專利名稱：一種固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固載蛋白質(zhì)的新型多孔整體基質(zhì)及其制備，可用于快速固載蛋白質(zhì)分子。
背景技術(shù)：
目前人工合成的用于蛋白質(zhì)固載的基質(zhì)主要分為顆?；|(zhì)和整體基質(zhì)兩大類。顆?；|(zhì)的制備一般包括合成和破碎兩個(gè)步驟。得到的顆粒根據(jù)其表面功能基團(tuán)不同，在固載蛋白質(zhì)分子時(shí)一般還需要進(jìn)行修飾和活化。此類基質(zhì)主要應(yīng)用于柱內(nèi)填充。在填充柱中，液流主要通過(guò)填料之間的空隙，從流動(dòng)相向固定化酶的傳質(zhì)和從固定化酶向流動(dòng)相的傳質(zhì)主要由擴(kuò)散速率決定，依賴于填料、孔的大小、流速和底物的擴(kuò)散系數(shù)。對(duì)于蛋白質(zhì)這種大分子，其擴(kuò)散速率較低，而填充柱中填料之間存在大量的空隙，即使使用均勻大小的球體，也仍然存在27％的空隙，在實(shí)際的應(yīng)用中，空隙將會(huì)更大，所以此類基質(zhì)作為固定化蛋白酶的載體并不理想。
多孔整體基質(zhì)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的色譜分離介質(zhì)。整體基質(zhì)通過(guò)改變優(yōu)化合成的條件，可以同時(shí)得到可用于對(duì)流的大孔，也能獲得可用于擴(kuò)散的小孔，其孔的直徑分布在700-2000納米范圍內(nèi)。在整體柱基質(zhì)中，可以允許流動(dòng)相在其中對(duì)流，傳質(zhì)得到顯著提高，即使在較高的流速下，也可以得到理想的傳質(zhì)速率。大孔整體材料用作催化劑十分理想，特別是在底物是蛋白質(zhì)這樣擴(kuò)散系數(shù)小的大分子時(shí)，更加適用。當(dāng)使用大孔的整體基質(zhì)作為固定化蛋白酶的載體時(shí)，較快的傳質(zhì)使得底物可以容易地與酶的活性部位接近，大大提高酶解反應(yīng)的速度。
整體基質(zhì)雖然都可以用于固載蛋白子分子，但是有些基團(tuán)的活性不高，所以在進(jìn)行蛋白質(zhì)固載時(shí)，常需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
琥珀酰亞胺活性基團(tuán)是一種高活性的反應(yīng)基團(tuán)，可以迅速與蛋白質(zhì)上的氨基反應(yīng)。本發(fā)明的目的在于提供一種新型的用于蛋白質(zhì)固載的多孔整體基質(zhì)，使用丙烯酰琥珀酰亞胺作為功能單體，將琥珀酰亞胺直接進(jìn)入整體基質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)中，能夠顯著縮短蛋白質(zhì)的固載時(shí)間。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)，通過(guò)原位聚合的方法以丙烯酰琥珀酰亞胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作為單體，在二元高級(jí)醇的混合溶液中進(jìn)行原位聚合，得到一種具有多孔結(jié)構(gòu)的剛性基質(zhì)。其可以迅速與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行反應(yīng)，快速結(jié)合蛋白質(zhì)分子。
基質(zhì)為一種連續(xù)、均勻的多孔結(jié)構(gòu)高分子物質(zhì)，其孔徑范圍在10-9至10-5米；具有良好的通透性，流過(guò)床層的流體線流速范圍在0-50cm/min；基質(zhì)具有剛性結(jié)構(gòu)，壓力適用范圍為0-40MPa。
基質(zhì)可采用片狀、柱狀形式，也可以直接在柱管或芯片的通道內(nèi)制備。
所述固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)制備的具體步驟如下，1)丙烯酰琥珀酰亞胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作為單體，在二元高級(jí)醇的混合溶液中進(jìn)行混合；其中三種單體質(zhì)量占單體總質(zhì)量的百分比范圍為丙烯酰琥珀酰亞胺20-30％(w/w)；乙叉二甲基丙烯酸40-60％(w/w)；丙烯酰胺20-30％(w/w)。
2)在聚合溶液中加入引發(fā)劑，在50-70℃下進(jìn)行加熱引發(fā)聚合反應(yīng)或在200-400nm紫外燈照射下進(jìn)行光引發(fā)聚合反應(yīng)。
制備基質(zhì)時(shí)使用高級(jí)醇混合溶液作為致孔劑，所述高級(jí)醇為正丙醇、1，4-丁二醇、環(huán)己醇、正癸醇或十二醇；其用量為占聚合物總質(zhì)量的60-75％；其中良溶劑正丙醇或環(huán)己醇；弱溶劑1，4-丁二醇、正癸醇或十二醇，在混合溶液中二元高級(jí)醇良溶劑與弱溶劑的質(zhì)量比范圍為10-90％；所述引發(fā)劑為AIBN，其加入量占單體總質(zhì)量的0.5-2％；在室溫下加入引發(fā)劑后，除氣，置于50-70℃下反應(yīng)不少于6小時(shí)。
所述三種單體加入混合溶劑中后加熱至50-80℃，震蕩混勻。
應(yīng)用時(shí)，采用蛋白溶液直接通過(guò)整體基質(zhì)，蛋白可迅速固定于基質(zhì)上；可在1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成蛋白質(zhì)的固載；基質(zhì)具有良好的通透性和生物親和性，在固載蛋白質(zhì)后，可以實(shí)現(xiàn)高通量蛋白質(zhì)酶解；基質(zhì)表面帶有琥珀酰亞胺功能基團(tuán)，琥珀酰亞胺功能基團(tuán)在基質(zhì)的骨架中均勻分布，可以高活性地進(jìn)一步與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行反應(yīng)。
基質(zhì)骨架內(nèi)添加丙烯酰胺單體。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.基質(zhì)表面具有高活性的反應(yīng)基團(tuán)，可以快速結(jié)合蛋白質(zhì)分子。本發(fā)明基質(zhì)表面具有高活性的反應(yīng)基團(tuán)，可以快速與蛋白質(zhì)分子上的胺基進(jìn)行反應(yīng)，制得酶反應(yīng)器。該基質(zhì)的制備方法簡(jiǎn)單，基質(zhì)反應(yīng)活性高，固載蛋白質(zhì)分子迅速，可以顯著縮短固載時(shí)間。
2.使用多孔結(jié)構(gòu)材料作為基質(zhì)，可以增進(jìn)底物的傳質(zhì)過(guò)程。本發(fā)明的基質(zhì)具有連續(xù)、均勻的多孔結(jié)構(gòu)，可以顯著提高底物在基質(zhì)中的傳質(zhì)和對(duì)流，使用在基質(zhì)為載體制得的酶反應(yīng)器具有較高的反應(yīng)活性，能夠大幅度提高酶與底物的反應(yīng)速度。
3.具有剛性結(jié)構(gòu)，能夠耐受一定范圍的機(jī)械壓力，壓力適用范圍為0-40MPa。
4.應(yīng)用簡(jiǎn)便，適用范圍廣。本發(fā)明使用多種單體在高級(jí)醇混合溶液中進(jìn)行原位聚合，得到連續(xù)、均勻的多孔結(jié)構(gòu)整體基質(zhì)；通過(guò)基質(zhì)表面的活性基團(tuán)，蛋白質(zhì)或蛋白酶分子可以被牢固地結(jié)合在整體基質(zhì)上，可制得高活性的固定化酶反應(yīng)器。該方法具有穩(wěn)定性高，簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)固定化方法相比，制得的整體基質(zhì)上具有高活性的反應(yīng)基團(tuán)，可以快速地與蛋白質(zhì)等具有伯胺基的分子進(jìn)行反應(yīng)，制備方法簡(jiǎn)單，也縮短了制備酶反應(yīng)器的時(shí)間。


圖1為新型整體基質(zhì)合成示意圖。
圖2為新型整體基質(zhì)掃描電鏡圖。
圖3為新型整體基質(zhì)壓力與流量關(guān)系圖。
圖4為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中新型整體基質(zhì)的整體柱形式；其中a為整體基質(zhì)，b為檢測(cè)窗口，c為空管。
圖5為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中新型整體基質(zhì)的芯片形式。其中a為整體基質(zhì)，b為檢測(cè)窗口，c為空管。
圖6為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中新型整體基質(zhì)固載胰蛋白酶后，水解小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的電泳分離譜圖。
圖7為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中新型整體基質(zhì)固載胰蛋白酶后，水解細(xì)胞色素c產(chǎn)物的色譜分離譜圖。
圖8為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中不同條件下制得新型整體基質(zhì)壓力與流量關(guān)系圖。
圖9為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中不同條件下制得的新型整體基質(zhì)在固載胰蛋白酶后，水解小分子底物N-苯?；?L-精氨酸乙酯(BAEE)的電泳分離譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.整體基質(zhì)的制備按圖1所示，選擇以丙烯酰琥珀酰亞胺(NAS)和丙烯酰胺作為單體，乙叉二甲基丙烯酸(EDMA)作為交聯(lián)劑合成多孔整體基質(zhì)。毛細(xì)管內(nèi)壁預(yù)先經(jīng)帶雙鍵功能團(tuán)的硅烷試劑(甲級(jí)丙烯酸(3-三甲氧基硅氧基)丙酯，γ-MAPS)改性，單體在其中聚合并通過(guò)化學(xué)鍵固定在毛細(xì)管壁上。NAS上的琥珀酰亞胺作為活性反應(yīng)基團(tuán)用來(lái)衍生固定蛋白質(zhì)分子，具體是將這樣的多孔材料原位聚合在毛細(xì)管中制作成整體柱并應(yīng)用于底物水解實(shí)驗(yàn)。稱取NAS62.5mg，丙烯酰胺62.5mg和EDMA125mg、溶于750mg環(huán)己醇/十二醇(質(zhì)量比85/15)的混合溶劑中，加熱至60℃，震蕩混勻，冷卻到25℃后，加入2.5mg引發(fā)劑AIBN，通氮?dú)?min后，超聲除氣5min。在室溫下，用注射器取上述溶液注入毛細(xì)管中，兩端用硅橡膠封閉，置于55℃水浴中反應(yīng)6小時(shí)。
2.整體基質(zhì)的表征其掃描電鏡如圖2，其壓力與流量關(guān)系如圖3。外觀為圖4的整體柱形式，圖5為芯片形式3.蛋白酶的固定化將制得的整體基質(zhì)用甲醇沖洗30min，然后連續(xù)通入含50mM苯甲脒、2mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)的500mM NaCl/200mMNaHCO3緩沖溶液，反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后，使用500mM NaCl/200mM NaHCO3緩沖溶液連續(xù)沖洗整體基質(zhì)。
4.使用該整體基質(zhì)固載胰蛋白酶分子后，制得酶反應(yīng)器的應(yīng)用小分子底物N-苯?；?L-精氨酸乙酯(BAEE)的水解，如圖6；大分子底物細(xì)胞色素c的水解，如圖7，表1。
表1本發(fā)明實(shí)施例1中新型整體基質(zhì)固載胰蛋白酶后，水解細(xì)胞色素c產(chǎn)物經(jīng)多極質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后的結(jié)果。

實(shí)施例21.整體基質(zhì)的制備按圖1所示，選擇以丙烯酰琥珀酰亞胺(NAS)和丙烯酰胺作為單體，乙叉二甲基丙烯酸(EDMA)作為交聯(lián)劑合成多孔整體基質(zhì)。毛細(xì)管內(nèi)壁預(yù)先經(jīng)帶雙鍵功能團(tuán)的硅烷試劑(甲級(jí)丙烯酸(3-三甲氧基硅氧基)丙酯，γ-MAPS)改性，單體在其中聚合并通過(guò)化學(xué)鍵固定在毛細(xì)管壁上。NAS上的琥珀酰亞胺作為活性反應(yīng)基團(tuán)用來(lái)衍生固定蛋白質(zhì)分子，具體是將這樣的多孔材料原位聚合在毛細(xì)管中制作成整體柱并應(yīng)用于底物水解實(shí)驗(yàn)。稱取稱取如表2所示配比的單體與致孔劑，加熱至80℃，震蕩混勻，冷卻到25℃后，加入引發(fā)劑AIBN，通氮?dú)?min后，超聲除氣5min。在室溫下，用注射器取上述溶液注入毛細(xì)管中，兩端用硅橡膠封閉，置于70℃水浴中反應(yīng)12小時(shí)。
2.整體基質(zhì)的表征其壓力與流量關(guān)系如圖8。外觀為圖4的整體柱形式，圖5為芯片形式3.蛋白酶的固定化將制得的整體基質(zhì)用甲醇沖洗30min，然后連續(xù)通入含50mM苯甲脒、2mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)的500mM NaCl/200mMNaHCO3緩沖溶液，反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后，使用500mM NaCl/200mM NaHCO3緩沖溶液連續(xù)沖洗整體基質(zhì)。
4.使用該整體基質(zhì)固載胰蛋白酶分子后，制得酶反應(yīng)器的應(yīng)用小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的水解，如圖9
表2本發(fā)明實(shí)施例2中制備新型整體基質(zhì)各單體以及致孔劑的配比。

權(quán)利要求
1.一種固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)，其特征在于以丙烯酰琥珀酰亞胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作為單體，在二元高級(jí)醇的混合溶液中進(jìn)行原位聚合，得到一種具有多孔結(jié)構(gòu)的剛性基質(zhì)。
2.一種權(quán)利要求1所述固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)的制備方法，其特征在于具體步驟如下，1)丙烯酰琥珀酰亞胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作為單體，在二元高級(jí)醇的混合溶液中進(jìn)行混合；其中三種單體質(zhì)量占單體總質(zhì)量的百分比范圍為丙烯酰琥珀酰亞胺20-30％；乙叉二甲基丙烯酸40-60％；丙烯酰胺20-30％；2)在聚合溶液中加入引發(fā)劑，在50-70℃下進(jìn)行加熱引發(fā)聚合反應(yīng)或在200-400nm紫外燈照射下進(jìn)行光引發(fā)聚合反應(yīng)。
3.按照權(quán)利要求2所述固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)的制備方法，其特征在于制備基質(zhì)時(shí)使用高級(jí)醇混合溶液作為致孔劑，所述高級(jí)醇為，良溶劑正丙醇或環(huán)己醇；弱溶劑1，4-丁二醇、正癸醇或十二醇；其用量為占聚合物總質(zhì)量的60-80％；在二元高級(jí)醇混合溶液中的良溶劑與弱溶劑質(zhì)量比范圍為85-50％。
4.按照權(quán)利要求2所述固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)的制備方法，其特征在于所述引發(fā)劑為AIBN，其加入量占單體總質(zhì)量的0.5-2％；在室溫下加入引發(fā)劑后，除氣，置于50-70℃下反應(yīng)不少于6小時(shí)。
5.按照權(quán)利要求2所述固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)的制備方法，其特征在于所述三種單體加入混合溶劑中后加熱至50-80℃，震蕩混勻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固載蛋白質(zhì)的多孔整體基質(zhì)，以丙烯酰琥珀酰亞胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作為單體，在二元高級(jí)醇的混合溶液中進(jìn)行原位聚合，得到一種具有多孔結(jié)構(gòu)的剛性基質(zhì)。通過(guò)基質(zhì)表面的活性基團(tuán)，蛋白質(zhì)或蛋白酶分子可以被牢固地結(jié)合在整體基質(zhì)上，制得高活性的固定化酶反應(yīng)器。該方法具有穩(wěn)定性高，簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)固定化方法相比，制得的整體基質(zhì)上具有高活性的反應(yīng)基團(tuán)，可以快速地與蛋白質(zhì)等具有伯胺基的分子進(jìn)行反應(yīng)，制備方法簡(jiǎn)單，也縮短了制備酶反應(yīng)器的時(shí)間。
文檔編號(hào)C07K17/00GK1982348SQ200510047989
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月14日
發(fā)明者張玉奎, 段繼誠(chéng), 張麗華, 張維冰, 梁振 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所