專利名稱：確定二氫嘧啶脫氫酶基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測方法。本發(fā)明也涉及評估患者中的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)。更具體地，本發(fā)明涉及寡核苷酸和方法，包括它們在使用RT-PCR檢測二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA表達(dá)中的用途。
背景技術(shù)：
當(dāng)正常細(xì)胞經(jīng)歷致癌性轉(zhuǎn)化并成為惡性細(xì)胞時癌癥發(fā)生。轉(zhuǎn)化的(惡性)細(xì)胞逃離可規(guī)定細(xì)胞表型并抑制細(xì)胞增殖的正常生理控制。個體機(jī)體中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞因此在沒有這些正?？刂频那闆r下增殖，形成腫瘤。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤時，臨床目標(biāo)是選擇性破壞惡性細(xì)胞，同時減少對進(jìn)行治療的個體的正常細(xì)胞的損害?；煼桨甘且詫Π┘?xì)胞具有選擇毒性(細(xì)胞毒性)的藥物的使用為基礎(chǔ)的。人們已經(jīng)研制出了很多類化療藥物，包括干擾核酸合成，蛋白合成，及其它重要代謝過程的藥物。
5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種在許多不同的癌癥類型，包括如胃腸道和乳腺的主要癌癥中廣泛使用的藥物(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。5-FU在40多年中一直是結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)一線治療的單一試劑，但最近被5-FU和CPT-11的聯(lián)合替代為“護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)”(Saltz等，Irinotecan Study Group.New EnglandJournal of Medicine，343905-14，2000)。5-FU和奧沙利鉑的聯(lián)合在結(jié)直腸癌中產(chǎn)生了高有效率(Raymond等，Semin.Oncol.254-12，1998)。因此，很可能5-FU將在許多年中用于癌癥治療，因為它仍然是當(dāng)前化療方案中的核心成分。此外，單獨的5-FU治療仍然用于一些患者，5-FU與CPT-11或奧沙利鉑的聯(lián)合對這些患者特別具有毒性。
5-FU是大多數(shù)抗癌藥中最典型的，因為只有少數(shù)患者對治療產(chǎn)生有利的反應(yīng)。大量的隨機(jī)化臨床試驗證明，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者對作為單一試劑的5-FU的總體腫瘤反應(yīng)率為15-25％(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。與上述其它化療聯(lián)合時，對基于5-FU的方案的腫瘤反應(yīng)率為約40％。然而，大多數(shù)受治療的患者沒有從接受基于5-FU的化療中得到明顯的益處，并且經(jīng)歷了顯著的危險、不適和花費大量開支。由于目前還沒有可靠的在治療前預(yù)測個體腫瘤對治療的反應(yīng)的方法，標(biāo)準(zhǔn)的臨床實踐是讓所有患者接受5-FU治療，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者的結(jié)果不滿意。
為了鑒定藥物的抗腫瘤活性的最重要生化決定因素，一直在廣泛研究5-FU的活性和代謝途徑。最終的目的是通過a)調(diào)節(jié)5-FU的細(xì)胞內(nèi)代謝和生化以及b)通過在治療前測量患者中的反應(yīng)決定性因素以預(yù)測哪些患者最可能反應(yīng)(或不反應(yīng))于藥物，從而改進(jìn)5-FU的臨床有效性。這些研究中得到了兩個主要的決定因素1)5-FU的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)的特性和2)5-FU代謝酶，二氫嘧啶脫氫酶(DPD)的特性。
對基于5-FU的治療的腫瘤反應(yīng)預(yù)測領(lǐng)域的第一個研究是對其在結(jié)直腸癌中的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)進(jìn)行的。Leichman等(Leichman等，J.Clin Oncol.，153223-3229，1997)進(jìn)行了一項前瞻性臨床試驗，用于在腫瘤對5-FU的反應(yīng)和TS基因的表達(dá)之間建立聯(lián)系，這是通過RT-PCR在結(jié)直腸癌的預(yù)治療活檢物中測定的。該研究表明1)在這些腫瘤中TS基因表達(dá)水平有大的50倍范圍；和2)反應(yīng)和無反應(yīng)腫瘤的TS基因表達(dá)水平之間具有顯著差異。反應(yīng)組TS水平的范圍(0.5-4.1×10-3，相對于內(nèi)部對照)窄于無反應(yīng)組的范圍(1.6-23.0×10-3，相對于內(nèi)部對照)。研究者確定了所得到的TS表達(dá)的“無反應(yīng)截斷值”域水平，在該水平之上僅有無反應(yīng)者。這樣，TS表達(dá)水平高于該“無反應(yīng)截斷值”域的患者可以在治療前被陽性鑒定為無反應(yīng)者。“無反應(yīng)”分類包括所有腫瘤縮?。?0％，進(jìn)展性生長導(dǎo)致腫瘤增加＞25％和非進(jìn)展性腫瘤縮?。?0％，無改變或增加＜25％。這些腫瘤具有最高的TS水平。因此，高TS表達(dá)特別鑒定了具有抗性的腫瘤。TS表達(dá)水平高于某域值鑒定為對5-FU無反應(yīng)的腫瘤亞型，而TS表達(dá)低于該數(shù)值的腫瘤預(yù)測具有稍高的反應(yīng)率。
隨后的研究調(diào)查了DPD表達(dá)水平與TS表達(dá)水平聯(lián)合作為對5-FU治療的腫瘤反應(yīng)決定因素的用途。DPD是一種減少5-FU的5，6雙鍵，使其作為細(xì)胞毒性劑而無活性的分解代謝酶。以前的研究表明，正常組織中的DPD水平可以影響5-FU的生物利用度，從而調(diào)節(jié)其藥代動力學(xué)和抗腫瘤活性(Harris等，Cancer Res.，50197-201，1990)。此外，已經(jīng)提出了腫瘤中DPD水平與對5-FU的敏感性相關(guān)的證據(jù)(Etienne等，J.Clin.Oncol.，131663-1670，1995；Beck等，Eur.J.Cancer，301517-1522，1994)。Salonga等(Clin Cancer Res.，61322-1327，2000，在此引入其全文作為參考)研究了在已經(jīng)確定了TS表達(dá)的一組腫瘤中作為5-FU/甲酰四氫葉酸治療的腫瘤反應(yīng)決定因素的DPD基因表達(dá)。至于TS，與無反應(yīng)腫瘤(0.2-16×10-3，80倍；相當(dāng)于內(nèi)部對照)相比，反應(yīng)的腫瘤中DPD表達(dá)的范圍相對窄(0.6-2.5×10-3，4.2倍；相對于內(nèi)部對照)。此外，反應(yīng)的腫瘤中DPD表達(dá)水平都不超過約2.5×10-3的域值水平。此外，DPD和TS表達(dá)水平表現(xiàn)出彼此不相關(guān)，表明它們是獨立調(diào)節(jié)的基因。在TS和DPD表達(dá)水平都低于各自的“無反應(yīng)截斷”域值水平的腫瘤組中，92％反應(yīng)于5-FU/LV。因此，可以根據(jù)DPD和TS的低表達(dá)水平鑒定反應(yīng)的腫瘤。
DPD也是5-FU毒性的重要標(biāo)記。也發(fā)現(xiàn)進(jìn)行基于5-FU的治療的具有非常低DPD水平(如在DPD缺陷綜合征，即胸腺嘧啶尿嘧啶尿癥)的患者受到了威脅生命的毒性的影響(Lyss等，Cancer Invest.，112390240，1993)。實際上，DPD水平在5-FU治療中的重要性得到了很大程度的說明，因為5-FU和抗病毒化合物索利夫定之間的不利的藥物相互作用使19名日本人死亡(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)。隨后發(fā)現(xiàn)索利夫定的代謝物是DPD的強(qiáng)抑制劑。該治療導(dǎo)致DPD缺陷綜合征樣DPD水平降低，這增加了5-FU對患者的毒性(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)。
因此，由于a)5-FU方案在癌癥治療中的廣泛用途，b)DPD表達(dá)在預(yù)測腫瘤對5-FU的反應(yīng)的重要作用和c)DPD-缺陷綜合征個體對常用的基于5-FU治療的敏感性，很明確在化療前進(jìn)行DPD的準(zhǔn)確確定將為癌癥患者提供重要的益處。
測量DPD酶活性要求含活性酶的新鮮組織的顯著量。不利的是，大多數(shù)治療前腫瘤活檢物僅僅作為固定的石蠟包埋的(FPE)組織，特別是不含活性酶的福爾馬林固定的石蠟包埋的組織而得到。而且，活檢物一般只含有非常少量的非均質(zhì)組織。
可以用RT-PCR引物和探針分析冷凍組織或新鮮組織中的DPD表達(dá)。然而，這些引物不適用于通過RT-PCR從固定組織中對DPD mRNA定量。目前存在的引物沒有得到結(jié)果或得到不穩(wěn)定的結(jié)果。這被認(rèn)為是由于以下原因a)DPD RNA本身水平低；b)石蠟中包埋的組織量非常小；和c)在石蠟中將RNA降解為＜100bp的小片。因此，其它的研究者進(jìn)行了一致的，但不成功的嘗試，以獲得允許在石蠟包埋的組織中對DPD表達(dá)定量的寡核苷酸引物組。因此，需要從固定的組織中對DPD mRNA定量的方法，以便提供對預(yù)定的癌癥治療的早期預(yù)后。因為已經(jīng)證明DPD酶活性和相應(yīng)mRNA表達(dá)水平相關(guān)性很好(Ishikawa等，Clin.Cancer Res.，5883-889，1999；Johnson等，Analyt.Biochem.278175-184，2000)，測量FPE標(biāo)本中DPD mRNA表達(dá)提供了評估患者DPD表達(dá)水平狀態(tài)而不需要確定新鮮組織中酶活性的途徑。此外，F(xiàn)PE標(biāo)本容易進(jìn)行顯微解剖，因此可以在沒有被基質(zhì)組織污染的腫瘤組織中確定DPD基因表達(dá)。
因此，本發(fā)明的目的是通過檢測患者腫瘤細(xì)胞中DPD mRNA的量，并把它與預(yù)定的閾表達(dá)水平進(jìn)行比較，而提供一種評估組織中DPD的水平，并預(yù)測患者腫瘤對基于5-FU的治療的可能抗性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一方面提供了具有DPD3A-51F(SEQ ID NO1)或DPD3A-134R(SEQ ID NO2)的序列的寡核苷酸引物，以及寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8)和與其基本相同的序列。本發(fā)明還提供了具有在嚴(yán)格條件下與DPD3A-51F(SEQ IDNO1)，DPD3A-134R(SEQ ID NO2)，DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，DPD3b-736R(SEQ ID NO8)或其互補序列雜交的序列的寡核苷酸引物。
而且，本發(fā)明涉及一種確定化療方案的方法，包括從腫瘤標(biāo)本中分離RNA；測定樣品中DPD的基因表達(dá)水平；把測定的DPD基因表達(dá)水平與該基因的預(yù)定閾水平進(jìn)行比較；根據(jù)測定的DPD基因表達(dá)水平和預(yù)定閾水平的比較結(jié)果確定化療方案。
本發(fā)明還涉及一種標(biāo)準(zhǔn)化組織樣品中相對于內(nèi)部對照基因的DPD的未校正基因表達(dá)(UGE)的方法，其中所述組織樣品是使用TaqMan技術(shù)分析的，所述方法是相對于樣品的內(nèi)部對照，對已知的ERCC1表達(dá)水平進(jìn)行分析而進(jìn)行的。


圖1表示比較四對不同的寡核苷酸引物擴(kuò)增來自10個不同的福爾馬林-FPE樣品的DPD mRNA的能力。樣品#1-5和#8-10來自于結(jié)腸腫瘤活檢物，#6來自于支氣管肺泡腫瘤活檢物，#7來自于小腸腫瘤活檢物。寡核苷酸引物對DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))，DPD2(DPD2p-1129F，(SEQ ID NO5)和DPD2p-1208R，(SEQ ID NO6))對于測量這些樣品中的DPD mRNA水平無效。寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))對于確定這些樣品中的DPD mRNA水平有效。
圖2表示比較寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))在冷凍組織樣品中的DPD mRNA擴(kuò)增效率。該圖表示，寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))不僅在測量冷凍組織樣品(以及FPE來源的樣品)中DPD表達(dá)水平中有效，而且比寡核苷酸引物對DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))更有效。
圖3是舉例說明如何計算相對于內(nèi)部對照基因的DPD表達(dá)的圖表。所述圖表包括用兩種試驗樣品獲得的數(shù)據(jù)，(未知1和2)，并舉例說明如何測定未校正基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)UCG。該圖表還舉例說明了如何利用TaqMan儀器，采用以前公開的DPD值標(biāo)準(zhǔn)化所產(chǎn)生的UGE。這是通過用UGE乘以校正因子KDPD完成的。圖中的內(nèi)部對照基因是β-肌動蛋白，校準(zhǔn)RNA是來自Applied Biosystems的Universal PERNA，目錄號4307281，批號3617812014。
圖4是表示每種組織學(xué)類型標(biāo)本中相對的校正DPD表達(dá)水平的柱狀圖。該柱狀圖表示第25和第75百分位(四分位之間)范圍。平均值表示為每個柱中的水平條。柱上面的橫線表示第25和第75百分位之外，但排除了離群值的水平。
具體實施例方式
本發(fā)明人公開了允許準(zhǔn)確評估組織中DPD表達(dá)的寡核苷酸引物和基本與其相同的寡核苷酸引物。這些寡核苷酸引物，DPD3a-51F(SEQID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2)(也稱作寡核苷酸引物對DPD3A)和寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8)(也稱作寡核苷酸引物對3B)在用于測定固定的石蠟包埋的(FPE)腫瘤標(biāo)本中的DPD基因表達(dá)時特別有效。
此處針對核酸而使用的“基本相同的”表示在嚴(yán)格條件下與靶雜交的寡核苷酸，以及在具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牒腿笔У臈l件下進(jìn)行適當(dāng)比對時，在核苷酸的至少約60％，典型地至少約70％，更典型地至少約80％，通常至少約90％，更通常至少約95-98％的核苷酸中相同的核酸片段或其互補鏈。當(dāng)雜交比總的特異性更具有選擇性時，存在選擇性雜交。見，Kanehisa，Nucleic Acids Res.，12203-213(1984)。
本發(fā)明包括在嚴(yán)格條件下(如此處所定義)與寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ ID NO1)，其互補序列，DPD3A-134R(SEQ ID NO2)或其互補序列的全部或一部分雜交的基本相同的寡核苷酸。此外，本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下(如此處所定義)與寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，其互補序列，DPD3b-736R(SEQ ID NO8)或其互補序列的全部或一部分雜交的基本相同的寡核苷酸。
在嚴(yán)格的雜交條件下，只有高度互補的，即，與此處所定義的基本上相似的核酸序列才能進(jìn)行雜交。優(yōu)選，這種條件會阻礙20個連續(xù)核苷酸中有4個或更多錯配，更優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸中有2個或更多錯配，最優(yōu)選20個相連核苷酸中有1個或更多錯配的核酸進(jìn)行雜交。
核酸的雜交部分通常至少約為10個(例如，15個)核苷酸長。雜交核酸進(jìn)行雜交的部分與寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ IDNO1)，其互補序列，DPD3A-134R(SEQ ID NO2)或其互補序列的全部或一部分至少約80％，優(yōu)選至少約95％，或最優(yōu)選至少約98％相同。此外，雜交核酸進(jìn)行雜交的部分與寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，其互補序列，DPD3b-736R(SEQ ID NO8)或其互補序列的全部或一部分至少約80％，優(yōu)選至少約95％，或最優(yōu)選至少約98％相同。
寡核苷酸引物與核酸樣品在嚴(yán)格條件下的雜交在下面規(guī)定。核酸雙鏈體或雜交體的穩(wěn)定性是以解鏈溫度(Tm)表示的，它是探針從靶DNA解離下來的溫度。解鏈溫度可用于限定所需的嚴(yán)格條件。如果所要鑒定的序列與探針基本上相同，而不是相同，那么它可首先用于確定最低溫度，在最低溫度時，只有使用特殊濃度的鹽(例如，SSC或SSPE)才能進(jìn)行同源雜交。然后，假定1％錯配導(dǎo)致Tm降低1℃，那么雜交反應(yīng)的最終洗滌溫度因此降低(例如，如果找到與探針的同一性＞95％的序列，那么最終的洗滌溫度降低5℃)。實際上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％錯配之間變化。
嚴(yán)格條件包括約68℃時，在5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0％SDS中雜交，室溫時，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗滌。中度的嚴(yán)格條件包括約42℃時，在3xSSC中洗滌。改變鹽濃度和溫度參數(shù)，可在引物和靶核酸之間獲得最佳的同一性水平。有關(guān)這種條件的其它指導(dǎo)可在本領(lǐng)域中很容易地得到，例如，Sambrook，F(xiàn)ischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1994)。
本發(fā)明的這方面涉及使用從FPE標(biāo)本可靠地提取RNA的方法，以及其次通過使用用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)的寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))或與其基本相同的寡核苷酸和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))或與其基本相同的寡核苷酸而確定標(biāo)本中DPD mRNA的含量。通過如1999年12月20日提交的美國專利申請No.09/469,338的描述通過任何從樣品中分離mRNA的方法從FPE細(xì)胞提取RNA，在此全文引入作為參考。
本發(fā)明的寡核苷酸引物允許評估固定的石蠟包埋(FPE)組織中的DPD表達(dá)(圖1)。此外，本發(fā)明的寡核苷酸引物可以準(zhǔn)確測定新鮮或冷凍組織中的DPD表達(dá)水平，即它們對其靶RNA具有高特異性。因此，本發(fā)明的方法不限于使用石蠟包埋組織。此處公開的寡核苷酸引物能夠允許準(zhǔn)確評估固定的石蠟包埋組織，以及冷凍或新鮮組織中的DPD基因表達(dá)(圖2)。這是由于來源于FPE樣品中的mRNA相對于新鮮或冷凍組織中的mRNA更成片段，因此更難以定量。因此，本發(fā)明提供了適用于測定FPE組織DPD表達(dá)水平的寡核苷酸引物，而以前沒有適當(dāng)?shù)臏y定方法。見圖1。
DPD mRNA的表達(dá)與基于5-FU的化療的臨床抗性相關(guān)。具體地，高水平DPD mRNA表達(dá)與基于5-FU的化療的抗性相關(guān)。
本發(fā)明的方法適用于各種腫瘤類型。它可制備個體“腫瘤表達(dá)分布”，由此在個體患者的樣品中測定DPD的表達(dá)水平，并預(yù)測對各種化療的反應(yīng)。本發(fā)明的方法最優(yōu)選用于支氣管肺泡、小腸或結(jié)腸腫瘤。對于將本發(fā)明的一些實施方案用于特定的腫瘤類型，優(yōu)選證明DPD基因表達(dá)水平與存活力之間的關(guān)系，這是通過編輯在特定DPD表達(dá)和對基于5-FU的化療的臨床抗性之間建立聯(lián)系的數(shù)據(jù)組而進(jìn)行的。
本發(fā)明可以用于任何組織類型。例如，為了檢驗?zāi)[瘤組織的抗性，需要檢驗?zāi)[瘤組織。優(yōu)選地，需要檢驗來自于獲得腫瘤的患者的正常組織的一部分。正常組織抗基于5-FU的化療化合物，但腫瘤組織預(yù)計對所述化合物敏感的患者可以然后接受較高量的化療組合物的治療。
本發(fā)明的方法包括從患者的腫瘤獲得細(xì)胞樣品的步驟。實體或淋巴瘤或其一部分是通過手術(shù)從患者切除下來的。如果不能在切除后立即從組織樣品中提取RNA，然后可以固定或冷凍樣品。然后可以用其獲得RNA。從冷凍或新鮮腫瘤樣品中分離出來的RNA是通過本領(lǐng)域任何一種典型的方法從細(xì)胞中提取出來的，例如Sambrook，F(xiàn)ischer和Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual，(2nded.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NewYork，(1989)。優(yōu)選在提取過程中，注意避免RNA降解。
或者，患者的組織可以被固定，例如，通常用福爾馬林(甲醛)或gluteraldehyde固定。本發(fā)明也通過醇浸漬而固定生物樣品。通常是使固定的生物樣品脫水，并將其包埋在石蠟或本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的其它固體支持物中。將包埋固定組織的固體支持物設(shè)計為可用有機(jī)溶劑除去，隨后使保存的組織再水合。此處描述的固定和石蠟包埋(FPE)組織標(biāo)本是指可以儲存并歸檔的組織樣品。
RNA是通過1999年12月20日提交的美國專利申請US 09/469,338中描述的任何一種方法從FPE細(xì)胞中提取出來的，所述專利申請全部引入此處作為參考。最優(yōu)選地，從福爾馬林固定和石蠟包埋的組織標(biāo)本中從腫瘤細(xì)胞提取RNA。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，RNA可從存檔的病理樣品或活檢樣品中分離出來，其首先脫石蠟。代表性的脫石蠟方法包括用有機(jī)溶劑，如二甲苯洗滌石蠟包埋的樣品。脫石蠟樣品還可用低級醇的水溶液再水合。適宜的低級醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脫石蠟樣品可用逐漸降低濃度的低級醇溶液連續(xù)洗滌而再水合?？蛇x擇地，樣品可同時脫石蠟和再水合。
一旦樣品再水合，從再水合組織中提取RNA。可利用機(jī)械，聲波或其它勻化工具勻化脫石蠟的樣品。在一個有效實施方案中，再水合的樣品可在含有離液劑，如硫氰酸胍(也可作為異硫氰酸胍銷售)的溶液中勻化。
“有效濃度的離液劑”的選擇是指從石蠟包埋的樣品中純化的RNA量比沒有離液劑情況下分離出來的RNA量高大約10倍。離液劑包括，如，胍化合物，脲，甲酰胺，碘化鉀，硫氰酸鉀及類似的化合物。本發(fā)明方法的優(yōu)選離液劑是胍化合物，如異硫氰酸胍(也作為硫氰酸胍銷售)和鹽酸胍。很多陰平衡離子都是有用的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用這種適宜的陰離子制備多種胍鹽。本發(fā)明所用胍溶液的有效濃度通常約為1-5M，優(yōu)選約4M。如果RNA已存在于溶液中，那么胍溶液的濃度可以更高，這樣，樣品中獲得的最終濃度約為1-5M。優(yōu)選用適當(dāng)?shù)纳彌_液，如Tris-HCl把胍溶液緩沖至pH約3-6，更優(yōu)選約4。離液溶液還可含有還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(BME)。離液溶液還可含有RNA酶抑制劑。
將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100℃，所述離液溶液含有有效量的離液劑，如胍化合物。優(yōu)選的離液劑是硫氰酸胍。
然后通過苯酚-氯仿萃取，離子交換色譜或大小排阻色譜回收離液溶液中的RNA。然后，利用提取，電泳，層析，沉淀技術(shù)或其它適宜技術(shù)進(jìn)一步純化RNA。
DPD mRNA的定量優(yōu)選使用本領(lǐng)域常用的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行，其中所述DPD mRNA來源于新鮮，冷凍，或固定組織的純化總mRNA。定量DPD mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指標(biāo)和其它標(biāo)記探針。此外，本發(fā)明還利用沒有PCR的系統(tǒng)測量DPD的mRNA，其中沒有PCR的系統(tǒng)使用的是與Invader測定(Third Wave Technologies，Inc.)中使用的探針相似的熒光標(biāo)記探針。最優(yōu)選，DPDcDNA及內(nèi)部對照或管家基因(例如，β-肌動蛋白)的定量是利用基于熒光的實時檢測法(ABIPRISM 7700或7900Sequence Detection System[TaqMan]，Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA.)或與Heid等(Genome Res 1996；6986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6995-1001)所述相似的系統(tǒng)進(jìn)行的。ABI7700(TaqManInstrument)的輸出量是以Ct’s或“循環(huán)閾”表示的。使用TaqMan系統(tǒng)，樣品中具有較高數(shù)量靶分子的高水平表達(dá)基因產(chǎn)生一種信號，并且PCR循環(huán)(較低的Ct)比具有較少靶分子(較高的Ct)的低水平相對表達(dá)的基因要少。
本發(fā)明部分在于以下發(fā)現(xiàn)，即DPD mRNA的相對量與對化療劑5-FU的抗性相關(guān)。此處發(fā)現(xiàn)，表達(dá)高水平DPD mRNA的腫瘤可能抗5-FU。相反，表達(dá)低DPD mRNA量的腫瘤可能對5-FU敏感。通過比較患者的腫瘤DPD mRNA的表達(dá)與DPD表達(dá)的預(yù)定域表達(dá)水平而判斷患者的腫瘤DPD mRNA的表達(dá)。
此處所用“管家”基因或“內(nèi)部對照”是任何一種組成型或全局型表達(dá)基因，它的存在可評估DPD mRNA的水平。這種評估包括測定基因轉(zhuǎn)錄的總體組成型水平和RNA回收中變異的對照?！肮芗摇被蚧颉皟?nèi)部對照”包括，但不限制于親環(huán)蛋白基因，β-肌動蛋白基因，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因，GAPDH基因等。最優(yōu)選內(nèi)部對照基因是β-肌動蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306所述。
RNA回收中變異的對照需要使用“校準(zhǔn)RNA”?！靶?zhǔn)RNA”可以是任何一種可得到的精確預(yù)定量的對照RNA。優(yōu)選使用來自AppliedBiosystems的Universal PE RNA，目錄號4307281，批號3617812014。
此處所用“未校正基因表達(dá)(UGE)”是指由TaqMan儀器產(chǎn)生的相對于內(nèi)部對照基因的DPD表達(dá)的數(shù)字輸出。用于確定UGE的公式在實施例4中表示，并用圖3樣品計算結(jié)果舉例說明。
本發(fā)明另一方面提供一種標(biāo)準(zhǔn)化未校正基因表達(dá)(UGE)值的方法，所述未校正基因表達(dá)(UGE)值是利用源于非-TaqMan技術(shù)的“已知相對基因表達(dá)”值，從TaqMan儀器獲得的。優(yōu)選，由Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000(在此全文引入作為參考)以前公開的源于非-TaqMan的相對DPDβ-肌動蛋白表達(dá)值是用源于組織樣品的DPD UGE值標(biāo)準(zhǔn)化的。
此處所用“校正的相對DPD表達(dá)”是指標(biāo)準(zhǔn)化的DPD表達(dá)，UGE乘以DPD特異性校正因子(KDPD)得到一個值，該值可與DPD相對于內(nèi)部對照基因的已知表達(dá)水平范圍相比較。圖3詳細(xì)說明了這些計算結(jié)果。
“以前公開的”相對基因表達(dá)是以靶基因的RT-PCR信號與組成型表達(dá)的基因(β-肌動蛋白)的比值為基礎(chǔ)的。在Pre-TaqMan技術(shù)研究中，PCR反應(yīng)進(jìn)行固定的循環(huán)數(shù)(即，30次)，并報告每份樣品的終點值。然后按照DPD表達(dá)與β-肌動蛋白表達(dá)的比值報道這些值。Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作為參考。
此處定義的DPD表達(dá)的“預(yù)定閾水平”是一種DPD表達(dá)水平，當(dāng)高于此水平時，腫瘤可能對基于鉑的化療方案有抗性。表達(dá)水平低于該域值的腫瘤可能對基于鉑的化療方案敏感。相對DPD表達(dá)在反應(yīng)于基于5-FU的化療方案的腫瘤中的范圍為低于約0.6×10-3-2.5×10-3(約4.2倍范圍)。不反應(yīng)于基于5-FU的化療方案的腫瘤的相對DPD表達(dá)為約0.2×10-3-16×10-3(約4.2倍范圍)。如果相對DPD表達(dá)高于約2.0×10-3，優(yōu)選高于約2.5×10-3，腫瘤一般不反應(yīng)于5-FU治療。這些腫瘤值允許確定特定樣品的“校正的相對DPD表達(dá)”是高于還是低于“預(yù)定閾水平”。校正的相對DPD表達(dá)水平的閾值是約2.0×10-3-2.5×10-3。
本發(fā)明的方法可適于各種組織和腫瘤類型，可用于評估患者的臨床治療，并作為各種癌癥，包括乳腺癌，頭頸癌，肺癌，食管癌，結(jié)腸直腸癌等的診斷或預(yù)后工具。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法適于支氣管肺泡癌、小腸癌或結(jié)腸癌。
根據(jù)在腫瘤中表達(dá)DPD mRNA的量的測量，本領(lǐng)域的實施者可以進(jìn)行關(guān)于腫瘤對基于5-FU的化療的腫瘤的臨床抗性?！盎?-FU的化療”包括給予5-FU，其衍生物，單獨給藥或與其它化療劑，如亞葉酸或DPD抑制劑，如尿嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、溴乙烯基尿嘧啶、胸腺嘧啶、芐氧基芐基尿嘧啶(BBU)或5-氯-2，4-二羥基吡啶聯(lián)合給藥。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與5-FU或其衍生物與DPD抑制劑5-乙炔基尿嘧啶的聯(lián)合相比，式(I)的5’-脫氧胞嘧啶衍生物與5-FU或其衍生物的共同給藥顯著改進(jìn)化療劑向腫瘤組織的選擇性遞送，并且在人癌癥異種移植物模型中表現(xiàn)出抗腫瘤活性的顯著改進(jìn)。
上面描述了本發(fā)明，本發(fā)明的實際操作是通過下面給出的實驗性實施例舉例說明的。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到說明實施例中使用的材料和方法可以各種方式進(jìn)行改進(jìn)。這種改進(jìn)也被認(rèn)為落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例實施例1從FPE組織中分離RNARNA是通過下列一般過程從石蠟包埋組織中提取出來的。
A.切片的脫石蠟和水合(1)把約10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料離心管中。
(2)加入600μL二甲苯，室溫(約20-25℃)用力振搖混合物約10分鐘。
(3)室溫時，以臺式離心機(jī)的最大速度(約10-20,000xg)將樣品離心約7分鐘。
(4)重復(fù)步驟2和3，直到絕大部分石蠟溶解。根據(jù)原始樣品部分所含的石蠟量，通常需要重復(fù)2次或更多次。
(5)用低級醇，優(yōu)選用100％乙醇(約600μL)用力振搖約3分鐘，除去二甲苯溶液。
(6)按照步驟(3)將試管離心約7分鐘。傾出并棄去上清液。顆粒狀物變?yōu)榘咨?br> (7)用更稀釋的乙醇溶液首先用約95％乙醇，然后用約80％乙醇，最后用約70％乙醇連續(xù)重復(fù)步驟5和6。
(8)按照步驟(3)，室溫將樣品離心7分鐘。棄去上清液，室溫干燥顆粒狀物約5分鐘。
B.用苯酚-氯仿分離RNA(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的異硫氰酸胍溶液和8μL二硫蘇糖醇。
(2)然后用組織勻漿器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)勻化樣品約2-3分鐘，速度從低速(速度1)到高速(速度5)逐漸升高。
(3)然后將樣品在大約95℃時加熱約5-20分鐘。優(yōu)選在加熱到95℃之前，用細(xì)針刺入含樣品的試管的管帽?？蛇x擇地，管帽可用塑料夾子或?qū)嶒炗帽∧す潭ā?br> (4)然后用pH4.0的50μL 2M醋酸鈉和600μL苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取樣品，其中苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL 1∶49的異戊醇∶氯仿溶液新制備的。用力振搖溶液約10秒，然后在冰上冷卻約15分鐘。
(5)以最大速度將溶液離心約7分鐘。將上層的(水)相轉(zhuǎn)移到一個新的試管中。
(6)-20℃時，用約10μL糖原和400μL異丙醇沉淀RNA30分鐘。
(7)通過在臺式離心機(jī)中以最大速度離心約7分鐘，而使RNA成為顆粒狀物；傾出并棄去上清液；用大約500μL約70-75％的乙醇洗滌顆粒狀物。
(8)以最大速度將樣品再次離心7分鐘。棄去上清液，并將顆粒狀物風(fēng)干。然后將顆粒狀物溶解在適宜的緩沖液中，用于進(jìn)一步的實驗(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。
實施例2mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR逆轉(zhuǎn)錄如實施例1中舉例說明和1999年12月20日提交的美國專利申請US09/469,338中的描述(全文引入此處作為參考)，RNA是從顯微解剖或非-顯微解剖的福爾馬林固定的石蠟包埋(FPE)組織中分離出來的。用乙醇沉淀并離心后，將RNA顆粒狀物溶解在50μLpH8.0的5mM Tris/Cl中。所得RNA是隨機(jī)的六聚體和來源于LifeTechnologies的M-MLV(目錄號28025-02)逆轉(zhuǎn)錄的。逆轉(zhuǎn)錄是通過把25μL RNA溶液與25.5μL“逆轉(zhuǎn)錄混合物”混合進(jìn)行的(見下文)。將反應(yīng)物放在熱循環(huán)儀中，26℃時8分鐘(用于使隨機(jī)的六聚體與RNA結(jié)合)，42℃時45分鐘(用于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng))，95℃時5分鐘(用于DNA酶的熱滅活)。
“逆轉(zhuǎn)錄混合物”由以下成分組成10μl 5X緩沖液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl隨機(jī)的六聚體(500.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mMTris-HCL中為3mg/ml)，1.25μl RNA Guard24，800U/ml(RNA酶抑制劑)(目錄號27-0816，Amersham Pharmacia)和2.5μl MMLV 200U/μl(Life Tech目錄號28025-02)。
反應(yīng)組分的最終濃度是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNA Guard和10U/μl MMLV。
mRNA表達(dá)的PCR定量。DPD cDNA和內(nèi)部對照或管家基因(例如β-肌動蛋白，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6995-1001)所述的基于熒光的實時檢測法(ABIPRISM 7700或7900序列檢測系統(tǒng)[TaqMan]，Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA.)進(jìn)行的。簡言之，該方法使用一種雙重標(biāo)記的產(chǎn)熒光TaqMan寡核苷酸探針，(DPD-530Tc(SEQ ID NO3)，Tm＝70℃)，其特異性地在正向和反向引物內(nèi)退火。含反應(yīng)混合物的加蓋孔內(nèi)的激光刺激引起3’猝滅劑染料(TAMRA)發(fā)射，直到探針在PCR延伸過程中被DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性裂解，引起5’報道染料(6FAM)的釋放。因此，擴(kuò)增子的產(chǎn)生引起熒光信號的發(fā)射，這是通過TaqMan’sCCD(電荷耦合器件)檢測照相機(jī)檢測的，PCR反應(yīng)純指數(shù)相內(nèi)，閾循環(huán)所產(chǎn)生的信號量可反映目標(biāo)序列的起始拷貝數(shù)。寡核苷酸引物對DPD1(DPD-70F(SEQ ID NO3)和DPD-201R(SEQ ID NO4))的TaqMan探針是DPD-108Tc(SEQ ID NO9)。寡核苷酸引物對DPD2(DPD2p-1129F(SEQ ID NO5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO6))的TaqMan探針是DPD-2p-1154Tc(SEQ ID NO10)。寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))的TaqMan探針是DPD3A-71Tc(SEQ ID NO11)。寡核苷酸引物對DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))的TaqMan探針是DPD3b-685Tc(SEQ ID NO12)。
PCR反應(yīng)混合物含有來自引物對DPD1(DPD-70F(SEQ ID NO3)和DPD-201R(SEQ ID NO4))；DPD2(DPD2p-1129F(SEQ ID NO5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO6))；DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，Tm＝58℃和DPD3b-736R(SEQ ID NO8)，Tm＝60℃)；或寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)，Tm＝59℃和DPD3a-134R(SEQ IDNO2)，Tm＝59℃)。每一種PCR引物混合物由以下成分組成0.5μl含有cDNA以及600nM僅僅來自于一對(DPD1，DPD2，DPD3或DPD3A)引物的每一種寡核苷酸引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，200nM相應(yīng)的TaqMan探針(用于DPD1，DPD2，DPD3或DPD3A)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mM MgCl2，和含有參考染料的1×Taqman緩沖液A，最終的體積小于或等于25μl(所有試劑，Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，CA)。循環(huán)條件是，95℃10分鐘，然后是95℃15秒和60℃1分鐘循環(huán)45次。
實施例3寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))允許通過RT-PCR，使用從石蠟包埋組織提取的RNA進(jìn)行強(qiáng)的、可重復(fù)的DPD基因表達(dá)定量。圖1。寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))也顯著增加了通過RT-PCR在新鮮的冷凍組織中分析DPD基因表達(dá)的敏感性。圖2。按上述實施例2的描述使用ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)(Taqman)進(jìn)行。
在PCR反應(yīng)中使用30個循環(huán)。每一個循環(huán)由96℃變性1min，55℃退火1min，并且72℃延伸2min組成。用寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物長度是84個堿基對。擴(kuò)增產(chǎn)物相當(dāng)于跨越一部分5’非翻譯區(qū)(UTR)并進(jìn)入外顯子1的DPD cDNA區(qū)域。用寡核苷酸引物對DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物長度是86個堿基對。擴(kuò)增產(chǎn)物相當(dāng)于擴(kuò)增DPD cDNA的一個相當(dāng)于外顯子6的區(qū)域。
比較了寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))與其它現(xiàn)存的引物組擴(kuò)增來源于10個不同F(xiàn)PE組織樣品的DPD mRNA的能力。樣品#1-5和#8-10來自于結(jié)腸腫瘤活檢物，#6來自于支氣管肺泡腫瘤活檢物，#7來自于小腸腫瘤活檢物。使用的其它寡核苷酸引物對是DPD1(DPD-70F，(SEQID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))和DPD2(DPD2p-1129F(SEQ IDNO5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO6))。
寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))準(zhǔn)確確定各種樣品中的DPD水平中最有效。寡核苷酸引物對DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ IDNO8))也有效，但沒有產(chǎn)生強(qiáng)信號。結(jié)果見圖1。
實施例4測定DPD的未校正基因表達(dá)(UGE)進(jìn)行兩對平行反應(yīng)?！霸囼灐狈磻?yīng)和“校準(zhǔn)”反應(yīng)。圖7。DPD擴(kuò)增反應(yīng)和β-肌動蛋白內(nèi)部對照擴(kuò)增反應(yīng)是試驗反應(yīng)。單獨的DPD和β-肌動蛋白擴(kuò)增反應(yīng)是在校準(zhǔn)RNA模板上進(jìn)行的，被稱作校準(zhǔn)反應(yīng)。TaqMan儀器產(chǎn)生4個不同的循環(huán)閾(Ct)值試驗反應(yīng)的CtDPD和Ctβ-肌動蛋白，和校準(zhǔn)反應(yīng)的CtDPD和Ctβ-肌動蛋白。兩種反應(yīng)的Ct差值是根據(jù)下列公式確定的ΔCt試驗＝CtDPD-Ctβ-肌動蛋白(“試驗”反應(yīng))ΔCt校準(zhǔn)＝CtDPD-Ctβ-肌動蛋白(“校準(zhǔn)”反應(yīng))下一步是按照下列公式計算2的負(fù)ΔCt次方。
2-ΔCt試驗(“試驗”反應(yīng))2-ΔCt校準(zhǔn)(“校準(zhǔn)”反應(yīng))為了從TaqMan儀器獲得DPD的未校正基因表達(dá)，進(jìn)行了下列計算DPD的未?；虮磉_(dá)(UGE)＝2-ΔCt試驗/2-ΔCt校準(zhǔn)用已知的相對DPD表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化UGE標(biāo)準(zhǔn)化的計算需要將UGE乘以對DPD和特定校準(zhǔn)RNA特異的校正因子(KDPD)。還可測定任何一種內(nèi)部對照基因和任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA的校正因子KDPD。優(yōu)選，使用內(nèi)部對照基因β-肌動蛋白和精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA，來自Applied Biosystems的Universal PERNA，目錄號4307281，批號3617812014。
標(biāo)準(zhǔn)化是使用ΔCt方法的改進(jìn)法進(jìn)行的，所述ΔCt方法由AppliedBiosystems，TaqMan制造商，在User Bulletin#2中和上文描述。為了進(jìn)行該過程，使用上述TaqMan方法，分析了6個不同F(xiàn)PE試驗組織的UGE的DPD表達(dá)。使用內(nèi)部對照基因β-肌動蛋白和校準(zhǔn)RNA，來自Applied Biosystems的Universal PE RNA，目錄號4307281，批號3617812014。
用以前描述于Salonga等(在此全文引入作為參考)的各樣品L7，L91，L121，L150，L220和L164的相對DPD表達(dá)水平(PV)除以其相應(yīng)的源于TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。
K不平均的＝PV/UGE接下來，求全部K值的平均值，從而確定對DPD，校準(zhǔn)RNA即Universal PE RNA，目錄號4307281，批號3617812014和β-肌動蛋白特異的單一KDPD校正因子。
因此，為了成規(guī)模地測定與pre-TaqManDPD表達(dá)研究一致的，未知組織樣品中的校正相對DPD表達(dá)，人們只需用源于TaqMan儀器的未校正基因表達(dá)數(shù)據(jù)(UGE)乘以KDPD特異性校正因子，前提是使用相同的內(nèi)部對照基因和校準(zhǔn)RNA。
校正的相對DPD表達(dá)＝UGE×KDPDKDPD可使用任何一種精確預(yù)定量的校準(zhǔn)RNA或內(nèi)部對照基因測定。未來來源的精確預(yù)定量RNA可按照上述方法，相對于樣品用已知的相對DPD表達(dá)校準(zhǔn)或可相對于先前已經(jīng)校準(zhǔn)過的校準(zhǔn)RNA，如UniversalPE RNA，目錄號4307281，批號3617812014。校準(zhǔn)。
例如，如果隨后測定不同的內(nèi)部對照基因和/或不同的校準(zhǔn)RNA的KDPD，則人們必須相對于組織樣品校準(zhǔn)內(nèi)部對照基因和校準(zhǔn)RNA，其中已經(jīng)測定了相對于特定內(nèi)部對照基因的DPD表達(dá)水平。這種測定可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)pre-TaqMan，定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行。用這些樣品的已知表達(dá)水平除以它們相應(yīng)的UGE水平，可確定樣品的K值。然后根據(jù)已知樣品數(shù)，求K值的平均值，從而測定對不同內(nèi)部對照基因和/或校準(zhǔn)RNA特異的新KDPD。
實施例5FPE結(jié)直腸腫瘤樣品中的DPD表達(dá)將上文所述方法用于分析來自34名晚期結(jié)直腸癌患者的34個腫瘤樣品。所有患者用靜脈內(nèi)5-FU/LV聯(lián)合方案治療，作為前瞻性多中心歐洲5-FU/CPT11交叉試驗V239的一部分。所有用靜脈內(nèi)5-FU425mg/m2治療的患者在連續(xù)5天內(nèi)進(jìn)行15分鐘輸注，也在連續(xù)5天內(nèi)用20mg/m2的亞葉酸進(jìn)行輸注。該方案作為一線或二線緩解治療。
9名患者(25.5％)反應(yīng)于5-FU/LV，該反應(yīng)定義為包括完全反應(yīng)，部分反應(yīng)和最小反應(yīng)的任何反應(yīng)。具有進(jìn)展性疾病或穩(wěn)定疾病的患者分類為無反應(yīng)者(25名患者，73.5％)。從顯微解剖的FPE預(yù)治療腫瘤樣品中分離總mRNA，并且按上文所述用定量PCR測量DPD/β-肌動蛋白的相對mRNA表達(dá)水平。
反應(yīng)和無反應(yīng)患者組的平均校正DPD/β-肌動蛋白的水平分別是0.87×10-3和2.04×10-3。采用比較兩個獨立樣品組值的秩的Mann-WhitneyU檢驗來比較反應(yīng)和無反應(yīng)患者組的校正的相對DPD表達(dá)水平。無反應(yīng)者組中的相對DPD水平與無反應(yīng)者相比顯著更低(P＝0.02)。這些患者中DPD mRNA表達(dá)和對5-FU/LV的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)如圖4所示。這些數(shù)據(jù)表明，DPD表達(dá)是對基于5-FU的化療的反應(yīng)的預(yù)測因子。
序列表<110>K.D.達(dá)南伯格<120>確定二氫吡啶脫氫酶基因表達(dá)的方法<130>11220/155<140>09/796,807<141>2001-03-02<140>09/842,111<141>2001-04-26<140>09/879,217<141>2001-06-13<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>1aggacgcaag gagggtttg 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>2gtccgccgag tccttactga20
<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>3tcactggcag actcgagact gt 22<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>4tggccgaagt ggaacaca 18<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>5ctgcctttga ctgtgcaaca tc 22<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>6attaacaaag ccttttctga agacgat27<210>7
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>7gaagcctatt ctgcaaagat tgc23<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>8gagtacccca atcgagccaa a 21<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>9ccgccgagtc cttactgagc acagg 25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>10cacacggcga gctccacaac gtaga 25<210>11
<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>11cagtgcctac agtctcgagt ctgccagtg 29<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物<400>12aaggaagcac aacttatact tgcaggccca g 3權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO7的序列或其互補序列的寡核苷酸。
2.具有SEQ ID NO8的序列或其互補序列的寡核苷酸。
3.一種用于檢測二氫嘧啶脫氫酶(DPD)基因的表達(dá)的試劑盒，包含具有SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的序列的寡核苷酸對DPD3B或與其互補的一對寡核苷酸。
4.一種確定組織樣品中二氫嘧啶脫氫酶(DPD)基因表達(dá)的相對水平的方法，包括(a)從腫瘤樣品分離mRNA；(b)使用具有SEQ ID NO7的序列或其互補序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO8的序列或其互補序列的寡核苷酸引物擴(kuò)增mRNA；(c)比較步驟(b)的mRNA的量與內(nèi)部對照的mRNA量。
5.權(quán)利要求4的方法，其中腫瘤樣品是冷凍的。
6.權(quán)利要求4的方法，其中腫瘤樣品在固定后包埋于石蠟中。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在有效量的離液劑存在下分離mRNA。
8.權(quán)利要求7的方法，其中腫瘤樣品包含非腫瘤組織和腫瘤組織。
9.一種確定腫瘤樣品對5-氟尿嘧啶的敏感性的方法，包括(a)從腫瘤樣品分離mRNA；(b)使用一對具有SEQ ID NO7的序列或其互補序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO8的序列或其互補序列的寡核苷酸擴(kuò)增mRNA，以獲得擴(kuò)增的樣品；(c)測定擴(kuò)增的樣品中二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA的量；(d)比較擴(kuò)增的樣品中二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA的量與DPD表達(dá)的預(yù)定閾水平；(e)基于擴(kuò)增的樣品中DPD mRNA的量和DPD基因表達(dá)的域水平的差異確定腫瘤樣品對5-氟尿嘧啶的敏感性。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述DPD基因表達(dá)的預(yù)定閾水平是內(nèi)部對照基因表達(dá)水平的約2.0-約2.5倍。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述內(nèi)部對照基因是β-肌動蛋白。
12.權(quán)利要求4或9的方法，其中至少一種組織樣品包括支氣管肺泡腫瘤組織、小腸腫瘤組織或結(jié)腸腫瘤組織。
全文摘要
本發(fā)明涉及有效用于醫(yī)學(xué)，特別是癌癥化療中的預(yù)測方法。本發(fā)明的目的是通過檢驗患者腫瘤細(xì)胞中的DPD mRNA量，并將其與預(yù)定的閾表達(dá)水平相比而提供一種評估組織中的二氫嘧啶脫氫酶(DPD)表達(dá)水平并預(yù)測患者的腫瘤對基于5－FU的治療的可能抗性的方法。更具體地，本發(fā)明提供寡核苷酸引物對DPD3A和DPD3B，以及包括將它們用于檢測二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA水平的方法。
文檔編號C07H21/00GK1840660SQ20061000707
公開日2006年10月4日 申請日期2002年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月2日
發(fā)明者K·D·達(dá)南伯格 申請人:應(yīng)答遺傳公司