專利名稱：輪狀病毒Vp4全基因與乳酸菌非抗性表達(dá)載體的重組與表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體涉及豬A組輪狀病毒W(wǎng)a株Vp4全基因的基因序列、Vp4全基因的克隆、與“疫苗級(jí)”的非抗生素抗性的可以在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的質(zhì)粒載體pW425t重組、乳酸桿菌、在大腸桿菌中的表達(dá)。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(Rotavirus，RV)是引起嬰幼兒和各種幼齡動(dòng)物非細(xì)菌性腹瀉的主要病原之一。RV性腹瀉是一種世界性傳染病。自1969年Mebus等首次從犢牛腹瀉中分離出輪狀病毒(RV)以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)該病毒是引起嬰幼兒及幼齡動(dòng)物腹瀉并致死亡的主要病原體。輪狀病毒引起的感染在發(fā)展中國(guó)家每年造成近百萬(wàn)嬰幼兒死亡。A組RV是引起全世界嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的最重要病原，在發(fā)展中國(guó)家，每年發(fā)生中度和嚴(yán)重腹瀉的兒童約18000000人，死于輪狀病毒感染的超過350000～390000人；在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于RV腹瀉導(dǎo)致脫水是兒童住院的一個(gè)常見病因，醫(yī)療費(fèi)用高，據(jù)估計(jì)美國(guó)每年直接的醫(yī)藥損失達(dá)2億6千萬(wàn)美元。2004年11月，廣州輪狀病毒日感染近千人。2005年2月，孟加拉國(guó)共有190000人感染輪狀病毒，其中32人死亡。在動(dòng)物性腹瀉中，仔豬、小綿羊、馬、狗、貓、兔、牛、雞、火雞雛、恒河猴、鼠等幼齡動(dòng)物常感染發(fā)病。自1982年我國(guó)首次分離到水牛輪狀病毒后，已相繼發(fā)現(xiàn)豬、牛、羊、犬、兔和多種禽類的RV感染報(bào)道，并已發(fā)現(xiàn)或分離鑒定了病毒。據(jù)對(duì)華東地區(qū)牛、豬血清中輪狀病毒抗體的調(diào)查，奶牛、黃牛和豬群的抗體陽(yáng)性率分別達(dá)到85.4％、83.0％、68.3％。表明我國(guó)動(dòng)物輪狀病毒感染較普遍，感染率也很高。輪狀病毒主要侵害幼齡畜禽，15~30日齡的仔豬輪狀病毒感染最為普遍；牛的發(fā)病年齡從出生到60日齡不等，但以15~40日齡發(fā)病率最高；兔和雞的易感期是30~70日齡和7~30日齡。成年動(dòng)物對(duì)輪狀病毒也有易感性。仔豬感染PRV后，因腹瀉使機(jī)體免疫力急劇下降，易繼發(fā)多種細(xì)菌性感染，導(dǎo)致仔豬存活率下降，存活者生長(zhǎng)緩慢或停滯。近年來，隨著養(yǎng)豬數(shù)量的增加，本病的流行范圍不斷擴(kuò)大，發(fā)病率不斷增加。其發(fā)病率最高可達(dá)80％，14日齡以內(nèi)新生仔豬的病死率可達(dá)100％，我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，仔豬存活率低給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。一般認(rèn)為RV只引起消化系統(tǒng)損害，但近年來的研究表明RV感染可引起多臟器損害，病毒血癥是RV多系統(tǒng)播散的途徑。動(dòng)物感染RV后對(duì)生產(chǎn)和生長(zhǎng)有較大影響，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。環(huán)境衛(wèi)生和用水衛(wèi)生條件的改善，不能減少輪狀病毒的發(fā)病頻率。由于目前尚無(wú)治療輪狀病毒的特效藥物，因此預(yù)防顯得尤為重要。為此，世界衛(wèi)生組織多次呼吁各國(guó)科學(xué)家研制開發(fā)有效的輪狀病毒疫苗，并將其列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項(xiàng)目之一。指出疫苗預(yù)防才是遏制輪狀病毒腹瀉唯一有效的手段。因此認(rèn)為控制輪狀病毒疾病的發(fā)生，必須從疫苗的研制著手?？v向研究表明，不論發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，嬰幼兒輪狀病毒的重復(fù)感染都十分常見，尤其在出生后的最初幾年內(nèi)。與初次感染相比，再次感染癥狀一般較溫和，或者為無(wú)癥狀感染，這一研究結(jié)果肯定了用疫苗免疫嬰兒可以預(yù)防重癥輪狀病毒疾病。據(jù)估計(jì)，如果使用有效的疫苗，每年在全世界可以挽救500000~1000000個(gè)兒童的生命。疫苗預(yù)防是控制此病的最佳選擇。雖然當(dāng)前的弱毒疫苗在預(yù)防該病的發(fā)生上起到了重要的作用，它仍存在弱毒疫苗的相對(duì)不穩(wěn)定，易返祖，潛在感染等缺陷。隨著分子生物學(xué)的深入研究，新型基因工程疫苗的問世為豬輪狀病毒的診斷和預(yù)防提供了一條的途徑。
由于輪狀病毒目前尚無(wú)有效治療手段，所以研制輪狀病毒的基因工程疫苗是目前的熱點(diǎn)。VP4是輪狀病毒的一種非糖基化的胰酶敏感蛋白，由基因組第4基因編碼，約占病毒蛋白量的1.5％。大部分RV的Vp4基因全長(zhǎng)為2331bp，編碼776個(gè)氨基酸。以二聚體形式存在的VP4位于病毒顆粒表面，并形成60個(gè)長(zhǎng)度超過10nm的輪輻狀突觸。研究表明，VP4有許多功能，包括病毒血凝素活性、附著和穿入細(xì)胞，與病毒的毒力有關(guān)，在組織培養(yǎng)中與限制增殖有關(guān)，并對(duì)胰蛋白酶敏感。VP4在胰酶作用下可裂解為帶氨基末端的VP8(28kD、aa1-240)與帶羧基末端的VP5(60kD、aa248-775)兩種亞單位蛋白，從而增強(qiáng)了病毒的感染力，然后病毒才能穿入宿主細(xì)胞。VP4是病毒的主要交叉中和抗原，其中和抗原位點(diǎn)位于保守的VP4抗原表位區(qū)，Estes和Cohen、Larralde等均認(rèn)為VP8片段中包含VP4主要抗原位點(diǎn)，且VP8片段在相同VP4血清型間表現(xiàn)為高度保守，而VP5片段抗血清型在RV不同的基因型之間具有交叉反應(yīng)。由于Vp4全基因較長(zhǎng)，所以對(duì)其全長(zhǎng)進(jìn)行表達(dá)還未見報(bào)道。目前報(bào)道的多數(shù)是Vp4基因的一部分即Vp8或Vp5基因的表達(dá)。所以將Vp4全基因表達(dá)出來作抗原，已經(jīng)成為輪狀病毒基因工程疫苗研究的主要方向。
就目前在基因工程中需要解決的問題是如何純化表達(dá)的蛋白，因?yàn)榛蚬こ讨兴玫谋磉_(dá)重組保護(hù)性抗原的受體菌株主要是活的減毒病原菌，而細(xì)菌疫苗的免疫保護(hù)力往往和菌株的殘余毒力成正比。所以試圖尋找能良好地表達(dá)外源性抗原且安全的受體菌株日益受到人們的關(guān)注。乳酸桿菌為人及動(dòng)物體內(nèi)正常菌群的重要成員，以乳酸桿菌作為表達(dá)外源保護(hù)性抗原基因的受體菌株，就可以將乳酸菌的生物學(xué)功能和外源功能抗原基因的特異性免疫相結(jié)合，Christiaens(1992)等研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以作為基因工程菌表達(dá)的外源基因，與大腸桿菌，相比較乳酸桿菌僅有一層細(xì)胞膜，目的蛋白可在信號(hào)肽的引導(dǎo)下直接分泌進(jìn)入上清，從而容易獲得目的蛋白。Allson(1996)等研究指出，乳酸桿菌是保護(hù)性抗原基因或免疫調(diào)節(jié)因子的良好的轉(zhuǎn)化或表達(dá)系統(tǒng)，以乳酸桿菌為載體表達(dá)內(nèi)源或外源蛋白，在功能食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域具有誘人的前景。這類疫苗的研制成功將為新型疫苗的發(fā)展探索一條新路。
但目前報(bào)道的人和動(dòng)物消化道共生乳酸桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)，多是以抗生素抗性作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的壓力。然而由于抗藥性基因不斷向環(huán)境中漂移擴(kuò)散，可能造成對(duì)環(huán)境微生態(tài)的破壞，帶來嚴(yán)重后果，因而這類表達(dá)系統(tǒng)離“可食性”的要求還有很大的距離，不能直接用于人和動(dòng)物。所以構(gòu)建以營(yíng)養(yǎng)因子代替抗生素基因作為載體表達(dá)的選擇壓力具有非常重要的意義。非抗生素抗性為選擇壓力的表達(dá)系統(tǒng)是以細(xì)菌的管家基因缺陷菌株為受體菌，在質(zhì)粒上克隆入同源或異源完整的受體菌缺陷基因，作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的壓力。自Nakayama(1988)用Asd基因?yàn)檫x擇壓力構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌非抗性表達(dá)系統(tǒng)以來，此類表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展很快。目前比較成熟的系統(tǒng)包括胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthase，thyA)、Asd基因、β-半乳糖苷酶基因、SSB基因、D-木糖異構(gòu)酶基因、琥珀突變體、赭石突變體、乳鏈菌肽及其它的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子基因等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是本發(fā)明提供了一種輪狀病毒Vp4全基因與乳酸菌非抗性表達(dá)載體的重組與表達(dá)，即豬A組輪狀病毒W(wǎng)a株Vp4全基因的基因序列、與“疫苗級(jí)”的非抗生素抗性的可以在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的質(zhì)粒載體pW425t重組、乳酸桿菌、在大腸桿菌中的表達(dá)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-T-Vp4和以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的載體pW425t均以SalI、KpnI雙酶切，切膠純化后，以T4 DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中，在普通的LB固體培養(yǎng)基(沒有添加胸腺嘧啶)上培養(yǎng)，經(jīng)生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)，篩選獲得原核重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t-Vp4。
從培養(yǎng)的RV中用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增Vp4全基因，通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至克隆載體pGEM-T載體中，獲得重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-Vp4；應(yīng)用DNASTAR和DNAMAN軟件進(jìn)行分析。該輪狀病毒W(wǎng)a株Vp4全基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列是1 atg gct tcg ctc att tat aga caa cta ctt act aat tca tac aca gtc1 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val49 aat ctt tct gac gaa att caa gag att gga tca gct aag tca cag gat17 Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp97 gtt act ata aat cct ggt cca ttc gca cga aca ggt tat gca cca gtt33 Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Arg Thr Gly Tyr Ala Pro Val145aat tgg gga gca ggt gag act aat gac tcc aca act gtc gag ccg tta49 Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu193tta gat ggt cca tac caa cca acc act ttc aat cca cca aca agc tat65 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr241tgg gta cta ctt gcg cca act gta gag ggc gta att att caa gga aca81 Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr289aac aat acc gat aga tgg ttg gcc act ata cta att gaa cca aac gta97 Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val337caa aca act aac aga ata tac aat ctt ttt ggt cag caa gta act tta113Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu385tcg gtg gag aat acg tca cag aca caa tgg aag ttc att gat gtg agt129Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser433aca act acg cca aca gga agt tat acg cag cac gga cca ttg ttc tct145Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser481aca cca aaa tta tac gct gta atg aaa ttc agt ggt aga ata tat aca161Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr529tat aat gga gcc aca cca aac gca aca aca gga tac tat tca act act177Tyr Asn Gly Thr rhr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr577aat tat gac aca gta aat atg aca tca ttt tgt gat ttt tat att ata193Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile625cca aga aat caa gaa gaa aaa tgt act gag tat atc aat cat gga tta209Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu673cct cct ata caa aat aca agg aat gtt gtg cca gta tct tta tcg gct225Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Val Ser Leu Ser Ala721aga gag ata gtg cac aca aga gct caa gtt aat gag gat att gtt gtt241Arg Glu Ile Val His rhr Arg Ala gln Val Asn glu Asp Ile Val Val769tca aaa act tca ctt tgg aaa gaa atg caa tgc aac aga gac ata acc257Ser Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Cys Asn Arg Asp Ile Thr817ata aga ttc aaa ttt gat aga aca att att aaa gct gga gga tta gga273Ile Arg Phe Lys Phe Asp Arg rhr Ile Ile Lys Ala Gly Gly Leu Gly865tac aaa tgg tca gaa ata tct ttt aag cca att act tat cag tac aca289Tyr Lys Trp Ser Glu Ile Ser Phe Lys Pro Ile Thr Tyr Gln Tyr Thr913tac gct aga gat gga gaa caa att aca gcg cac acc aca tgc tca gtt305Tyr Ala Arg Asp Gly Glu Gln Ile Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val961aat gga gtt aac aat ttt agt tac aat ggc ggt tcg ctg ccg acg gac
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就目前報(bào)道的人和動(dòng)物消化道共生乳酸桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)，多是以抗生素抗性作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的壓力。然而由于抗藥性基因不斷向環(huán)境中漂移擴(kuò)散，可能造成對(duì)環(huán)境微生態(tài)的破壞，帶來嚴(yán)重后果，因而這類表達(dá)系統(tǒng)離“可食性”的要求還有很大的距離，不能直接用于人和動(dòng)物。所以構(gòu)建以營(yíng)養(yǎng)因子代替抗生素基因作為載體表達(dá)的選擇壓力具有非常重要的意義。非抗生素抗性為選擇壓力的表達(dá)系統(tǒng)是以細(xì)菌的管家基因缺陷菌株為受體菌，在質(zhì)粒上克隆入同源或異源完整的受體菌缺陷基因，作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的壓力。自Nakayama(1988)用Asd基因?yàn)檫x擇壓力構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌非抗性表達(dá)系統(tǒng)以來，此類表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展很快。目前比較成熟的系統(tǒng)包括胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthase，thyA)、Asd基因、β-半乳糖苷酶基因、SSB基因、D-木糖異構(gòu)酶基因、琥珀突變體、赭石突變體、乳鏈菌肽及其它的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子基因等。
將重組質(zhì)粒pGEM-T-Vp4和以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的載體pW425t均以SalI、KpnI雙酶切，純化回收后，以T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中，在普通的LB固體培養(yǎng)基(沒有添加胸腺嘧啶)上培養(yǎng)，經(jīng)生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)，篩選獲得原核重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t-Vp4。將陽(yáng)性菌用蘇氨酸誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質(zhì)粒獲得高效表達(dá)，融合蛋白的相對(duì)分子量約為87.67kD。Western blot分析顯示該表達(dá)產(chǎn)物與豬輪狀病毒多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，而載體蛋白不與抗體發(fā)生反應(yīng)，表明該融合蛋白具有良好的抗原性。
本發(fā)明的有益效果是將豬A組輪狀病毒Vp4全基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，與“疫苗級(jí)”以thyA基因?yàn)檫x擇標(biāo)記的可在乳酸菌和大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的載體pW425t進(jìn)行重組，并轉(zhuǎn)化入thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中，經(jīng)過生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)篩選陽(yáng)性克隆pW425t-Vp4，通過SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)，表明外源基因Vp4可以通過表達(dá)載體pW425t在大腸桿菌中表達(dá)并具有反應(yīng)原性，為下一步pW425t-Vp4在thyA基因缺陷型的乳酸菌受體菌株中表達(dá)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。


是本發(fā)明pW425t-Vp4質(zhì)粒構(gòu)建圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例11目的基因PCR擴(kuò)增與克隆根據(jù)GenBank中(X13190)豬輪狀病毒W(wǎng)a株Vp4的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增該基因的PCR引物(由大連TaKaRa公司合成)P15’-GTAGTCGACATGGCTTCGCTCATTTATAGA-3’；P25’-CCTGGTACCTTACAGTCTACATTGCATGATTA-3’(劃線序列分別為SaLI、KpnI酶切位點(diǎn))。按Trizol試劑盒方法提取豬輪狀病毒總RNA；以總RNA為模板，以P1、P2為引物，對(duì)Vp4基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。50μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下取10μlmRNA，75 C加熱5min，使雙鏈RNA變性，迅速置于冰上冷卻后，再加入5×AMV Buffer 10.0μl；dNTPs 4.0μl(2.5mM each)；RNasin 1μl；下游引物0.5μl；AMV(5Units/μl)0.5μl；Olig(dt)1.0μl；MgCl2(25mM)4.0μl；加DEPC水19.0μl。42C反轉(zhuǎn)錄1h，95C煮沸5min滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶。50μlPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下取經(jīng)DEPC處理的0.5ml EP管，在50μl反應(yīng)體系中加入10×PCR Buffer 5.0μl；dNTP(2.5mM)8.0μl；上游引物1μl；下游引物1μl；cDNA 5μl；RNasin 1μl；MgCl22.0μl；EX-Taq 0.5μl；DEPC水26.5μl。反應(yīng)條件為94C預(yù)變性8min；94C變性1.5min，45C退火1min，72C延伸3.5mins，共35 cycles；72C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，以T4 DNA連接酶連接于pGEM-T Vector中，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli JM109中。質(zhì)粒提取、酶切分析及PCR擴(kuò)增鑒定重組克隆，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T-Vp4，送至大連TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用DNASTAR軟件進(jìn)行分析。
2乳酸菌與大腸桿菌原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與目的基因的表達(dá)對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-T-Vp4和以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的載體pW425t均以SalI、KpnI雙酶切，純化回收后，以T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中，在普通的LB固體培養(yǎng)基(沒有添加胸腺嘧啶)上培養(yǎng)，經(jīng)生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)，篩選獲得原核重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t-Vp4。
將原核重組表達(dá)菌接種于5ml普通的LB液體(沒有添加胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基中，37℃200r/min培養(yǎng)過夜。取2ml接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃250r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，在培養(yǎng)基中添加40mM DL-蘇氨酸，。每隔1h取一次菌液，取至11h。以同樣的方法誘導(dǎo)含空質(zhì)粒pW425t的E.coli X13 11h作對(duì)照。
3 SDS-PAGE分析將各個(gè)時(shí)間誘導(dǎo)收獲的菌液OD600均調(diào)至0.7，取菌液1.2ml，4℃離心收集菌體。沉淀菌體中加入100μl去離子水裂解細(xì)菌，再加入等量的2×SDS凝膠上樣緩沖液，混勻后，于沸水中煮沸5min，15000r/min離心10min，取上清15μl按《分子克隆》中方法進(jìn)行15％SDS-PAGE。
4.Western blot分析表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，按《分子克隆》中方法以BIO-RAD系統(tǒng)電轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)移膜上，經(jīng)牛血清白蛋白封閉后，依次加入兔抗豬輪狀病毒多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，最后在聯(lián)苯胺(DAB)溶液中顯色并觀察結(jié)果。
5.結(jié)果5.1輪狀病毒的RNA提取該實(shí)驗(yàn)株符合A組RV核酸電泳時(shí)11個(gè)節(jié)段按分子量大小呈4-2-3-2分布模式。它們其中6個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP4、VP6、VP7，5個(gè)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1(NS53)、NSP2(NS35)、NSP3(NS34)、NSP4(NS28)和NSP5(NS26)，其中4種蛋白VP6、VP4、VP7及NSP4有重要作用。
5.2 RT-PCR擴(kuò)增用提取的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，經(jīng)PCR擴(kuò)增在1％瓊脂糖凝膠中檢查，以DL2000為Marker，結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的條帶。
5.3重組質(zhì)粒的鑒定5.3.1重組質(zhì)粒的提取鑒定挑取其中12個(gè)白色菌落和1個(gè)藍(lán)色菌落，接種普通AMP+LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行質(zhì)粒的小抽提。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示1、2、5、6、7和9菌落的質(zhì)粒可能含有目的片段，但還需進(jìn)一步鑒定。
5.3.2酶切鑒定挑選其中的1、2、5、6質(zhì)粒進(jìn)行SalI和KpnI酶切鑒定。結(jié)果顯示，菌株1、2中的重組質(zhì)粒中含有外源基因Vp4，為陽(yáng)性克隆；菌株5、6中無(wú)外源Vp4基因，為陰性克隆。
5.3.3 PCR鑒定以1、5號(hào)菌的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果1號(hào)菌株擴(kuò)出與預(yù)期大小相符的目的條帶，5號(hào)為陰性對(duì)照，無(wú)特異條帶擴(kuò)出。
5.4乳酸菌與大腸桿菌原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組子的鑒定pGEM-T-Vp4和pW425t均以SalI、KpnI雙酶切和純化后，由T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中，thyA基因缺陷的E.coli X13在普通的LB培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不良，必須在加有外源的胸腺嘧啶核苷(50ug/ml)的條件下才能恢復(fù)生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中含thyA基因重組質(zhì)粒pW425t-Vp4的轉(zhuǎn)入能使thyA基因缺陷的E.coli X13在普通的LB平板上恢復(fù)生長(zhǎng)。
將經(jīng)過生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)獲得的菌落進(jìn)行普通LB液體(未添加外源的胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基中培養(yǎng)、對(duì)篩選的7個(gè)菌落進(jìn)行提取質(zhì)粒，菌株1、2、4、5、6、7可能含有預(yù)期的質(zhì)粒，但尚需進(jìn)一步鑒定。
5.5重組質(zhì)粒pW425t-Vp4的酶切鑒定將重組質(zhì)粒1、2、3用SalI和KpnI酶切，其中重組質(zhì)粒1、2菌株酶切后得到了約3700bp的pW425t線性片段和2331bp的插入片段，表明已構(gòu)建出含豬輪狀病毒Vp4基因的乳酸菌與大腸桿菌原核表達(dá)重組質(zhì)粒pW425t-Vp4，。
5.6 SDS-PAGE分析分析上述經(jīng)過鑒定為陽(yáng)性的克隆菌株1在各時(shí)間的表達(dá)情況。由圖3可見，Vp4本身全基因長(zhǎng)2331bp，經(jīng)過測(cè)序分析表明，Vp4基因與表達(dá)載體pW425t的開放閱讀框架正確融合，表達(dá)的融合蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量約為87.67kD，與對(duì)照相比，其表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。而含空質(zhì)粒pW425t的E.coli X13對(duì)照則未見該蛋白質(zhì)表達(dá)。
5.7 Western blot分析表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)移膜上，以兔抗豬輪狀病毒多克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，聯(lián)苯胺(DAB)為底物，進(jìn)行蛋白印跡分析，其結(jié)果在87.67kD處可見有一條明顯的蛋白印跡帶，說明該表達(dá)產(chǎn)物與豬輪狀病毒多克隆抗體具有反應(yīng)原性。
權(quán)利要求
l、一種輪狀病毒Vp4全基因與乳酸菌非抗性表達(dá)載體的重組與表達(dá)，其特征是輪狀病毒Vp4全基因與乳酸菌非抗性表達(dá)載體的重組是從培養(yǎng)的RV中用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增Vp4全基因，開放閱讀框含2331bp，編碼776個(gè)氨基酸，通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至克隆載體pGEM-T載體中，獲得重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-Vp4；對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-T-Vp4和以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的非抗生素抗性的可以在乳酸菌和大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的質(zhì)粒載體pW425t均以SalI、KpnI雙酶切，切膠純化后，以T4 DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中，在普通的LB固體培養(yǎng)基(沒有添加胸腺嘧啶)上培養(yǎng)，經(jīng)生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)，篩選獲得原核重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t-Vp4；輪狀病毒Vp4全基因與乳酸菌非抗性表達(dá)載體的表達(dá)是將陽(yáng)性菌用蘇氨酸誘導(dǎo)表達(dá)，pW425t-Vp4經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質(zhì)粒獲得高效表達(dá)，融合蛋白的相對(duì)分子量約為87.67kD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輪狀病毒Vp4全基因與乳酸菌非抗性表達(dá)載體的重組與表達(dá)，其特征是從培養(yǎng)的RV中用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增Vp4全基因，開放閱讀框含2331bp，編碼776個(gè)氨基酸，通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至克隆載體pGEM-T載體中，獲得重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-Vp4；應(yīng)用DNASTAR和DNAMAN軟件進(jìn)行分析；該輪狀病毒W(wǎng)a株Vp4全基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列是1 atg gct tcg ctc att tat aga caa cta ctt act aat tca tac aca gtc1 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val49aat ctt tct gac gaa att caa gag att gga tca gct aag tca cag gat17Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp97gtt act ata aat cct ggt cca ttc gca cga aca ggt tat gca cca gtt33Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Arg Thr Gly Tyr Ala Pro Val145 aat tgg gga gca ggt gag act aat gac tcc aca act gtc gag ccg tta49Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu193 tta gat ggt cca tac caa cca acc act ttc aat cca cca aca agc tat65Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr241 tgg gta cta ctt gcg cca act gta gag 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全文摘要
一種輪狀病毒Vp4全基因與乳酸菌非抗性表達(dá)載體的重組與表達(dá)，屬于生物基因領(lǐng)域，其特征是對(duì)重組質(zhì)粒pGEM－T－Vp4和以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的載體pW425t均以SalI、KpnI雙酶切，切膠純化后，以T4 DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中，在普通的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)，篩選獲得原核重組表達(dá)質(zhì)粒pW425t－Vp4；其有益效果是將豬A組輪狀病毒Vp4全基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，與“疫苗級(jí)”以thyA基因?yàn)檫x擇標(biāo)記的可在乳酸菌和大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的載體pW425t進(jìn)行重組，通過檢測(cè)，表明外源基因Vp4可以通過表達(dá)載體pW425t在大腸桿菌中表達(dá)并具有反應(yīng)原性，為下一步在thyA基因缺陷型的乳酸菌受體菌株中表達(dá)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
文檔編號(hào)C07K14/14GK1952157SQ200510017200
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者王春鳳, 王會(huì)巖, 李玉 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 王春鳳, 王會(huì)巖, 李玉