專利名稱：血管生成素與λ晶體蛋白相互作用的分子結(jié)合域的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及血管生成素(Ang)與λ晶體蛋白相互作用的分子結(jié)合域。
背景技術(shù)：
研究表明，血管生成素(Angiogenin，Ang)具有顯著促進(jìn)微血管新生的能力，在多種腫瘤患者中的表達(dá)水平都顯著升高。同時(shí)還參與卵巢中的形態(tài)學(xué)變化和血管新生。此外，它還具有一些非血管新生方面的功能，其中包括抑制中性粒細(xì)胞的脫粒作用；通過平滑肌細(xì)胞刺激膽固醇酯化(這可能與早期動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān))；在肝臟中具有一些非確定性作用，可能包括通常的自穩(wěn)機(jī)制。隨著其氨基酸序列的闡明，發(fā)現(xiàn)它與胰腺RNA酶具有較高的同源性，認(rèn)為它屬于有特殊生物學(xué)功能的RNA酶家族成員。
血管新生在人與動(dòng)物腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)分子一直是人們尋找的目標(biāo)，鑒于Ang具有強(qiáng)烈的促進(jìn)血管生成的作用，同時(shí)還由于其參與了多種可能的生理和病理過程，因此它的信號(hào)通路一直是各國(guó)學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題，但目前關(guān)于Ang的受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍不明確。我們通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)Ang與λ晶體蛋白具有相互作用，而且這一結(jié)果在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)得到了驗(yàn)證。
人的λ-晶體蛋白，最早從兔的晶狀體中分離得到，其亞單位分子量約為35kD。Northern和Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，λ-晶體蛋白并不是晶狀體中所特有，在心臟、肝臟、腎臟和脾等組織中均有其表達(dá)，但相對(duì)量較低。其在體內(nèi)的功能尚不清楚，推測(cè)其可能與調(diào)控陽離子運(yùn)輸有關(guān)，而且λ-晶體蛋白本身可能具有酶的活性；另外，它除了具有特征性的β-α-β折疊結(jié)構(gòu)，還具有DNA結(jié)合域，目前有關(guān)人的λ-晶體蛋白的報(bào)道還很少。最近的研究結(jié)果表明，通過核轉(zhuǎn)位途徑Ang進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并最終與DNA結(jié)合介導(dǎo)相關(guān)的生物學(xué)功能。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Ang與λ-晶體蛋白蛋存在相互作用，而λ-晶體蛋白具有DNA結(jié)合域，這是否提示Ang與DNA的結(jié)合是通過λ-晶體蛋白所介導(dǎo)的呢？他們之間的相互作用的特征及方式尚有待深入的探討，這類研究的繼續(xù)和深入將為闡明Ang在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明人利用生物信息學(xué)模建了Ang的三維結(jié)構(gòu)，并在其指導(dǎo)下構(gòu)建了系列相關(guān)位點(diǎn)缺失的突變體，然后利用酵母雙雜交技術(shù)分析了系列突變體與λ-晶體蛋白相互作用的變化，發(fā)現(xiàn)了影響Ang與λ-晶體蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸序列，確定了該兩種蛋白相互作用的分子結(jié)合域，即Ang的N端3-5位氨基酸對(duì)與λ-晶體蛋白的結(jié)合是必須的。
具體來說，本發(fā)明的目的之一是提供Ang與λ晶體蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸序列…N3S4R5…。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是揭示Ang與λ晶體蛋白的相互作用，并經(jīng)此相互作用導(dǎo)致的生理和病理功能；揭示以Ang與λ晶體蛋白復(fù)合物作為靶標(biāo)進(jìn)行的血管新生抑制和腫瘤治療策略。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是要求保護(hù)針對(duì)該結(jié)合域的拮抗劑、抗體或各種類型的突變體。
這一結(jié)果對(duì)于研究Ang的信號(hào)通路，也為今后利用阻斷Ang與λ-晶體蛋白相互作用介導(dǎo)的生物功能進(jìn)行臨床疾病的治療奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為以阻斷血管新生為藥靶的藥物設(shè)計(jì)和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。


圖1.誘餌蛋白質(zhì)粒pAS2-1-Ang的酶切鑒定圖譜1.pAS2-1；2.pAS2-1-Ang；3.核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2.pAS2-1-Ang的轉(zhuǎn)錄活性分析結(jié)果；圖3.7個(gè)陽性克隆β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4.篩選出的AD質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜1.DNA Maker；2. 5#克?。?. 19#克??；4. 4#克隆；5. 4#-2克隆克??；6. 3#克??；7. 2#克隆；8. 1#克?。?
圖5. 1#克隆的序列分析結(jié)果；圖6.用抗-MYC進(jìn)行沉淀的Western結(jié)果1. 5#候選蛋白；2. 3#候選蛋白；3. 2#候選蛋白；4. 1#候選蛋白；圖7.誘餌蛋白載體pAS2-1-Ang-N的酶切鑒定圖譜1.pAS2-1-Ang3-111；2.pAS2-1-Ang6-111-M；3.pAS2-1-Ang6-111；4.pAS2-1-Ang6-113；5.pAS2-1-Ang1-123-M；6.DL2000 Maker；7.pAS2-1-Ang6-123；8.pAS2-1-Ang1-111；9.pAS2-1-Ang3-113；10.pAS2-1-Ang3-113-M；圖8.1#克隆與Ang突變體共轉(zhuǎn)化后β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖具體說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)材料1.1菌株酵母宿主菌Y190購自Clontech公司，E.coli DH5為中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所保存菌種。
1.2質(zhì)粒對(duì)照質(zhì)粒pCL1、pVA3-1、pTD1-1、pLAM5′-1、pACT2，含酵母轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性區(qū)(AD)、標(biāo)簽質(zhì)粒pCMV-HA和pCMV-MYC均為clontech公司產(chǎn)品，pT-Ang為中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所構(gòu)建。
1.3酶與生化試劑BamH I、EcoR I和T4 DNA連接酶、小提、大提質(zhì)粒試劑盒購自美國(guó)Promega公司；YEASTMAKER Yeast Transformation system試劑盒及human fetal hepatic MATCHMAKER cDNA library，簡(jiǎn)稱酵母cDNA文庫均為clontech公司產(chǎn)品；3-AT購自Sigma公司。HA單克隆抗體和MYC單克隆抗體購自Clontech公司；1.4培養(yǎng)基及主要試劑配制YPD培養(yǎng)基5gYPD粉末(Clontech公司)溶于100毫升去離子水中，121℃高壓滅菌15分鐘，室溫保存。制平板時(shí)，每百毫升培養(yǎng)基加2克瓊脂，4℃保存。
SD/-Leuminimal SD base(clontech)2.67g，--Leu DO Supplement 0.074g溶于100毫升水中，制平板時(shí)，加2克瓊脂。121℃高壓滅菌15分鐘，4℃保存。
SD/-Trpminimal SD base(clontech)2.67g，-Trp DO Supplement 0.074g溶于100毫升水中，制平板時(shí)，加2克瓊脂。121℃高壓滅菌15分鐘，4℃保存。
SD/-Hisminimal SD base(clontech)2.67g，-His DO Supplement 0.074g溶于100毫升水中，制平板，再加2克瓊脂。121℃高壓滅菌15分鐘，4℃保存。
SD/-Leu-Trp-Hisminimal SD base(clontech)2.67g，-Trp DOSupplement 0.074g溶于100毫升水，制平板，加2克瓊脂。121℃滅菌15分鐘，4℃保存。
10ml PEG/LiAc溶液配制8ml50％PEG，10xTE1ml，10x LiAc1ml。Z buffer1L含Na2HPO4·7H2O 16.1g，Na2HPO4·H2O 5.50g，KCl 0.75g，MgSO4·7H2O 0.2461.5實(shí)驗(yàn)器材低溫離心機(jī)，Beckman公司產(chǎn)品；超凈臺(tái)、恒溫箱、恒溫?fù)u床等為國(guó)產(chǎn)。
2.實(shí)驗(yàn)方法及研究結(jié)果2.1誘餌蛋白質(zhì)粒pAS2-1-Ang的構(gòu)建及鑒定將酶切后所獲Ang片段與pAS2-1進(jìn)行連接，的連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5，隨機(jī)挑選菌落培養(yǎng)后，小提質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定篩選陽性克隆(圖1)。
2.2誘餌蛋白質(zhì)粒pAS2-1-Ang的轉(zhuǎn)錄活性分析將pAS2-1-Ang轉(zhuǎn)入酵母宿主Y190中，同時(shí)作陽性和陰性對(duì)照以確保雙雜交系統(tǒng)的正確性。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pAS-Ang的Y190在二缺和三缺平板上不能生長(zhǎng)。從SD/-Trp平板上挑選生長(zhǎng)良好的菌落作β-gal分析，菌落在8小時(shí)后不變藍(lán)(圖2)，提示構(gòu)建的誘餌蛋白沒有轉(zhuǎn)錄激活活性，因此可用于下一步篩選Ang的相互作用蛋白。
2.3大規(guī)模轉(zhuǎn)化文庫質(zhì)粒及文庫篩選進(jìn)行大規(guī)模文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)后，在三缺培養(yǎng)基上共挑選150個(gè)菌落作β-半乳糖苷酶顯色分析，獲得22個(gè)陽性克隆，通過去除無效AD質(zhì)粒后，挑選其中7個(gè)陽性克隆(即HIS、LacZ雙陽性克隆，圖3)，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)鑒定分析有兩對(duì)條帶大小非常一致，共選擇6個(gè)克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果又有一對(duì)重復(fù)，至此，我們共獲得5個(gè)雙陽性AD。
2.4從雙陽性克隆中分離陽性AD質(zhì)粒2.4.1去除無效AD質(zhì)粒將篩選出的雙陽性克隆，劃線于SD/三缺(15mM 3AT)平板上，挑單克隆菌落接種于SD/三缺液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，220rpm，當(dāng)OD600值達(dá)到0.2～0.3時(shí)，加3AT至終濃度15mM，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；再轉(zhuǎn)接到SD/三缺(15mM 3AT)液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，220rpm；當(dāng)OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，重新劃線于SD/三缺(15mM 3AT)平板上，挑單克隆菌落作β-半乳糖苷酶分析，保存顯色反應(yīng)陽性的克隆。
2.4.2從酵母中提取AD質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌將已去無效AD質(zhì)粒的陽性克隆，接種于3ml SD/-Leu，30℃培養(yǎng)2～3天后，取2ml菌液，12000rpm，5分鐘，棄上清，用殘液重懸細(xì)胞，提取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后用promega公司產(chǎn)試劑盒提取質(zhì)粒、保存菌種。
2.5鑒定篩選分離出的陽性AD質(zhì)粒2.5.1酶切鑒定在AD文庫質(zhì)粒中，所有插入片段兩端載體上均有提供鑒定用的Bgl II酶切位點(diǎn)。據(jù)此可以了解篩選出的陽性克隆中所插入的cDNA的長(zhǎng)度，并與PCR結(jié)果比較，排除重復(fù)結(jié)果。
結(jié)果顯示，1#質(zhì)粒切下一個(gè)約1000bp片段；2#、質(zhì)粒切下兩個(gè)片段分別為700bp和1600bp左右的片段；3#質(zhì)粒切下一約1400bp片段；4#和4-2#質(zhì)粒切下一約1800bp片段；5#質(zhì)粒切下一約1900bp片段；19#質(zhì)粒切下一約1900bp片段。我們選擇1#質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列分析。
2.5.2篩出的AD質(zhì)粒的序列分析鑒定后的1#陽性克隆質(zhì)粒送交上海博亞生物公司測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果如下CGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCTCTATGGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTAGCTTGGGTGGTCATATGGCCATGGAGGCCCCGGGGATCCGAATTCGCGGCCGCGTCGACCCGCTGGTTGAGCTGGTCCCCCACCCGGAGACGGCCCCTACGACAGTGGACAGAACCCACGCCCTGATGAAGAAGATTGGACAGTGCCCCATGCGAGTCCAGAAGGAGGTGGCCGGCTTCGTTCTGAACCGCCTGCAATATGCAATCATCAGCGAGGCCTGGCGGCTAGTGGAGGAAGGAATCGTGTCTCCTAGTGACCTGGACCTTGTCATGTCAGAAGGGTTGGGCATGCGGTATGCATTCATTGGACCCCTGGAAACCATGCATCTCAATGCAGAAGGTATGTTAAGCTACTGCGACAGATACAGCGAAGGCATAAAACATGTCCTACAGACTTTTGGACCCATTCCAGAGTTTTCCAGGGCCACTGCTGAGAAGGTTAACCAGGACATGTGCATGAAGGTCCCTGATGACCCGGAGCACTTAGCTGCCAGGAGGCAGTGGAGGGACGAGTGCCTCATGAGACTCGCCA2.6核酸序列分析和同源性檢索測(cè)序結(jié)果通過INTERNET進(jìn)行同源性分析，以美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)作為主要的檢索工具，網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov。對(duì)比數(shù)據(jù)庫主要有(1)NCBI的NR庫包括Genbank，EMBL(European Molecular Biological Laboratory)、DDBJ(DNADatabase of Japan)以及PDB(Protein Database)所收錄的所有非冗余(Non-Redundant)序列；(2)NCBI的EST庫。檢索主要采用的工具BLASTN。
1#克隆序列在nr數(shù)據(jù)庫中的同源檢索RID977364863-29839-8171Query＝(472 letters) ScoreESequences producing significant alignments(bits)Value
ref|XM 007167.1|Homo sapiens lambda-crystallin(LOC51084)，...9360.0gb|AF160216.1|AF160216Homo sapiens lambda-crystallin mRNA，...9360.0dbj|AK024041.1|AK024041Homo sapiens cDNA FLJ13979 fis，clo...9360.0ref|NM 015974.1|Homo sapiens lambda-crystallin(LOC51084)，...8940.0gb|AF077049.1|AF077049Homo sapiens lambda-crystallin mRNA，...8940.0gb|M22743.1|RABCRYLO.cuniculus lambda-crystallin mRNA，com...381e-103>gb|AF160216.1|AF160216Homo sapiens lambda-crystallin mRNA，completecdsLength＝1430Score＝936 bits(472)，Expect＝0.0Identities＝472/472(100％) Strand＝Plus/Plus由同源檢索的結(jié)果看出，我們所篩出的1#候選蛋白與人λ-晶體蛋白的同源性高達(dá)100％。λ-晶體蛋白并不是晶狀體中所特有，在心臟、肝臟、腎臟和脾等組織中均有其表達(dá)，推測(cè)其可能與調(diào)控陽離子運(yùn)輸有關(guān)，而且λ-晶體蛋白本身可能具有酶的活性；另外，它除了具有特征性的β-α-β折疊結(jié)構(gòu)，還具有DNA結(jié)合域。
2.7 Ang能與相互作用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的驗(yàn)證2.7.1 pCMV-HA-Ang和pCMV-MYC-λP的構(gòu)建及鑒定用Sfi I和Sal I分別雙切pAS2-1-Ang和pCMV-HA，回收Ang片段和pCMV-HA，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒后酶切挑選陽性克隆，酶切結(jié)果表明我們正確構(gòu)建了pCMV-HA-Ang。
用Sfi I和Xho I分別對(duì)標(biāo)簽質(zhì)粒和1#文庫質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后回收候選蛋白基因和標(biāo)簽質(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，提取質(zhì)粒后篩選陽性克隆，并通過雙酶切進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，我們獲得了正確的各種pCMV-MYC-λP。
2.7.2免疫共沉淀和Western雜交結(jié)果采用免疫共沉淀和雜交方法其一是用抗-HA抗體進(jìn)行沉淀，用抗-MYC單克隆抗體進(jìn)行雜交。1#蛋白(λ-晶體蛋白)在用抗-MYC單克隆抗體沉淀，用抗-HA抗體進(jìn)行雜交時(shí)顯示陽性結(jié)果(圖6)。以上結(jié)果表明，λ-晶體蛋白)在COS-7細(xì)胞中與Ang有相互作用。綜合這些結(jié)果，λ-晶體蛋白不僅在酵母核內(nèi)，而且在COS-7細(xì)胞中均與Ang有相互作用。
2.8 ANG系列突變體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建2.8.1分子模建方法及過程通過Internet網(wǎng)上蛋白質(zhì)同源模建服務(wù)器對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行掃描分析獲得有價(jià)值的分子結(jié)構(gòu)信息，血管生成素的X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)已獲得，但由于在晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定過程中只獲得了重原子的原子坐標(biāo)，而對(duì)于氫原子及其側(cè)鏈的原子結(jié)構(gòu)還不能解析。我們利用SWISS MODEL的程序ProMod II和Gromos96力場(chǎng)對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了重新模建。在計(jì)算過程中保證主鏈走向固定，首先利用最陡下降方法優(yōu)化200步，采用的參數(shù)為TFP43B1，收斂判據(jù)為2.5KJ/mol，進(jìn)而利用共軛梯度法進(jìn)行進(jìn)一步的分子力學(xué)優(yōu)化，優(yōu)化步一般為300步，收斂判據(jù)為2.5kJ/mol。在分子模建的基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了9個(gè)ANG的突變體，分別以飄帶與主鏈碳原子走向、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三維結(jié)構(gòu)疊合對(duì)理論模型進(jìn)行了分析，結(jié)果表明可以用于分子結(jié)合域研究。
2.8.2 Ang突變體誘餌蛋白載體的構(gòu)建及鑒定各種Ang突變體基因分別與pAS2-1連接，提取質(zhì)粒后篩選陽性克隆，利用酶切的方法對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。酶切結(jié)果表明我們獲得了預(yù)期的Ang突變體誘餌蛋白載體(如圖7所示)，它們分別是pAS2-1-Ang1-123-M、pAS2-1-Ang3-113-M、pAS2-1-Ang6-111-M、pAS2-1-Ang6-123、pAS2-1-Ang1-111、pAS2-1-Ang3-113、pAS2-1-Ang3-111、pAS2-1-Ang6-113和pAS2-1-Ang6-111(注M代表65～68位氨基酸缺失)。
2.9 Ang突變體與1#候選蛋白(λ-晶體蛋白)相互作用的檢測(cè)2.9.1 pAS2-1-ANG-Mut與1#文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y190酵母宿主用小量轉(zhuǎn)化法將pAS2-1-ANG-Mut與1#文庫質(zhì)粒(λ-晶體蛋白)分別共轉(zhuǎn)化至Y190細(xì)胞中。
2.9.2共轉(zhuǎn)化后Y190在不同缺陷培養(yǎng)基上的的生長(zhǎng)狀況將共轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂在SD/-Leu-Trp和SD/-His-Leu-Trp培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4～7天，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。
2.9.3共轉(zhuǎn)化后宿主Y190的β-半乳糖苷酶顯色分析分別從各種不同的轉(zhuǎn)化組平板上挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，點(diǎn)于NC膜上，按照前面所述的方法進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，同時(shí)以試劑盒中提供的陰性和陽性對(duì)照質(zhì)粒作為質(zhì)控。
1#候選蛋白組突變體pAS2-1-Ang1-123-M(用A代表)、pAS2-1-Ang3-113-M(用B代表)、pAS2-1-Ang1-111(用C代表)、pAS2-1-Ang3-113(用D代表)和pAS2-1-Ang3-111(用E代表)共轉(zhuǎn)化組變藍(lán)；而突變體pAS2-1-Ang6-111-M(用F代表)、pAS2-1-Ang6-123(用G代表)、pAS2-1-Ang6-113(用H代表)和pAS2-1-Ang6-113(用I代表)共轉(zhuǎn)化組不顯色(圖8)。
1#候選蛋白組突變體Ang1-123-M、Ang3-113-M、Ang1-111、Ang3-113和Ang3-111、與1#候選蛋白仍存在相互作用；而突變體Ang6-111-M、Ang6-123、Ang6-113和Ang6-111與1#候選蛋白間的相互作用消失。從所獲的結(jié)果可以看出，Ang N端3-5位aa對(duì)于與1#候選蛋白的結(jié)合至關(guān)重要。
權(quán)利要求
1.血管生成素Ang與λ晶體蛋白相互作用的分子結(jié)合域，其特征在于該結(jié)合域?yàn)锳ng與λ晶體蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸序列…N3S4R5…。
2.一種權(quán)利要求1所述血管生成素Ang與LIM蛋白相互作用的分子結(jié)合域，其特征在于以血管生成素Ang與λ晶體蛋白復(fù)合物為靶標(biāo)的復(fù)合物在制備抑制血管新生和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了血管生成素(Ang)的氨基酸序列，尤其是涉及血管生成素(Ang)與λ晶體蛋白相互作用的特定氨基酸序列。具體來說，該關(guān)鍵氨基酸序列為…N
文檔編號(hào)C07K14/515GK1837240SQ20061000752
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者徐東剛, 鄒民吉, 蔡欣, 徐濤, 王嘉璽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所