛋白。界癰辰絲_^厲^葳^游air介導(dǎo)游基尿藻伊本方法為基于PCR的快速方法，用于使野生型大腸桿菌菌株中的tolR基因失活[30S]。簡單地說，步驟1由獨(dú)立擴(kuò)增靶基因(tolR)的上游和下游區(qū)域以及抗性標(biāo)記盒組成。將步驟1得到的兩種PCR產(chǎn)物與等摩爾濃度的AB盒的擴(kuò)增機(jī)器混合并進(jìn)行第二輪PCR(三元PCR)，以產(chǎn)生其上游和下游側(cè)接的500bp(或更長)部分與靶基因同源的抗性標(biāo)記盒。在步驟3中，將大量(lug)所需直鏈DNA電穿孔到入紅感受態(tài)細(xì)胞中。/力泡劍備aif過rc4沉淀虔y備V、泡用平板上培養(yǎng)的細(xì)菌接種LB培養(yǎng)基，在輕柔振搖下37。C過夜培養(yǎng)。用該培養(yǎng)物接種200mlLB使OD600KU。細(xì)菌生長到OD6000.4(或按規(guī)定)。培養(yǎng)物以4000Xg離心10分鐘，上清液通過0.22mm濾紙過濾以除去殘留細(xì)菌。在限鐵條件下往LB培養(yǎng)基中添加二吡啶基(Dipyridy1)(0.25mM)以進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。通過往培養(yǎng)物上清液中添加終濃度為10%的100。/。(重量/體積)TCA、0.4%(重量/體積)脫氧膽酸鹽來進(jìn)行沉淀。所述沉淀過程在4'C下進(jìn)行30分鐘。通過在4'C以20000Xg離心10分鐘回收沉淀。該沉淀以10G/。TCA(重量/體積)洗滌一次并用純乙醇洗滌兩次。所述沉淀用SpeedVac干燥并保存于-20。C。對(duì)野生型和突變型菌株進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，從中可以觀察到突變型菌株上清液中產(chǎn)生的條帶遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于野生型菌株。隨機(jī)選擇的條帶證實(shí)上清液中的所有蛋白均為膜蛋白。2.通過遊遂4^'以^備V、泡培養(yǎng)物的上清液在4"以200000Xg超速離心2小時(shí)。沉淀以PBS洗滌，重懸于PBS并保存于-2(TC。3.V、泡游M",性在進(jìn)行胍變性前，小泡用乙醇沉淀。通過加入冷的純乙醇到終濃度為90%沉淀PBS溶液中的10"gOMV。沉淀過程在-20。C下進(jìn)行20分鐘。通過13000Xg離心10分鐘回收沉淀。將該沉淀重懸于50ml6M胍、15mMDTT、200mMTris-HCl，pH8.0。變性過程在60"C下進(jìn)行60分鐘。消化之前，溶液用1.5MTrispH8.0溶液1/8稀釋并往所述稀釋溶液中添加5mg胰蛋白酶。消化過程在37'C過夜。通過添加終濃度為0.1%的甲酸終止反應(yīng)。所述肽用Oasis抽提試劑盒(cartridge)進(jìn)行抽提。通過LC耦連MS-MS分析肽。4.表厫派將5mg胰蛋白酶加入lOmg小泡的PBS溶液中，并在37'C孵育3小時(shí)。添加0.1。/。終濃度的甲酸終止反應(yīng)。通過30Kda截?cái)酁V器過濾回收肽，用Oasis抽提試劑盒進(jìn)行抽提。通過LC耦連MSMS分析肽。用Bradford法、以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蛋白定量。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)4-12。/。聚丙烯酰胺凝膠和Mini-proteanII電泳裝置分析樣品。將樣品懸浮于SDS樣品緩沖液中(0.06MTris-HClpH6.8、10%(體積/體積)甘油、2。/。(重量/體積)SDS、5%(體積/體積)2-巰基乙醇、10mg/ml溴酚藍(lán))并加熱到IO(TC5分鐘，然后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，凝膠用考馬斯藍(lán)染色。M4丄D/-rop質(zhì)譜激定從凝膠中將蛋白條帶和蛋白點(diǎn)切下，用50mM碳酸氫銨/乙腈(50/50,體積/體積)洗滌，并用SpeedVac離心(Savant)干燥。加入7-10ml含有5mM碳酸氫銨、0.012mg測序級(jí)胰蛋白酶的溶液干37'C消化干燥的蛋白點(diǎn)2小時(shí)。消化后，吸取0.6ml加到預(yù)點(diǎn)陣列靶(matrixpre-spottedtarget)上并空氣干燥。蛋白點(diǎn)用0.6ml含有70%乙醇、0.1%三氟醋酸的溶液洗滌。從超撓性(ultraflex)MALDI-TOF質(zhì)譜儀上獲得質(zhì)譜信息。色譜信息采用靶上預(yù)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品組合進(jìn)行外部校準(zhǔn)。采用Mascot程序?qū)|(zhì)量范圍在700-3,000Da內(nèi)的試驗(yàn)生成的肽的同位素單峰與計(jì)算機(jī)生成的指紋進(jìn)行自動(dòng)或手工比較以鑒定蛋白。二楚冶妖將200mg小泡重懸于Immobiline再溶脹溶液(7M尿素、2M硫脲、2%(重量/體積)CHAPS、(2。/。重量/體積)ASB14、2。/。(體積/體積)IPG緩沖液pH3-10NL、2mMTBP、65mMDTT)，并過夜吸附于7cmImmobilineDryStrip(pH3-10NL)。然后經(jīng)2維電泳分離蛋白。第一維電泳的進(jìn)行采用IPGphor等電位聚焦單位，連續(xù)施加150伏電壓35分鐘、500伏35分鐘、1，000伏30分鐘、2,600伏10分鐘、3,500伏15分鐘、4,200伏15分鐘，最后施加5,000伏至10kVh。對(duì)于第二維電泳，條帶在4M尿素、2M硫脲、30%甘油、2%SDS、5mMTBP、50mMTrisHC1pH8.8、2.5%丙烯酰胺、0.2%溴酚藍(lán)中孵育2次IO分鐘以平衡。然后，在線性4-12%預(yù)制聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白。凝膠用膠質(zhì)考馬斯藍(lán)染色，并用個(gè)人光密度計(jì)SI掃描。圖像用ImageMaster2DElite軟件進(jìn)行分析。肽由連接于裝有納米噴射源的Q-ToFMicroESI質(zhì)譜儀的CapLCHPLC系統(tǒng)上的納米LC進(jìn)行分離。通過一個(gè)C18收集柱(300umi.d.X5mm)將樣品裝入AtlantisC18NanoEase柱(100"mi,d,X100mm)。50分鐘內(nèi)用梯度從2%-60%的95%ACN的0.1%甲酸溶液進(jìn)行洗脫，流速400nl/分鐘。經(jīng)洗提的肽采用MassLynx軟件(4,0版)進(jìn)行自動(dòng)的數(shù)據(jù)依賴型釆集程序，其中用MS測量掃描在400-2,000的m/z范圍內(nèi)自動(dòng)選擇多電荷肽以進(jìn)行進(jìn)一步的MS/MS片段化。最多有3種不同組分同時(shí)進(jìn)行MS/MS片段化。采集到數(shù)據(jù)之后，用MassLynx對(duì)單個(gè)MS/MS色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行組合、校平和確定中心。通過MASCOT的授權(quán)版本的批量模式對(duì)肽進(jìn)行檢索和鑒定。所述MASCOT檢索參數(shù)為(l)種ExPEC(2)允許的切割失敗數(shù)目(僅針對(duì)胰蛋白酶水解)6;(3)可變的翻譯后修飾甲硫氨酸氧化；(4)肽容限士500ppm;(5)MS/MS容限土0.3Da和(6):肽電荷從+l到+4。就前述平臺(tái)而言，僅考慮由MASCOT概率分析確定的顯著命中。接受至少一種肽的蛋白測定結(jié)果的分?jǐn)?shù)閾值由MASCOT設(shè)定，胰蛋白酶消化的閾值為18，蛋白酶K消化的閾值為36。結(jié)榮上述分析的結(jié)果為，從CFT073菌株中鑒定了13種優(yōu)選抗原。艮口gi-26110S66(SEQIDNo489),gi。26109898(SEQIDNo597)，gi-2飾513(SEQIDNo120),gi-26108604(SEQIDNo59S),gi-26109137(SEQIDNo305),gi-26106493(SEQIDNo22),gi-26108194(SEQIDNo221),gi-26108192(SEQIDNo219)，gi-26109931(SEQIDNo400),gi-26111428(SEQEDNo565),gi-26109835(SEQIDNo371)，gi-26109S66(SEQIDNo599)和gi-26111414(SEQIDNo555)見表7。貧鮮橋全身感染游小廚漠，為了篩選由對(duì)病原性和非病原性大腸桿菌菌株進(jìn)行的比較基因組分析所選出來的大量抗原，建立了基于經(jīng)典毒力試驗(yàn)的保護(hù)模型。也可采用的其它試驗(yàn)?zāi)Ｐ桶ㄔ趨⒖嘉墨I(xiàn)158、159和160中描述的那些模型。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?免疫和感染)采用5周齡的CD1遠(yuǎn)交小鼠，采用腹膜內(nèi)接種有毒力的CFT073大腸桿菌菌株進(jìn)行刺激。刺激劑量通過試驗(yàn)確定為能夠在72小時(shí)內(nèi)殺死80%成年小鼠的細(xì)菌量，對(duì)CFT073菌株而言，該劑量對(duì)應(yīng)為7Xl(Tcfu/只小鼠。通過皮下注射150"l使用弗氏佐劑的蛋白溶液免疫小鼠3次，如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在第一次免疫前一天(免疫前血清)、第34天和第48天(刺激前一天)收集血樣，用western印跡和ELISA試驗(yàn)檢測免疫小鼠的血清以測定抗體效價(jià)。育激在第48天，用大腸桿菌CFT073的凍存液在LB瓊脂平板上劃線，在培養(yǎng)箱中于37'C培養(yǎng)過夜(ON)。在第49天用所述ON平板-培養(yǎng)物接種50mlLB培養(yǎng)基，直到OD.6QQ=0.1，并在37。C振搖培養(yǎng)1.5小時(shí)，直到細(xì)菌培養(yǎng)物達(dá)到OD.6。。=0.6，其對(duì)應(yīng)為7X108cfu/ml的CFT073菌株。培養(yǎng)物離心，將沉淀重懸于等體積的生理溶液中用作攻擊原液。用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法將培養(yǎng)物鋪板，以核實(shí)接種物。用lml注射器將含有7X10"CFT073細(xì)菌的100iU細(xì)胞懸液注射到對(duì)照和免疫小鼠的腹膜內(nèi)。記錄下感染24、48和72小時(shí)后每組動(dòng)物的死亡數(shù)。通過比較刺激72小時(shí)后小鼠疫苗接種組中的存活率和對(duì)照組中的存活率，來評(píng)估由于接種疫苗所獲得的保護(hù)。由下式計(jì)算相對(duì)于對(duì)照的存活率百分比疫苗組的存活率-對(duì)照組的存活率對(duì)照組的存活率錄榮用熱滅活的CFT073進(jìn)行免疫。如圖l所示，用熱滅活的CFT073免疫后，用CFT073刺激后小鼠的存活％有所增加。選擇抗原組合得到本發(fā)明組合物。BALB/c小鼠被分成9組并按照如下方式進(jìn)行免疫<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>以2周間隔免疫小鼠。最后一次免疫后2-3周，用合適的UPEC菌株刺激所有小鼠。當(dāng)采用粘膜免疫(如鼻內(nèi))時(shí)，也以粘膜方式刺激動(dòng)物模型以測試粘膜免疫原的保護(hù)效果。臨近刺激前，對(duì)小鼠采血以檢測針對(duì)所給予抗原的抗體的效價(jià)。就小鼠刺激而言，有毒力的細(xì)菌要在合適的培養(yǎng)基巾生長。通過離心收獲細(xì)菌，重懸，連續(xù)稀釋成剌激接種物。對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行刺激并在接觸后30天內(nèi)每天觀察。可以采用完整細(xì)菌和純化重組蛋白的ELISA試驗(yàn)來測定不同免疫方案產(chǎn)生的小鼠血清中的總IgG和IgGl/IgG2A亞型。而且，可通過多參數(shù)FACS分析評(píng)價(jià)分離自免疫接種小鼠的脾細(xì)胞和/或PBMC中的抗原特異性CD4+禾口CD8十Th細(xì)胞，以評(píng)估抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)情況。具體地，IFN-Y和1L-5的產(chǎn)量可在用純化抗原體外刺激T細(xì)胞之后進(jìn)行測量。此外，用各抗原/疫苗制劑免疫的小鼠的脾細(xì)胞和/或PBMC可以在最后一次免疫劑量后10-12天收集，并用UPEC細(xì)菌來刺激。經(jīng)過4小時(shí)的刺激之后，往后的12個(gè)小時(shí)內(nèi)往細(xì)胞中加入布雷菲德菌素A以阻斷細(xì)胞因子分泌。然后，固定細(xì)胞并用抗體染色，以檢測表達(dá)IFN-Y和IL-5的UPEC特異性T細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的各種方法從外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中分離T細(xì)胞。例如，可以通過去除輔助細(xì)胞和B細(xì)胞從PBL群中"富集"T細(xì)胞群。具體地，可使用抗MHCII類單克隆抗體清除非T細(xì)胞來富集T細(xì)胞。類似地，其它抗體可用丁消耗特定的非T細(xì)胞群。例如，抗Ig抗體分子可用于消耗B細(xì)胞，抗Macl抗體分子可用于消耗巨噬細(xì)胞。還可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)將T細(xì)胞分成許多不同的亞群。兩類主要的亞群可以基于其細(xì)胞表面標(biāo)記CD4和CD8的表達(dá)差異進(jìn)行分離。例如，在上述T細(xì)胞富集之后，可采用對(duì)CD4特異性的抗體富集CD4+細(xì)胞。所述抗體可以偶聯(lián)于固體支持物如磁珠上。相反地，CD8+細(xì)胞可使用對(duì)CD4特異性的抗體進(jìn)行富集(去除CD4+細(xì)胞)，或可使用偶聯(lián)于固體支持物的CD8抗體進(jìn)行分離。在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前或之后，可以離體擴(kuò)增感染UPEC的患者的CD4淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞純化之后，純化的T細(xì)胞用各種細(xì)胞因子(包括但不限于rlL-2、IL-IO、IL-12和IL-15)進(jìn)行預(yù)刺激，以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長和活化?？梢杂蒙鲜雒庖咴远嚯倪M(jìn)行活化UPEC特異性T細(xì)胞。UPEC特異性T細(xì)胞可以是CD8+或CD4+。UPEC特異性CD8+T細(xì)胞可以是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，其能殺死呈現(xiàn)與MHCI類分子復(fù)合的任何上述多肽或其片段的UPEC感染細(xì)胞。衣原體特異性CD8+T細(xì)胞可以通過如"Cr釋放試驗(yàn)進(jìn)行檢測。"Cr釋放試驗(yàn)檢測UPEC特異性CD8+T細(xì)胞裂解呈現(xiàn)一種或多種這些表位的靶細(xì)胞的能力。本發(fā)明還考慮了表達(dá)抗病毒物質(zhì)如IFNY的UPEC特異性CD8+T細(xì)胞，它們也可通過免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測，優(yōu)選用一種或多種上述UPEC多肽進(jìn)行體外刺激后對(duì)IFNY或類似細(xì)胞因子進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色來檢測。UPEC特異性CD4+T細(xì)胞可以通過淋巴增殖試驗(yàn)進(jìn)行檢測。淋巴增殖試驗(yàn)檢測UPEC特異性CD4+T細(xì)胞響應(yīng)于一種或多種上述多肽而增殖的能力。應(yīng)該理解，本發(fā)明僅通過實(shí)施例的方式進(jìn)行描述，可以在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)進(jìn)行改變。表1--599種病原性大腸桿菌序列g(shù)gggggggggggggggggggggggg卜gi-2S鄉(xiāng)3212S1063362S106390(SEQ2S1064鄰26106474.261064772610648026106493:-26106579f-2610658426106594;-26106597-26106524-26106627-2610663G-26106637..26106649-26106657-26貓62-26106S892S鄉(xiāng)705i-26106722i-26106931-26107049-26107053-2610722326107239261072472610725126107263gi-26107267-2610739326107455-26107465-2610747026107476gi-26107483-26107498-26107505-26107508-26鶴14-261075171-26107525h26107530-26107540-26107544-26107554-261D76防-25107588-26107693(SEQ!DNO:1)(SEQIDNO:4)iDNO:7〉(SEQIDNO:10)(SEQIDNO:13)(SEQ;DNO:16)(SEQIDMO:19)(SEQIDNO:22〗(SEQIDNO:25)JSEQiDWO:28;(S￡QIDNO:31)JSEQ!DNO:34}(SEQtDWO:37)(SEQfDNO:40)(SEQIDNO:43)(SEQIDNO:46)(SEQtDNO:49)(SEQDNO:52)(SEQ!DNO:55)(SEQNO:58)(SEQ(DNO:S1J(SEQDNO:64)(SEQIDNO:67)(SEQIDNO:70)(SEQIDNO:73)JSEQ(DNO:7S)(SEQIDNO:79)(SEQIDNO:82)JSEQ(DMO:85;(SEQIDNO:83)(SEQIDNO:91)(SEQIDNO:94)(SEQIDNO:97}(SEQ,O:側(cè))(SEQIDNO:103)(SEQIDNO:106)(SEQK)MO:109)(SEQIDNO:112)(SEQIDNO:V〗5)(SEQIDNO:1化;(SEQ闘0:121)(SEQIDNO:124;(SEQIDNO:127)(SEQIDNO:130)JSEQIDNO:133)(SEQIDNO:136)(SEQIDNO:139)(SEQIDNO:142)(SEQIDNO:145)(SEQID船148)gi-2S106323(SEQiDMO:2)gi-26106340JSEQIDMO:5)gi-26106403JSEQIDNO:8Jgi-2柳6449(SEQIDNO:11)gi-26106475(SEQIDNO:14)g"26106478(SEQIDNO:17)gi-2610柳3JSEQIDNO:20)gi-26106557(SEQIDNO:23igi-2S106582(SEQIDNO:26)gi-26106585isEQIDNO:29)gi-26106595JSEQIDNO:32)gi-26106598(SEQIDNO:35Jgi-26106525JSEQIDNO:38;gi-26106S28(SEQIDNO:4"gi-26106633(SEQIDNO:44)gi-2S106645(SEQIDNO:47)gi-2引06652(SEQIDNO:50)gi-26106558(SEQIDNO:53)gi-26106663(SEQIDNO:56)g"26106690(SECHDNO:59)gi-2S10670S(SEQ!DNO:S2)gi-26106723(SEQ!DNO:65)g;-26107030JSEQIDNO:68)gi-2引07050isEQiDNO:71)gi-26簡67(SEQIDNO:74)gi-26107228(SEQIDNO:77)gi-26107241JSEQIDNO:80;gi-26107248(SEQIDNO:83)gi-26107258(SEQIDNO:86)gi-26107265(SEQIDNO:89)g!'-2,269JSEQIDNQ:92;gi兩2S107451(SEQIDNO:95)gi-26107459JSEQIDNO:98)gi-26107468(SEQIDNO:1CH)gi-26107471(SEQIDNO:104)gi陽2證477(SEQIDNO:107)gi-2S107484(SEQIDNO:110)g咖07棚(SEQIDNO:113)g〗-2S107506(SEQIDNO:116)gi-26107509(SEQIDNO:119)gi-26107515JSEQIDNO:122)gi-26107518(SEQIDMO:125)gi-26107528(SEQIDNO:128)gi-2S107534(SECHDNO:131)gi-26107541(SEQIDNO:1斜igi-25107548(SEQIDNO:137)g"2610757S(SEQIDNO:140)gi-2S107673(SEQIDNO:143)gi-26107690(SEQIDNO:146)gW6107698(SEQIDNO:149)gi-2610,5(SEQIDNO:3〉gi-25雷348(SEQ!DNO:6)gi-26106445(SEQIDNO:^gi-26106454(SEQIDNO:12)gi-2S106476JSEQIDNO:15;gi-2S鵬79(SEQJDNO:18)gi-26106492(SEQ!DNO:21)gj-26106569(SEQ)DNO:24)gi-2S鵬83(SEQIDNO:27)gi-2610防92JSEQ!DNO:30》gi-2610肪96(SEQIDNO:33)gi-26lOSK)1JSEQ!DNO:36)gi-2610祐2SJSEQ!DNO:39)g園鵬29(SEQIDNO:42〉gi-26W6635(SEQ!DNO:45)gi-2610,(SEQIDNO:48)gi-26106S56(SEQIDNO:51)gi-2謹(jǐn),(SEQ!DNO:54〉gi-2610郎64(SEQIDNO:57)gi-2S106S94(SEQIDNO:60)gi-2S106710(SEQIDNO:S3)gi-26WS740(SEQIDNO:66)gi-26謂4SJSEQIDNO:69)gi-26107051JSEQIDNO:72)gi-26107097JSEQIDNO:75)gi-26107235(SEQIDNO:78)gi-2,72鄰isEQIDW。8ligi-26107249(SEQIDNO:84)gi-261072叨(SEQIDNO: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30、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598和599；(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80％的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80％并包含氨基酸序列(a)中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。2.—種多肽，其包含(a)選自下組的氨基酸序列SEQIDN022、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598和599;(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%并包含氨基酸序列(a)中至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述片段包含至少一個(gè)(a)的B細(xì)胞表位。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽，將其用于藥物。5.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽與藥學(xué)上可接受的載體的混合物。6.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含兩種或多種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽與藥學(xué)上可接受的載體的混合物。7.如權(quán)利要求5或6所述的組合物，還包含免疫佐劑。8.—種免疫原性組合物，其包含一種或多種表達(dá)或過表達(dá)含有如下成分的一種或多種多肽的外膜泡(OMV):(a)選自下組的氨基酸序列SEQIDN022、120、219、221、305、371、400、489、555、565、597、598和599;(b)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%的氨基酸序列；(c)作為氨基酸序列(a)中至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；或(d)與氨基酸序列(a)的序列相同性至少為80%并包含氨基酸序列(a)中至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。9.如權(quán)利要求8所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述片段包含至少一個(gè)(a)的B細(xì)胞表位。10.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽或者如權(quán)利要求8或9所述的免疫原性組合物在制備用于在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物的應(yīng)用。11.一種在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述患者如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合物或者如權(quán)利要求8或9所述的免疫原性組合物的步驟。12.如權(quán)利要求IO所述的應(yīng)用、或如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答保護(hù)個(gè)體免受ExPEC感染。全文摘要本文公開了可包含在對(duì)病原性大腸桿菌(E.Coli)菌株特異性的免疫原性組合物中的各種基因。所述基因來自尿路病原性菌株，但不存在于非病原性菌株中，并且其編碼蛋白的細(xì)胞定位使它們可受免疫系統(tǒng)的影響。文檔編號(hào)C07K14/245GK101180312SQ200680009326公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年2月17日優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日發(fā)明者F·博蘭達(dá)斯科薩,L·塞里諾,M·皮薩,V·馬西格納尼申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷公司