專利名稱：雞ibdv vp2蛋白中和性b細胞抗原表位ⅱ及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子的免疫學領域，特別是涉及一系列雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位及其應用。
二.
背景技術：
雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雞的急性、高度接觸性、殺淋巴細胞性的傳染病。1957年在美國的Delaware州的Gumboro鎮(zhèn)的肉雞群中首次發(fā)生，又稱甘布羅病。1962年Winterfield分離鑒定出IBDV。該病在美國及世界各國均有發(fā)生和流行。1988~1992年在我國大面積暴發(fā)流行，造成巨大的經濟損失。研究發(fā)現，IBD是一種以體液免疫反應為主的免疫損傷性疾病。IBDV屬于雙RNA病毒科(Birnaviridae)，禽雙RNA病毒屬(avianbirnavirus)，該病毒有兩個血清型，血清I型對雞致病，II型僅感染火雞但不致病。IBDV病毒粒子為單層衣殼，無囊膜，呈二十面體對稱，直徑為60-70nm，氯化銫中浮密度為1.31-1.34，對乙醚和氯仿不敏感，高度抗酸。
雞傳染性法氏囊病病毒IBDV為雙鏈RNA病毒，其基因組由A，B兩個片段組成。A片段由3200-3300bp核苷酸組成，B片段由2800-2900核苷酸組成。A片段含有一個大的開放閱讀框架(ORF)和一個小ORF。大ORF編碼有1012個氨基酸組成的病毒前體多聚蛋白(polyprotein)，分子量約為110kD。該前體蛋白由VP2，VP4和VP3組成。小ORF編碼分子量約17kD的VP5蛋白。B片斷編碼病毒蛋白VP1，該蛋白為RNA依賴性的RNA聚合酶，與病毒的復制和組裝有關。
VP2蛋白為IBDV的主要保護性抗原，含有中和性B細胞抗原表位。保護性抗原是作為疫苗使用的推薦抗原。在保護性抗原中具有中和作用的B細胞抗原表位在刺激中和性抗體產生中起重要作用。抗原表位又稱抗原決定簇，是指能夠被抗體、TCR/MHC復合物結合并識別的抗原片斷。其中，能夠被抗體結合并識別的抗原表位稱為B細胞抗原表位；能夠被TCR/MHC復合物結合并識別的抗原表位稱為T細胞抗原表位。當病毒抗原進入機體后，保護性抗原與B淋巴細胞表面的抗原受體分子sIgM和IgD結合而導致B淋巴細胞活化和克隆化增值，并產生針對特異性B細胞抗原表位的抗體，發(fā)揮免疫保護作用。因此，B細胞抗原表位決定著機體產生抗體的特異性，是誘導體液免疫的基本單位。對特定病毒的蛋白質抗原來說，鑒定其B細胞抗原表位便是揭示病毒體液免疫的本質。
蛋白質抗原B細胞抗原表位鑒定中常用的方法有基因工程定點突變表達抗原蛋白分析法、隨機噬菌體肽庫技術和合成多肽檢測技術等。定點突變表達抗原蛋白方法是最常用的技術之一，該方法方便、簡單、成本低，但是，該方法只能粗略地鑒定出蛋白質抗原中發(fā)揮抗原性的關鍵氨基酸位點，不能最終確定該抗原表位的最短氨基酸序列，也不能區(qū)分出該抗原表位是屬于線性表位還是構像性表位。噬菌體肽庫技術能夠模擬表達與特異性配體結合的多肽序列，經過多輪篩選后可以測序分析出與某一抗原特定抗體結合的抗原表位，不僅可以測定線性抗原表位，而且還能模擬構像性抗原表位。合成多肽技術可以最明確地鑒定出某一蛋白抗原中特定的線性B細胞表位。本項發(fā)明應用基因工程技術重疊(overlapping)表達IBDV的VP2結構蛋白，用體外免疫反應初步確定VP2中與特異性中和性單抗結合的區(qū)域；然后，應用肽庫技術和overlapping合成多肽技術確定該結構蛋白上的線性最短氨基酸序列及模擬構像表位；最后，再應用合成多肽技術驗證表位的正確性。
三.

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一系列雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位以及它們的應用。
本發(fā)明的技術方案是一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列為Seq No 1197H-Cys-Asp-Ser-Ser-Asp-Arg-Pro-Arg-Val-Tyr-Thr-Ile-Thr-OH209。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列向C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白氨基酸序列擴展，擴展后的氨基酸序列為Seq No 2197H-Cys-Asp-Ser-Ser-Asp-Arg-Pro-Arg-Val-Tyr-Thr-Ile-Thr-Ala-Ala-Asp-Asp-Tyr-Gln-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Gln-Pro-Gly-Gly-OH224。
一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列為Seq No 3327H-Trp-Ser-Ala-Arg-Gly-Ser-Leu-Ala-Val-Thr-Ile-His-Gly-OH339。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列向C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白氨基酸序列擴展，擴展后的氨基酸序列為Seq No 4327H-Trp-Ser-Ala-Arg-Gly-Ser-Leu-Ala-Val-Thr-Ile-His-Gly-Gly-Asn-Tyr-Pro-Gly-Ala-Leu-Arg-Pro-Val-Thr-Leu-Val-OH352。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位為合成多肽。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位在N端或C端進行化學修飾。
所述的化學修飾為多肽鏈N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或其連接物在制備免疫原，或免疫動物，或產生免疫保護上的應用。
所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或其連接物在檢測抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV抗體或抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV多肽抗體上的應用。
本發(fā)明涉及的由表位多肽組成的免疫原或疫苗，至少包括權利要求中提及的一個抗原表位至全部抗原表位，這些多肽通過自身連接、相互連接或與載體連接，并輔以T細胞抗原表位，包括Th1和/或Th2表位多肽。這些T細胞抗原表位可以來源于IBDV病毒蛋白或其它動物蛋白中具有刺激機體細胞免疫活性的多肽序列。
檢測雞IBDV病毒可以應用針對VP2的單克隆抗體或者應用針對VP2多肽抗體，檢測方法可以包括瓊脂擴散試驗、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、快速檢測試紙條免疫膜層析技術等。
檢測雞IBDV抗體，包括母源抗體、疫苗免疫抗體、野毒感染產生抗體、抗雞IBDV單克隆抗體等。檢測方法可以包括瓊脂擴散試驗、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、快速檢測試紙條免疫膜層析技術等。
本發(fā)明的積極有益效果是1.由雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位設計的免疫原或疫苗免疫動物機體后能夠產生針對IBDV的中和性抗體，并能夠在體內或體外中和IBDV，阻止病毒感染動物機體。
2.由本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白中和性B細胞抗原表位設計的免疫原或疫苗能夠預防雞IBD經典毒株、超強毒株或/和變異毒株的感染。
3.本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白中和性B細胞抗原表位與載體連接或自身連接或相互連接，能夠免疫動物，在免疫動物時產生的抗多肽抗體或抗雞傳染性法氏囊病病毒抗體能夠在體內外中和雞傳染性法氏囊病病毒IBDV病毒并產生免疫保護。
4.本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或其連接物在免疫動物時產生的抗多肽抗體或抗IBDV抗體能夠檢測IBDV病毒或其多肽。
5.本發(fā)明的雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或其連接物能夠檢測抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV抗體或抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV多肽抗體。
四.


圖1為表位多肽Seq No 1和Seq No 3檢測雞IBDV血清抗體和單克隆抗體結果圖中從左至右依次為IBDV陽性血清1、陽性血清2、IBDV單抗、BSA對照、陰性血清對照。
五.
具體實施例方式實施例一雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位片斷的基因克隆SPF種蛋孵育至11目齡，取雞胚胎制備雞胚成纖維細胞，接種IBDV-H4株病毒，37℃培養(yǎng)96小時，收取病毒。以超速離心和40~60％蔗糖密度梯度離心分離病毒，獲得病毒粒子。用TRIZOL法抽提病毒總RNA，用蛋白酶K處理基因組RNA，降解RNA雙鏈分子，以此為模板應用RT-PCR方法擴增IBDV A片斷基因。回收純化PCR產物，并與pGEM-T載體連接，轉化大腸桿菌，構建A片斷基因克隆。
根據VP2結構特征和抗原性分析結果設計用于overlapping表達病毒蛋白的系列引物，PCR擴增VP2及VP2基因片斷。構建VP2及其片斷的原核表達載體，并在pET系統(tǒng)原核表達病毒抗原，表達的病毒抗原經溶解復性后，制備免疫原，免疫BALB/C小鼠，制備單克隆抗體。
根據Biolabs公司的噬菌體肽庫手冊進行IBDV中和性單抗的系列篩選。①用LB/IPTG/xgal擴增M13噬菌體肽庫并進性滴度測定；②IBDV單抗標記免疫親和磁珠；③免疫親和磁珠與2×1011擴增的噬菌體反應60min；④PBST洗10次，洗去未結合的噬菌體；⑤應用免疫親和磁分離技術收集與IBDV單抗結合的噬菌體；⑥洗脫與單抗結合的噬菌體；⑦洗脫噬菌體的擴增與滴度測定；⑧重復③~⑦步操作進行肽庫的第二至三輪淘選；⑨第三輪淘選后從LB/IPTG/xgal平板上挑選藍斑菌落進行擴增，提取噬菌體DNA并進行序列測定；⑩用IBDV快速檢測試紙條進一步鑒定噬菌體展示多肽的反應性。最后應用肽庫抗原表位分析程序分析確定克隆物質為雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位。
實施例二Fmoc固相多肽合成法overlapping合成系列VP2抗原肽片斷并進行Dot-ELISA篩選根據原核表達VP2及overlapping表達VP2抗原片斷的間接ELISA單抗反應譜，以及噬菌體肽庫技術篩選的VP2中和抗體位點序列，確定overlapping合成多肽的初步序列。并應用Chou and Fasman算法用計算機分析這些多肽片斷的二級結構特征、親水性、抗原性、表面可及性等特性，設計合成多肽的序列。并應用peptide程序分析合成難度特性，設計多肽合成程序，應用多肽合成儀進行自動合成和手工合成相結合的方法合成多肽序列。具體流程如下設計合成多肽序列→peptide程序分析→設計合成程序→按樹脂的取代值計算并稱取Fmoc-AA-Wang-resin或Rink resin→DMF溶漲樹脂→*加20％piperidine脫Fmoc保護，攪動6min→*加下一位氨基酸和HBTU進行?；磻琋2攪動反應30min→*用Kaiser法或TNBS法測試反應的完成情況→*DMF洗5次，每次1min→重復帶有*的步驟，在樹脂上連接下一位氨基酸，直到該多肽序列合成完成→根據組成肽鏈氨基酸不同選取適當的試劑用TFA法裂解肽鏈與樹脂的連接→冷乙醚沉淀TFA多肽→Sephadex G-25脫鹽純化→LC-MS和HPLC分析鑒定和純化多肽→多肽與載體的偶聯→Dot-ELISA測試中和性單抗與多肽的反應性→分析IBDV中和性單抗反應性B細胞抗原表位。
實施例三雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位的合成根據VP2蛋白中和性B細胞抗原表位的氨基酸序列，應用固相多肽合成技術，采用自動多肽合成儀或人工多肽合成方法。固相樹脂采用Fmoc保護的氨基酸Wang樹脂或其它樹脂，樹脂經DMF溶漲、piperidine脫Fmoc保護后，根據氨基酸序列順序，加入Fmoc保護的氨基酸，在HBTU存在情況下進行?；磻?。?；磻瓿珊蠼涍^洗滌，再加入第二位的Fmoc-氨基酸進行?；磻⑾礈?。如此循環(huán)，從多肽序列C末端起始向N末端，按照序列順序合成完整的多肽鏈。合成完成后，根據組成肽鏈氨基酸不同選取適當的試劑用TFA法裂解肽鏈與樹脂的連接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，經脫鹽純化、LC-MS和HPLC分析鑒定后備用。在整個合成過程中，每個氨基酸?；磻罂梢詰肒aiser法或TNBS法測試反應的完成情況。為了便于使表位多肽和載體蛋白連接，在合成多肽時可以在多肽序列的N末端添加一個半胱氨酸。
以氨基酸序列81H-Lys-Phe-Asp-Gln-Met-Leu-OH86為例合成5μmol多肽所需試劑和操作流程如下主要試劑N，N-二甲基甲酰氨(DMF)；脫保護試劑I20％Piperidine/DMF；脫保護試劑II二氯甲烷(DCM)；縮合、活化試劑2-(1H-苯并三哇)-N，N，N’，N’一四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)溶于NMM(N-甲基嗎啡啉)/DMF；切割試劑94％三氟乙酸(TFA)；20種Fmoc保護氨基酸(25μmol/L)Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-Asn(tBu)-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH。主要樹脂Fmoc-Leu-Wang-Resin；Symphony多肽合成儀美國Protein Technology公司。
多肽合成中氨基酸偶聯步驟根據目的肽鏈產量，稱量10mg Fmoc-Leu-WangResin放入反應瓶；(1)加入1.25ml DMF，混合10分鐘，用N2吹掉DMF，重復3次以上；(2)加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合5分鐘，用N2吹掉液體，加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合反應15分鐘；(3)重復步驟(1)；(4)加入1.25ml 25μM的Fmoc-Met-OH；加入1.25ml 0.4NMM/DMF，混合反應45分鐘以上，用N2吹掉液體；(5)重復步驟(1)；(6)重復步驟1～5依次加入Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH完成多肽序列中每個氨基酸的偶聯；(7)氮氣吹干樹脂。
已合成完畢的目的肽的切割基本步驟如下(1)加入1.25ml DMF，混合10分鐘，用N2吹掉DMF，重復3次以上；(2)加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合5分鐘，用N2吹掉液體，加入1.25ml 20％Piperidine/DMF，混合15分鐘；(3)重復步驟(1)；(4)用DCM洗滌三次以上；(5)加入94％TFA混合反應2小時以上；(6)收集切割產物。
多肽合成產物粗提將無水乙醚緩緩加入收集的產物中，冰浴10分鐘，3000rpm，離心10分鐘，留沉淀，棄上清，重復3次，沉淀物用凍干機干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∩倭繕悠酚糜贖PLC，GC-MS檢測。
實施例四雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位的化學修飾按照實施例三的方法合成的多肽片斷，其N末端為自然氨基修飾，C末端為自然羧基修飾。
N末端乙?；揎椃椒ò凑找陨辖榻B的多肽合成方法合成至最后一個Fmoc保護氨基酸偶聯結束，并進行N末端Fmoc保護集團的去除，然后進行以下操作。取150μl(2.6μmol)乙酸酐和20μl(0.1μmol)EIPEA溶于4.8mlDMF中，充分混合并在冰浴中冷卻。然后將以上混合溶液加入多肽合成反應瓶中反應5分鐘。再依次用5ml DMF和二氯甲烷(DCM)洗2次，每次5分鐘。氮氣吹干后按照前述常規(guī)合成方法進行側鏈保護集團的去除、裂解、純化和鑒定。
C末端酰胺化修飾方法C末端酰胺化的多肽合成時應選用樹脂為Rink樹脂。執(zhí)行合成程序時應對樹脂用DMF溶漲20分鐘，然后從C末端第一位氨基酸開始執(zhí)行合成程序，同前述Fmoc-wang樹脂合成方法。
實施例五雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位與載體蛋白KLH和BSA的連接實驗材料包括表位多肽；血藍蛋白(KLH)，Pierce公司；牛血清白蛋白(BSA)，DMSO，Sigma公司；連接劑Sulfo-SMCC，Pierce公司產品。
載體蛋白KLH或BSA 4mg溶于0.5ml含5mM EDTA的PBS緩沖液，pH 7.2，加入1.0mg連接劑Sulfo-SMCC，充分溶解后在室溫孵育60分鐘或37℃孵育30分鐘。應用Sephadex G-25脫鹽柱或透析法純化Sulfo-SMCC處理的載體蛋白，并用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce公司)測定蛋白含量，備用。
表位多肽合成完畢后，準確稱量4mg，加入0.5ml雙蒸餾水溶解多肽，若多肽溶解性不好可以加適量DMSO促溶。然后將溶解后的多肽與Sulfo-SMCC處理的載體蛋白混合，4℃孵育2小時或過夜，備用。
實施例六雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位氧化實現自身的連接含半胱氨酸的表位多肽可以通過巰基的氧化反應形成自身連接。一般情況下應用DMSO介導的氧化反應實現連接，根據多肽的酸堿性，氧化反應可以在微酸或微堿性情況下進行。
微酸性環(huán)境下的氧化反應用適當濃度的醋酸水溶解多肽，使多肽的濃度在0.5-1.5Mm范圍內，醋酸的終濃度不超過5％，用(NH4)2CO3調整多肽溶液的pH為6.0左右，加入10-20％的DMSO，25℃反應5-25h，氧化反應的進行程度可以通過HPLC監(jiān)測。然后，用1％TFA水和乙腈為流動相，制備型反相HPLC純化氧化性多肽，備用。
微堿性環(huán)境下的氧化反應用0.01M磷酸鹽緩沖液，pH7.5，溶解多肽至終濃度1.0mM，加入終濃度1％的DMSO，25℃反應過夜，氧化反應的進行程度可以通過HPLC監(jiān)測。然后，用1％TFA水和乙腈為流動相，制備型反相HPLC純化氧化性多肽，備用。
實施例七雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位應用連接劑的連接含半胱氨酸的表位多肽以及不含半胱氨酸的表位多肽通過N端α氨基或賴氨酸ε氨基應用戊二醛或碳化二亞胺(EDC)(Fluka公司產品)等同型雙功能試劑進行自身連接、相互連接或與載體連接。
稱取1mg BSA用活化緩沖液(0.1M MES，0.5M NaCl，pH5.7)配成濃度為1mg/ml的溶液，加入0.4mg EDC(2mM)和0.6mg NHS(Fluka產品)，充分混合后室溫反應15分鐘，加入終濃度為20mM的巰基乙醇，加入1.0mg表位多肽，室溫反應2小時；然后，加入0.7mg鹽酸羥胺，室溫反應30分鐘；最后，應用Sephadex G-25脫鹽純化，以活化緩沖液為平衡洗脫溶液，280nm紫外波長檢測，收集第一個流出組分為多肽連接物，經無菌過濾后4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例八雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位間接ELISA檢測雞IBDV抗體的試驗VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或表位多肽與載體的連接物為包被抗原，以BSA為對照抗原，包被96孔酶標板(聚苯乙烯微孔板)。用pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原至終濃度1.0μg/ml，按50μl/孔加入酶標板中，4℃孵育過夜。然后用PBST洗液(PBS+0.05％Tween)洗滌酶標板6次，2％BSA洗液封閉酶標板2小時，用于檢測IBDV抗體。
檢測抗體時，依次進行入下操作加入待檢血清(或進行倍比稀釋血清用于檢測抗體效價)，37℃孵育30-60分鐘，PBST洗液洗滌酶標板6次；加入羊抗雞IgG辣根過氧化物酶酶標二抗(Goat-antichicken IgG-HRP)或抗雞IgG單抗-HRP酶標二抗，37℃孵育30-60分鐘，PBST洗液洗滌酶標板6次；加入HRP底物和顯色劑，室溫避光孵育5-10分鐘觀察顏色反應；待充分顯色后，加入2％硫酸終止顏色反應；用酶標儀(Bio-Rad)在波長450nm讀取反應板孔的吸光值；判定結果。
判定結果時，以樣品板孔的吸光值為對照板孔吸光值3倍時，判為反應陽性；以反應陽性血清的最大稀釋倍數為該樣品血清的抗體效價。
實施例九雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位Dot-ELISA檢測雞IBDV抗體的試驗VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或表位多肽與載體的連接物為包被抗原，以BSA為對照抗原。用點膜儀(Bio-Dot)在硝酸纖維素膜(Millipore)上定量噴點包被抗原，1-2μg/點，37℃固定30分鐘，PBST洗滌6次，10％脫脂乳洗液封閉過夜，PBST洗滌6次，即可用于抗體檢測。
檢測抗體時，將待檢血清樣品定量稀釋后和抗原包被膜37℃孵育30分鐘，PBST洗滌6次，加入羊抗雞IgG辣根過氧化物酶酶標二抗(Goat-antichickenIgG-HRP)或抗雞IgG單抗-HRP酶標二抗，37℃孵育30-60分鐘，PBST洗液洗滌酶標板6次；加入AEC或DAB底物顯色，室溫避光孵育5-10分鐘觀察顏色反應。
結果判定時，以包被抗原點呈現棕紅色顏色反應，對照抗原點不出現顏色反應進行判定。
實施例十雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位免疫原的制備及免疫實驗雞IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位抗原作為免疫原制備時的抗原。首免抗原用弗氏完全佐劑(Sigma)和抗原乳化，以每條多肽5-10μg免疫動物；二、三免時應用弗氏不完全佐劑(Sigma)和抗原乳化，以每條多肽5-10μg免疫動物。免疫途徑為皮下或肌肉注射。免疫時間首免為7-14日齡，二免為首免后14日，以后根據免疫抗體水平可以進行加強免疫。
實施例十一應用VP2單克隆抗體檢測雞傳染性法氏囊病病毒的實例應用VP2單克隆抗體檢測雞IBDV病毒可以采用瓊脂擴散試驗，雙抗體夾心ELISA試驗，以及雙單克隆抗體免疫膜層析試紙條試驗等。待檢樣品可取雞法氏囊、肝臟、脾臟、腎臟等組織，將這些組織按1∶5比例用生理鹽水或PBS緩沖液勻漿處理，3000rpm離心30分鐘，取上清懸液待檢。
瓊脂擴散試驗檢測時，在瓊脂平板中打7孔梅花孔，中間孔加入VP2單克隆抗體，周邊孔加入待檢樣品、標準陽性樣品和陰性樣品等，每孔各50μl，放入濕盒中，37℃孵育12-24小時，觀察結果。結果判定以標準陽性樣品和VP2單克隆抗體孔之間出現沉淀線，陰性樣品與VP2單克隆抗體孔之間不出現沉淀線時，樣品孔與VP2單克隆抗體孔之間出現沉淀線的樣品為陽性樣品，否則為陰性樣品。
雙抗體夾心ELISA試驗檢測時，以一株VP2單克隆抗體為包被抗體包被酶標板，包被濃度為10μg/ml，包被方法按實施例八進行。檢測時，將適當稀釋的待檢樣品加入包被好的酶標板，50μl/孔，37℃孵育30分鐘，PBST洗滌6次，然后加入HRP標記的另一株VP2單克隆抗體，50μl/孔，37℃孵育30分鐘，PBST洗滌6次，用HRP底物顯色，判定結果。
雙單克隆抗體免疫膜層析試紙條檢測時，以一株VP2單克隆抗體和膠體金偶聯噴涂玻璃棉，將另一株VP2單抗及兔抗鼠IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測線和對照線，然后按照試紙條的組裝方法將樣品墊、膠金棉、硝酸纖維素膜、吸水墊按試紙條的組裝方式組裝成免疫膜層析試紙條(詳細方法參照中國發(fā)明專利ZL99101537.1，“畜禽疫病快速檢測試紙條”張改平等，1999年)，用于檢測。檢測時，將試紙條的測試端插入適當稀釋的待檢樣品液中10-20秒，取出后平放1-5分鐘，然后判定結果。試紙條出現兩條線(檢測線和對照線)時判為陽性，即該雞感染IBDV病毒，試紙條只出現一條對照線時判為陰性。
實施例十二應用抗VP2表位多肽抗體檢測雞傳染性法氏囊病病毒的實例雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位抗體的制備同實施例十，檢測雞IBDV病毒時樣品處理和檢測方法參照實施例十一。
實施例十三應用雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位檢測雞IBDV抗體以Peptide-Dot-ELISA檢測合成多肽與抗雞IBDV單抗或雞IBDV抗血清的反應性。將表位多肽Seq No 1和Seq No 3等量混合后按實施例五的方法與載體蛋白BSA連接，制備包被抗原。用點膜儀(Bio-Dot)在硝酸纖維素膜(Millipore)上定量噴點BSA-Pep，37℃固定30min，PBST洗滌6次；10％脫脂乳PBST封閉硝酸纖維素膜，孵育過夜，PBST洗滌6次；將包被抗原膜在反應槽與待檢樣品反應(抗雞IBDV單抗或雞IBDV抗血清)，37℃孵育30-60min，PBST洗滌6次；在反應槽中加入PBST 1∶100稀釋的GAM-IgG-HRP或RACh-IgY-HRP工作溶液，37℃孵育30-60min，PBST洗6次；加入底物溶液AEC，RT孵育10min，待充分顯色后，以PBST清洗終止顯色反應，觀察結果，呈紅棕色顯色的為陽性樣品，結果如圖1所示。
實施例十四雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位的免疫試驗表位多肽Seq No 1和Seq No 3等量混合后按實施例五的方法與載體蛋白KLH連接，制備多肽免疫原。免疫5只Balb/c小鼠，對照組用無關隨機多肽免疫。免疫劑量50μg/只，首免佐劑使用FCA，二、三次免疫佐劑使用FIA。按0，14，28日齡免疫程序進行免疫，42日齡采血分離血清，用Peptide-ELISA測定抗體效價并進行中和試驗。應用固定病毒稀釋血清方法進行多肽抗體的中和試驗。試驗在96孔培養(yǎng)板中進行，每孔含104雞胚成纖維細胞(CEF)。小鼠抗多肽(Seq No 1和Seq No 3)抗體，IBDV單抗(陽性對照)，小鼠抗隨即無關多肽抗體(陰性對照)倍比稀釋后，每孔加入102TCID50的IBDV。室溫中和反應45min后，加入含CEF細胞孔中，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察細胞病變(CPE)，并計算中和效價。
應用間接ELISA檢測小鼠抗多肽抗體，結果顯示5只免疫多肽小鼠中4只(M1，M2，M4和M5)產生了高滴度的抗多肽抗體(表1)，其效價可達1∶3200到1∶6400。中和試驗顯示抗多肽抗體對血清I型病毒(H4超強毒株和D78弱毒株)具有顯著的中和活性，而抗無關多肽抗體則不顯示中和活性(表2)
表1小鼠抗表位多肽抗體間接ELISA效價

a包被抗原為BSA連接的表位多肽AG-3和LG-4。
b5只免疫無關多肽小鼠血清效價的平均值。
表2 抗多肽抗體對血清I型IBDV的中和活性a

a CEF細胞上固定病毒(100TCID50)/稀釋抗體中和試驗b以無CPE出現的血清或單抗最高稀釋倍數的對數為該抗體的中和效價c小鼠抗表位多肽抗體為M1，M2，M4和M5號小鼠血清的混合d小鼠抗無關多肽抗體為5只對照小鼠的血清混合序列表<110>河南科技學院<120>雞IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位II及其應用<130>seq002<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(AVibirnavirus gen.)<400>1Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr1 5 10<210>2<211>28<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>2Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asp1 5 10 15Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly20 25
<210>3<211>13<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>3Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu Ala Val Thr Ile His Gly1 5 10<210>4<211>26<212>PRT<213>禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus gen.)<400>4Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu Ala Val Thr Ile His Gly Gly Asn Tyr1 5 10 15Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val20 2權利要求
1.一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列為Seq No 1197H-Cys-Asp-Ser-Ser-Asp-Arg-Pro-Arg-Val-Tyr-Thr-Ile-Thr-OH209。
2.根據權利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列向C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白氨基酸序列擴展，擴展后的氨基酸序列為Seq No 2197H-Cys-Asp-Ser-Ser-Asp-Arg-Pro-Arg-Val-Tyr-Thr-Ile-Thr-Ala-Ala-Asp-Asp-Tyr-Gln-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Gln-Pro-Gly-Gly-OH224。
3.一種雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列為Seq No 3327H-Trp-Ser-Ala-Arg-Gly-Ser-Leu-Ala-Val-Thr-Ile-His-Gly-OH339。
4.根據權利要求3所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其氨基酸序列向C端依照雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白氨基酸序列擴展，擴展后的氨基酸序列為Seq No 4327H-Trp-Ser-Ala-Arg-Gly-Ser-Leu-Ala-Val-Thr-Ile-His-Gly-Gly-Asn-Tyr-Pro-Gly-Ala-Leu-Arg-Pro-Val-Thr-Leu-Val-OH352。
5.根據權利要求1～4中任一項權利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDVVP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其特征是雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位為合成多肽。
6.根據權利要求1～4中任一項權利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDVVP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其特征是雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位在N端或C端進行化學修飾。
7.根據權利要求6所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其特征是所述的化學修飾為多肽鏈N端的自然氨基化或乙?；?，或C端的自然羧基化或酰胺化。
8.根據權利要求1～4中任一項權利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDVVP2蛋白中和性B細胞抗原表位，其特征是雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位制備的免疫原包括權利要求1～4中任一項權利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位序列。
9.一種權利要求1～4中任一項權利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或其連接物在制備免疫原，或免疫動物，或產生免疫保護上的應用。
10.一種權利要求1～4中任一項權利要求所述的雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位或其連接物在檢測抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV抗體或抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV多肽抗體上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子免疫學領域，主要涉及雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白的系列多肽片斷，特別是涉及VP2蛋白中組成B細胞抗原表位的系列多肽片斷，本發(fā)明同時涉及IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位在制備免疫原、免疫動物、產生免疫保護上的應用以及在檢測抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV抗體或抗雞傳染性法氏囊病病毒IBDV多肽抗體上的應用。由雞IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位設計的免疫原或疫苗免疫動物機體后能夠產生針對IBDV的中和性抗體，并能夠在體內或體外中和IBDV，阻止病毒感染動物機體，雞IBDV VP2蛋白中和性B細胞抗原表位表位疫苗能夠預防雞IBD經典毒株、超強毒株或/和變異毒株的感染。
文檔編號C07K7/00GK1687116SQ20051001745
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權日2005年3月29日
發(fā)明者王選年, 張改平, 李培慶, 王三虎, 王自良, 保銀梅 申請人:河南科技學院