嵌合hcv中和表位的hbv s抗原病毒樣顆粒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒及其制備方法和應用，屬于分子生物學和細胞生物學領域。該病毒樣顆粒表面展示不同的HCV中和抗原表位，嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠后可產(chǎn)生HCV中和表位特異性的中和抗體。該方法將HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原親水區(qū)，不影響其自我包裝，從而形成嵌合的病毒樣顆粒，表達HCV中和抗原表位。制備得到的四種病毒樣顆粒經(jīng)化后免疫BLAB/c小鼠可誘導產(chǎn)生表位特異性的中和抗體，產(chǎn)生的中和抗體能抑制HCVpp和HCVcc感染Huh7.5細胞。制備的嵌合病毒樣顆粒具有保護作用，能夠成為一種較理想的HCV預防性/治療性候選疫苗建立方法。
【專利說明】嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒及其制備方法 和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學和細胞生物學領域，涉及一種嵌合HCV中和表位的HBV S 抗原病毒樣顆粒及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)急性感染后易慢性化和發(fā)展成為肝硬化、肝細胞腫瘤或肝功 能衰竭。一直以來丙型肝炎的疫苗研制受到高度變異、缺乏細胞和小動物模型等多種原因 的限制而進展緩慢。HCV病毒中許多蛋白抗原（如核心蛋白、包膜蛋白和非結構蛋白）都 可誘導抗體產(chǎn)生。但在這些抗體中，只有針對包膜糖蛋白E1/E2的中和抗體具有保護作用。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，HCV包膜糖蛋白E1/E2存在保守的中和性抗原表位，針對這些表位的單克 隆抗體具有廣譜的交叉中和活性。以上研究結果使為中和表位疫苗的研究提供了依據(jù)。尋 求理想的載體，呈遞和表達中和抗原表位，成為HCV中和表位疫苗研究的方法之一。
[0003] 病毒樣顆粒（virus like particles, VLPs)是不含病毒顆粒，形態(tài)結構與天然病 毒顆粒相似的能自我裝配的病毒空殼。許多病毒結構蛋白都具有自主組裝成VLPs的能力。 由于VLPs不含病毒遺傳物質，所以不具備感染性，而具有很強的免疫原性和生物學活性， 廣泛應用于疫苗研究領域。VLPs在結構上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合體 VLPs并將外源性抗原展示在其表面，保留了天然病毒顆粒的空間構象和誘導中和抗體的抗 原表位，比亞單位疫苗和重組的蛋白疫苗具有更強的免疫原性，能夠激發(fā)機體體液免疫、細 胞免疫及粘膜免疫。
[0004] HBV小包膜蛋白抗原（HBsAg-S)基因大小為681bp，在無核心蛋白和基因組參與下 有自我裝配能力。其101?159位氨基酸區(qū)域為親水區(qū)，形成的雙環(huán)結構可表達外源性表 位蛋白，在哺乳動物細胞中形成與野生型病毒相似的VLPs，可分泌至細胞外。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒及其制備 方法和應用，該病毒樣顆粒表面展示不同的HCV中和抗原表位，嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠 后可產(chǎn)生HCV中和表位特異性的中和抗體。該方法將HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原 親水區(qū)，不影響其自我包裝，從而形成嵌合的病毒樣顆粒，表達HCV中和抗原表位。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0007] 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒是將HCV表位插入HBV S抗原親水區(qū)構建真核表達載體，再經(jīng)哺乳動物細胞體外裝配制得；其中，所述的HCV表位 為氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?4中任意一項所示的表位肽。
[0008] 氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?3所示的表位為高度保守的中和表位；氨基酸序列 如SEQ. ID. NO. 4所示的表位為高變區(qū)的模擬表位。
[0009] 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的表位為HCV El區(qū)線性中和表位；氨基酸序列如 SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2所示的表位為HCV E2區(qū)線性中和表位；所述高變區(qū)的模擬表 位為HCV E2模擬表位。
[0010] 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒的制備方法，
[0011] 包括以下步驟：
[0012] 1)在HBV S基因親水區(qū)引入Age I克隆位點
[0013] 將引入Age I克隆位點的全長S基因亞克隆至真核表達載體pCI-neo中，得到重 組真核表達載體PCI-HBS ;
[0014] 2)將HCV表位以引物合成的形式克隆入重組真核表達載體pCI-HBS中
[0015] 以 pCI-HBS 為模板，分別用 FElAge I/R2Xba I，F(xiàn)E2Age I/R2Xba I，F(xiàn)E3Age 1/ R2Xba I，F(xiàn)E4Age I/R2Xba I為引物，擴增得到引入不同表位的HBV S下游128-227位氨基 酸的堿基序列，擴增產(chǎn)物回收后連接入T-easy載體，分別得到T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3， T-HBSE4 ；
[0016] 3)構建嵌合HCV中和抗原表位真核載體
[0017] 將 T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3, T-HBSE4 分別用 Age I/Xba I 雙酶切，克隆入 Age I/Xba I雙酶切的pCI-HBS中，得到重組的嵌合HCV中和抗原表位的真核表達載體，分別為 pCI-HBSEl，pCI-HBSE2, pCI-HBSE3, pCI-HBSE4 ;
[0018] 4)病毒樣顆粒的制備
[0019] 分別將 pCI-HBSEl、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3 和 pCI-HBSE4 轉染哺乳動物細胞，轉染 48h后收集培養(yǎng)上清，定量測定HBsAg含量，得到四種不同的嵌合病毒樣顆粒VLPs，分別命 名為 VLPs-SEl、VLPs-SE2、VLPs-SE3 和 VLPs-SE4。
[0020] 步驟2)所述的以引物合成的形式克隆HCV表位所用到的引物F1、R1、F2、R2、FE1、 FE2、FE3和FE4的核苷酸序列分別如SEQ. ID. NO :5?12所示。
[0021] 步驟4)所述的哺乳動物細胞為HEK293T、Hela或Huh7. 5細胞。
[0022] 步驟4)采用磷酸鈣法或脂質體法轉染哺乳動物細胞。
[0023] 步驟4)是采用羅氏E601電化學發(fā)光分析儀對HBsAg含量進行定量測定。
[0024] 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒在制備用于治療HCV感染病癥的疫苗 中的應用。
[0025] 所述的疫苗為抑制HCVpp和HCVcc感染Huh7. 5細胞的疫苗。
[0026] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果：
[0027] 本發(fā)明將HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原親水區(qū)，不影響其自我包裝，從而形 成嵌合的病毒樣顆粒，表達HCV中和抗原表位。本發(fā)明制備得到四種HCV中和抗原表位 嵌合病毒樣顆粒，能夠在小鼠體內誘導出表位特異性中和抗體，血清中和抗體能抑制HCVpp 和HCVcc感染Huh7. 5細胞，嵌合病毒樣顆粒表現(xiàn)出了良好的中和效應，具有保護作用。為 進一步設計中和抗體疫苗提供了新的技術方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為HCV中和抗原表位嵌合入HBV S抗原親水區(qū)設計圖；
[0029] 圖2為嵌合HCV中和抗原表位真核表達載體構建瓊脂糖電泳結果圖；
[0030] 圖3為嵌合HCV中和抗原表位的HBV S基因的表達分析間接免疫熒光結果圖；
[0031] 圖4為嵌合HCV中和抗原表位及HBV S基因的表達分析Western blot條帶結果 圖；
[0032] 圖5為蔗糖密度梯度離心不同分離片段HBsAg定量分析圖；
[0033] 圖6為純化嵌合病毒樣顆粒電鏡分析結果圖；其中，A:VLPs-SEl ;B:VLPs-SE2 ; C:VLPs-SE3 ；D:VLPs-SE4 ；
[0034] 圖7為純化嵌合病毒樣顆粒定量分析圖；
[0035] 圖8為純化嵌合病毒樣顆粒免疫BALB/c小鼠中和抗體測定圖譜；
[0036] 圖9為小鼠血清中和抗體抑制HCVpp感染Huh7. 5細胞分析圖；
[0037] 其中，A :為VLPs-SEl免疫小鼠血清對三種HCVpp的感染抑制作用結果分析圖； B-D分別為VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SEl免疫小鼠血清對三種HCVpp的感染抑制作用結 果分析圖；E為四種混合VLPs免疫小鼠血清對HCVpp的感染抑制作用結果分析圖；F為佐劑 對照免疫小鼠血清，對三種HCVpp均無感染抑制作用結果分析圖。
[0038] 圖10為小鼠血清中和抗體抑制HCVcc感染Huh7. 5細胞分析圖；
[0039] 圖11為HCV陽性患者體內中和抗體的ELISA測定圖。

【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0041] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0042] 1.丙型肝炎病毒的保守的中和抗原表位選擇、表達載體的構建和表達分析。
[0043] 2.嵌合病毒樣顆粒的制備、純化和鑒定。
[0044] 3.嵌合VLPs免疫BALB/c小鼠，測定小鼠體內誘導出的HCV中和表位特異性中和 抗體水平。
[0045] 4.免疫小鼠血清中和抗體HCVpp和HCVcc感染Huh7. 5細胞分析。
[0046] 本發(fā)明選擇HCV保守的中和表位和HVR的模擬表位，將表位分別插入HBV S抗原 親水區(qū)（127-128位氨基酸間），嵌合基因克隆如真核表達載體pCI-neo中，轉染哺乳動物細 胞包裝嵌合病毒樣顆粒（VLPs)并進行純化和鑒定。純化的VLPs免疫BALB/c小鼠，測定小 鼠血清中和抗體水平。分析產(chǎn)生的中和抗體抑制HCVpp和HCVcc對Huh7. 5的感染情況。
[0047] 1.丙型肝炎病毒的保守的中和抗原表位選擇和表達載體構建
[0048] I. 1表位選擇包括以下多表位序列，其來源和氨基酸殘基序列分別為：HCV El區(qū) 線性中和表位：ITGHRMAWDMMMNWS ;HCV E2區(qū)線性中和表位：QLINTNGSWHIN ;HCV E2區(qū)線性 中和表位：GVPTYSWGENET ;HCV E2 高變區(qū)（HVR)模擬表位：ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。
[0049] I. 2HBV S基因親水區(qū)引入Age I位點?？寺BV S抗原基因（adw，681bp)，采用重 疊 PCR方法，分別克隆HBV S抗原1-127位氨基酸序列和128-227位氨基酸序列，分別插入 克隆載體口1^11168(31^口1:(-)伍(3〇1?1/^86 1，六86 1/%^1)中，將128位氨基酸4替換為6， 從而引入Age I位點，表位基因可利用該位點插入HBV S基因親水區(qū)，構建嵌合的HCV中和 表位的HBV S基因。將引入Age I位點的全長S基因亞克隆至真核表達載體pCI-neo中， 得到重組真核表達載體pCI-HBS。
[0050] 參見圖1，圖示為利用點突變方法，將HBV S基因第128位氨基酸由G突變?yōu)锳，在 HBV S基因 S片段氨基酸127 (T)和128㈧位之間，引入Age I位點，分別將四個表位基因 基因插入該位點，使不同表位嵌合于HBV S抗原親水區(qū)（aalOl-159)。
[0051] 圖2,為不同HCV中和抗原表位基因嵌合的HBS基因克隆入pCI-neo中，EcoR I/ Xba I雙酶切鑒定，得到預期大小片段，證實嵌合基因克隆入真核表達載體。
[0052] 1. 3插入HCV中和表位的重組HBV S基因構建。
[0053] 國外插入表位基因方法是合成表位基因序列，兩端帶有Age I位點，隨機插入改 造的pCI-HBS載體，選擇測序正確的載體。由于表位基因較短，這樣插入方法較為困難。 我們采用將表位以引物方式合成，作為上游引物擴展HBV S基因下游序列，克隆入組載體 pCI-HBS，這樣較易實現(xiàn)將表位插入目的基因位點中。
[0054] 具體做法是以 pCI-HBS 為模板，分別用 FElAge I/R2Xba I，F(xiàn)E2Age I/R2Xba I， FE3Age I/R2Xba I，F(xiàn)E4Age I/R2Xba I為引物（表位序列見表1)，擴增得到引入不同表位 的HBV S下游128-227位氨基酸的堿基序列，擴增產(chǎn)物回收后連接入T-easy載體，測序正 確后分別命名為 T-HBSEl，T-HBSE2, T-HBSE3, T-HBSE4。
[0055] 表1表位及引物序列設計（粗體為表位序列）
[0056]

【權利要求】
1. 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒，其特征在于，該病毒樣顆粒是將HCV表 位插入HBV S抗原親水區(qū)構建真核表達載體，再經(jīng)哺乳動物細胞體外裝配制得； 其中，所述的HCV表位為氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?4中任意一項所示的表位。
2. 根據(jù)權利要求1所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?3所示的表位為高度保守的中和表位；氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示的表位為高變區(qū)的模擬表位。
3. 根據(jù)權利要求2所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的表位為HCV El區(qū)線性中和表位；氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2所示的表位為HCV E2區(qū)線性中和表位；所述高變區(qū)的模擬表位為 HCV E2模擬表位。
4. 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 在HBV S基因親水區(qū)引入Age I克隆位點 將引入Age I克隆位點的全長S基因亞克隆至真核表達載體pCI-neo中，得到重組真 核表達載體PCI-HBS ; 2) 將HCV表位以引物合成的形式克隆入重組真核表達載體pCI-HBS中 以 pCI-HBS 為模板，分別用 FElAge I/R2Xba I，F(xiàn)E2Age I/R2Xba I，F(xiàn)E3Age I/R2Xba I，F(xiàn)E4Age I/R2Xba I為引物，擴增得到引入不同表位的HBV S下游128-227位氨基酸的 堿基序列，擴增產(chǎn)物回收后連接入T-easy載體，分別得到T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3和 T-HBSE4 ； 3) 構建嵌合HCV中和抗原表位真核載體 將 T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3 和 T-HBSE4 分別用 Age I/Xba I 雙酶切，克隆入 Age 1/ Xba I雙酶切的pCI-HBS中，得到重組的嵌合HCV中和抗原表位的真核表達載體，分別為 pCI-HBSEl，pCI-HBSE2, pCI-HBSE3 和 pCI-HBSE4 ; 4) 病毒樣顆粒的制備 分別將pCI-HBSEl、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3和pCI-HBSE4轉染哺乳動物細胞，轉染48h 后收集培養(yǎng)上清，定量測定HBsAg含量，得到四種不同的嵌合病毒樣顆粒VLPs，分別命名為 VLPs-SEl、VLPs-SE2、VLPs-SE3 和 VLPs-SE4。
5. 根據(jù)權利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒的制備方法，其 特征在于，步驟2)所述的以引物合成的形式克隆HCV表位所用到的引物FI、Rl、F2、R2、FE 1、 FE2、FE3和FE4的核苷酸序列分別如SEQ. ID. NO :5?12所示。
6. 根據(jù)權利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒的制備方法，其 特征在于，步驟4)所述的哺乳動物細胞為HEK293T、Hela或Huh7. 5細胞。
7. 根據(jù)權利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒的制備方法，其 特征在于，步驟4)采用磷酸鈣法或脂質體法轉染哺乳動物細胞。
8. 根據(jù)權利要求4所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒的制備方法，其 特征在于，步驟4)是采用羅氏E601電化學發(fā)光分析儀對HBsAg含量進行定量測定。
9. 權利要求1所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒樣顆粒在制備用于治療HCV 感染病癥的疫苗中的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK104312986SQ201410555736
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權日:2014年10月17日
【發(fā)明者】韋三華, 張海, 雷迎峰, 舒放, 林芳, 王希, 李斌, 張利軍, 張惠中 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學