黃瓜CsMADS1基因過表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)黃瓜E族基因CsMADS1過表達(dá)載體及其在花器官改造中的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該載體為含有35S啟動(dòng)子和黃瓜E族基因CsMADS1植物表達(dá)載體。在擬南芥中過量表達(dá)CsMADS1，獲得的CsMADS1轉(zhuǎn)基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長(zhǎng)出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝。利用本發(fā)明的載體可以調(diào)控作物的開花時(shí)間，培育特定的轉(zhuǎn)基因植株，具有一定的農(nóng)業(yè)價(jià)值和觀賞價(jià)值。
【專利說(shuō)明】黃瓜CsMADSI基因過表達(dá)載體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種黃瓜E類基因CsMADSI過表達(dá)載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]開花是高等植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的一個(gè)非常重要的發(fā)育過程，在合適的時(shí)間開花對(duì)大多數(shù)植物的生存和成功繁衍極為重要。開花時(shí)間的調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受自身遺傳因子和外界環(huán)境因素兩方面的共同影響。迄今，已經(jīng)探明包括光周期、春化、溫度、赤霉素、自主以及年齡等6條遺傳途徑參與調(diào)控開花時(shí)間。
[0003]MADS-box基因是真核生物中一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用,在動(dòng)物、植物、真菌中都存在。在植物中，MADS-box基因的分布幾乎遍布整個(gè)植物界，除在雙子葉植物擬南芥、金魚草、葡萄、矮牽牛和楊樹等植物中廣泛存在外，在單子葉的水稻、玉米、小麥、高粱等中也大量分布。MADS-box基因一般以基因家族的形式存在，在植物生長(zhǎng)發(fā)育不同階段如苗期、花期、在植物的不同部位，如營(yíng)養(yǎng)器官根、莖、葉和生殖器官花、果實(shí)、種子中MADS-box基因都有不同程度的表達(dá)，并在其中起重要的調(diào)控作用。
[0004]MADS-box基因作為一類非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在開花植物中，這些蛋白在廣闊的范圍內(nèi)具有重要的生物學(xué)意義。目前的研究表明，MADS-box除在花的發(fā)育上的重要作用外，其在調(diào)控開花早晚方面也具有一定的作用，目前這方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)主要是對(duì)模式植物擬南芥和金魚草的研究。目前分離出的促進(jìn)開花的MADS-box基因包括AGL20、AGL24、C0和SOCl，抑制開花的FLC、FLM、FR1、SVP等。
[0005]Borner等通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),agl20的突變體會(huì)推遲開花,也發(fā)現(xiàn)AGL20受GA調(diào)控，而且與誘導(dǎo)開花的不同途徑之間相互聯(lián)系著，并發(fā)現(xiàn)在不依賴光周期長(zhǎng)短的條件下AGL20是開花的必需條件。kim等也從十字花科植物中分離出AGL20基因，當(dāng)其過量表達(dá)會(huì)使得植物開花提早很長(zhǎng)一段時(shí)間，而該反義基因轉(zhuǎn)化植物后出現(xiàn)開花嚴(yán)重推遲的現(xiàn)象。Yu等發(fā)現(xiàn)AGL24可以調(diào)控兩個(gè)與開花時(shí)間相關(guān)的基因SOCl和FT及花序分裂基因LFY，通過RNAi技術(shù)，使得AGL24的量減少或者消失，出現(xiàn)了開花推遲的現(xiàn)象，而AGL24的過量表達(dá)又會(huì)使得開花提前。Onouchi等研究了 CO對(duì)植物開花時(shí)間的影響，把CO與35S啟動(dòng)子相連后轉(zhuǎn)到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在長(zhǎng)日照還是在短日照下，轉(zhuǎn)基因植物的開花都會(huì)提前。Moon等發(fā)現(xiàn)在短日照下，gal-3突變體植物不開花，但如果采取一定的措施使得SOCl的表達(dá)水平上升，植物會(huì)開花。FLC是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的開花抑制子，在擬南芥中會(huì)抑制開花，且其抑制的程度與其劑量成正比。FLM的氨基酸序列與FLC的序列的同源性很高，也是一類開花抑制子。Scortecci等在擬南芥中通過使用反向遺傳學(xué)的方法鑒定出了由于兩個(gè)FLM的T-DNA插入突變體,含有這兩類插入位點(diǎn)的植株都會(huì)表現(xiàn)早花。Clarke等在擬南芥中通過用QTL的方法發(fā)現(xiàn)FRI是開花推遲的主要抑制基因。Michaels等發(fā)現(xiàn)在野生型的晚花植物中，F(xiàn)RI會(huì)提高FLC的水平，而自主開花途徑和春化作用會(huì)使FLC的水平下降。Hartmann等通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的方法克隆到SVP基因，分析它的轉(zhuǎn)錄活性后發(fā)現(xiàn)其有不同的轉(zhuǎn)錄物，僅局限于營(yíng)養(yǎng)器官和花原基中，沒有在成熟的花中發(fā)現(xiàn)。SVP突變體植株會(huì)出現(xiàn)早花是由于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期被縮短而造成的，而且純合的突變體比雜和的突變體植株開花更早，這說(shuō)明SVP不但與開花的早晚相關(guān)，而且與其存在著劑量關(guān)系，認(rèn)為SVP的功能就是使植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期變長(zhǎng)，而使得植物的生殖生長(zhǎng)時(shí)期推遲。
[0006]黃瓜屬葫蘆科植物，廣泛分布于中國(guó)各地，為主要的溫室產(chǎn)品之一。我國(guó)瓜類作物的栽培面積在4，000萬(wàn)畝以上，僅黃瓜的產(chǎn)量就占世界的一半。對(duì)黃瓜開花相關(guān)基因的研究具有一定的理論和實(shí)踐意義。最近黃瓜全基因組測(cè)序的完成標(biāo)志著黃瓜功能基因組的研究進(jìn)入了一個(gè)全新的階段。盡管目前與黃瓜重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因正在逐漸被克隆，但與黃瓜開花相關(guān)基因的研究還鮮有報(bào)道。
[0007]進(jìn)化樹的分析發(fā)現(xiàn)，CsMADSI與E功能基因具有較高的同源性，可能歸屬于E功能基因，但其功能并不清楚，值得進(jìn)一步的研究。我們克隆出CsMADSI基因并將其連到含35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體PCAMBIA1301上，轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)，獲得的CsMADSI轉(zhuǎn)基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長(zhǎng)出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝。利用本發(fā)明的載體可以調(diào)控作物的開花時(shí)間，培育特定的轉(zhuǎn)基因植株，具有一定的農(nóng)業(yè)價(jià)值和觀賞價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜CsMADSI基因花特異表達(dá)載體及及其在花器官改造中的應(yīng)用，該載體含有黃瓜E族基因CsMADSI，基因的上游連有35S啟動(dòng)子。
[0009]本發(fā)明的上述植物表達(dá)載體為pCAMBIAl301-CsMADSI，由下述方法構(gòu)建而成:
(O根據(jù) CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黃瓜 CsMADSl 序列(Csa004117)，設(shè)計(jì)兩端引物:CsMADSl_F:5’-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’(含 NcoI(含
BglII 位點(diǎn))。
[0010]以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CsMADSl全長(zhǎng)。
[0011](2)回收CsMADSl的cDNA全長(zhǎng)，將其連接到pMD18載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD18-CsMADSl。
[0012](3)使用 NcoI 和 BglII 酶切 pMD18_CsMADSl，回收 CsMADSl 片段，同時(shí)用NcoI和BglII酶切pCAMBIA1301，回收后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得植物表達(dá)載體pCAMBIAl301-CsMADSI。
[0013]本發(fā)明的另一目的是公開黃瓜CsMADSl在調(diào)控開花時(shí)間中的應(yīng)用，該基因?qū)霐M南芥后，獲得的CsMADSl轉(zhuǎn)基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長(zhǎng)出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝。利用本發(fā)明的載體可以調(diào)控作物的開花時(shí)間，培育特定的轉(zhuǎn)基因植株，具有一定的農(nóng)業(yè)價(jià)值和觀賞價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明中CsMADSl全長(zhǎng)擴(kuò)增后的電泳示意圖；
圖2為本發(fā)明表達(dá)載體pCAMBIAl301-CsMADSI的NcoI和BglII雙酶切電泳檢測(cè)圖； 圖3為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定圖；
圖4為過量表達(dá)CsMADSl的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表達(dá)分析圖，其中WT為野生型，1-3為轉(zhuǎn)基因植株；
圖5為過量表達(dá)CsMADSl的轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析。其中(A)為野生型，(B)和(C)為轉(zhuǎn)基因植株。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0016]實(shí)施例中所涉及的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑購(gòu)自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus購(gòu)于Τ0Υ0Β0公司，DNase I購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0017]實(shí)施例1:表達(dá)載體pCAMBIAl301-CsMADSI的構(gòu)建
(O 弓丨物設(shè)計(jì):根據(jù) CuGI (http://cucumber, genomics, org.cn/page/cucumber/index, jsp)上公布的黃瓜CsMADSl序列(Csa004117),設(shè)計(jì)兩端引物:
CsMADS1-F:5，-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’(含 NcoI 位點(diǎn))
CsMADS1-R:5，-aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’(含 BglII 位點(diǎn))。
[0018](2)黃瓜花蕾總RNA的提取
所用黃瓜品種為華北型黃瓜。取長(zhǎng)度約0.7 mm的花蕾I mg，取材后立刻凍到液氨中，米用 TRIzol (Invitrogen,USA)試劑法提取總 RNA:加 1.5 ml Trizol 后，室溫放置 5 min,使其充分裂解。12，OOOrpm離心5 min，棄沉淀。加200 ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。4°C 12, OOOg離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置30 min。4°C 12, OOOg離心10 min，棄上清。用I ml 75%乙醇洗滌2次沉淀。4°C 8, OOOg 離心 5 min,棄上清。室溫晾干 10 min。用 50 uL H2O (Rnase free)溶解 RNA。
[0019](3)黃瓜花蕾總cDNA第一鏈的合成
黃瓜花蕾RNA用DNase I處理后用于以O(shè)ligo (dT) 18為引物的反轉(zhuǎn)錄:取RNA 15 uL，加Oligo (dT)18 luL，混勻，70°C保溫5min，立即冰水浴，稍離心，依次加入10XM-MLV Buffer 2uL、dNTP (1mM) I uL、RNasin (40U/uL) I uL、M-MLV (200U/uL) luL，總體積 20 uL，混勻，42°C保溫 60min，95°C 1min 滅活 M-MLV 酶活性，_20°C保存。
[0020](4) CsMADSl 基因的擴(kuò)增
設(shè)計(jì)特異性引物:CsMADSl-F:5’-aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG -3’(含 NcoI 位點(diǎn))CsMADS1-R:5’-aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’(含 BglII 位點(diǎn))，以第一鏈產(chǎn)物為模板，用長(zhǎng)片段、高保真酶KOD-PIus進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94°C 5 min ；94°C30 s ；56°C 30 s ；68°C 3.0 min，40 個(gè)循環(huán)；68°C 5 min。PCR 產(chǎn)物用 1.5% 瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小約741bp，與預(yù)期大小一致(圖1)。
[0021](5) CsMADSl片段的膠回收
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)目的片段進(jìn)行回收。
[0022](6) CsMADSl 片段加尾
取1.5 ml滅菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR產(chǎn)物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶緩沖液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C處理 45 min ;先加 0.18 mL無(wú)菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸鈉，混勻，最后加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20°C沉淀60 min,12，OOOrpm, 4°C離心lOmin。棄上清，75%乙醇洗滌沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L無(wú)菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0023](7) CsMADSl片段的T/A克隆和測(cè)序
將回收片段連接到PMD18載體上，其具體步驟為:向1.5 ml離心管中分別加入:CsMADSl 片段的 cDNA 5 μ 1、pMD18 載體 0.5 μ 1、1XT4 DNA 連接酶緩沖液 I μ 1，Τ4 DNA連接酶1μ 1，加無(wú)菌水至10μ 1，用封口膜封好；置于16°C連接4-6h。將100μ I感受態(tài)腸桿菌Ε.coli DH5a加入連接體系中混勻；混合液冰浴30 min，42°C熱刺激90 s后，冰浴5min;加入800μ1 LB液體培養(yǎng)基，37 °C、200 rpm搖床培養(yǎng)45min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常溫3，000 rpm離心2 min收集菌體；在超凈臺(tái)上吸去上清,剩余約0.1 ml時(shí),使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無(wú)菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取菌落接種到帶有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，收集菌體，采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。通過酶切檢測(cè)獲得的重組質(zhì)粒pMD18-CsMADSl，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質(zhì)粒 DNA (50ng/y I) 2 μ l.NcoI 0.5 u 1.BglII 0.5 u 1.10 X buffer (Κ)2μ I,使用無(wú)菌水補(bǔ)足20 μ I ;37°C反應(yīng)4h ;然后將酶切正確的重組質(zhì)粒pMD18-CsMADSl進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證插入基因的正確性。
[0024](8)表達(dá)載體 pCAMBIAl301-CsMADSI 的構(gòu)建
使用NcoI和BglII對(duì)質(zhì)粒pMD18-CsMADSl和pCAMBIA1301載體進(jìn)行雙酶切，分別獲得5’端帶有NcoI和3’端帶有MII的CsMADSl片段和pCAMBIA1301載體，電泳后分別進(jìn)行膠回收，16°C連接4-6h;將100μl感受態(tài)腸桿菌E.COli DH5 a加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30min，42°C熱刺激90s后，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液體培養(yǎng)基，37°C >200rpm搖床培養(yǎng)45min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常溫3，000 rpm離心I min收集菌體；在超凈臺(tái)上吸去上清，剩余約0.1 ml時(shí),使用移液槍混勻,接入帶有Kan抗性的LB固體平板上，用無(wú)菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取菌落接種于LB液體+Kan的培養(yǎng)基，37°C、180rpm培養(yǎng)12h后，提取質(zhì)粒。通過酶切檢測(cè)獲得的重組質(zhì)粒pCAMBIA1301_CsMADSl，具體方法為:向0.5 ml的離心管中分別加入:質(zhì)粒DNA(50ng/μ 1)2 μ l、NcoI 0.5 μ l、Bgl II0.5 μ IUOXbuffer (K) 2 μ 1，使用無(wú)菌水補(bǔ)足20 μ I ;37°C反應(yīng)4h ;經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pCAMBIAl301-CsMADSI可酶切出預(yù)期大小(741bp)的片段(圖2)。將酶切正確的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序進(jìn)行序列驗(yàn)證(其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示)，最后獲得表達(dá)載體pCAMBIA1301-CsMADSl。
[0025]實(shí)施例2:pCAMBIA1301-CsMADSl轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌 GV3101 (I)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備挑取農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種于5ml YEB培養(yǎng)基中，28°C搖培過夜，按1:100的比例接種于50 ml YEB培養(yǎng)基中擴(kuò)培，28°C繼續(xù)培養(yǎng)約6_7h至0D600=0.4-0.6。將菌液置于冰上30min ；5, 000 rpm, 4°C離心 5min,棄上清，將菌體懸于 10 ml 0.15 M NaCl 中；5，000 rpm,4°C離心5min，棄上清，菌體用I ml 20 mM CaCl2,4°C )輕輕懸浮，每管200μ1分裝，或加入終濃度為20%的無(wú)菌甘油，-70°C保存。
[0026](2)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定
將10 μ I質(zhì)粒DNA加入200 μ I農(nóng)桿菌感受態(tài)中，混勻，冰浴30min，液氮冷凍3_5min，37°C水浴5min,加入I mlYEB培養(yǎng)基，28°C搖培3_4h。10，OOOrpm,室溫離心30s,棄上清，加入200 μ I YEB培養(yǎng)基重懸菌體，涂于YEB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天；堿裂解法提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA，酶切驗(yàn)證。質(zhì)粒再重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5 α )，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，再用酶切鑒定。
[0027]實(shí)施例3:含pCAMBIA1301-CsMADSl的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化擬南芥 (I)擬南芥的種植
①所用的擬南芥為野生型擬南芥，為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。當(dāng)年收獲的種子種植后4度春化72 h，隔年種子種植后春化24 h。然后轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)室中在相對(duì)濕度80%，恒溫20-24°C，光照強(qiáng)度80-200 μ mol/M2/S,光照周期為8 h黑暗、16 h光照培養(yǎng)。所用的土為3份蛭石，I份珍珠巖和2份黑土混合而成。
[0028]②將營(yíng)養(yǎng)土用塑料盆裝好，在托盤里加入營(yíng)養(yǎng)液，待營(yíng)養(yǎng)土吸水潮濕后，開始點(diǎn)種。
[0029]③將擬南芥的種子放在平鋪的紙上，用牙簽將擬南芥的種子點(diǎn)在土上。用保鮮膜蓋好，暗培養(yǎng)兩天，四天后揭掉保鮮膜正常培養(yǎng)。
[0030]④土稍干時(shí)可再澆一次營(yíng)養(yǎng)液，以后澆水即可。若要做轉(zhuǎn)化，待抽薹2到3cm時(shí)，剪除頂花序，用營(yíng)養(yǎng)液再澆灌一次。
[0031]⑤種子的收集:擬南芥完全成熟后，停止?jié)菜仓旮稍锖髮M南芥剪下放在一張干凈的光面紙上收集種子，盡量將雜物去干凈，便于篩選。
[0032](2)擬南芥的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的篩選
①制備好已轉(zhuǎn)化了相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液10 ml，在轉(zhuǎn)化前一天晚上，轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時(shí)農(nóng)桿菌液0D600當(dāng)在1.2到1.6之間。室溫5，000 rpm離心10min。棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使0D600在0.8左右。
[0033]②先將植株上已長(zhǎng)出的果莢及開放的花剪掉，再將農(nóng)桿菌懸浮液直接噴灑至整個(gè)植株，主要噴灑在花序上。蓋上透明的塑料蓋子以保持濕度，移入恒溫室避光培養(yǎng)，第二天可開蓋，正常光照培養(yǎng)。
[0034]③一周后再噴灑一次，收種子，在相應(yīng)的抗性1/2 MS平板上篩選轉(zhuǎn)化子。
[0035]④轉(zhuǎn)化子的篩選:種子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述處理時(shí)要不時(shí)地使種子懸浮，并換一次70%乙醇。最后用無(wú)菌水洗四次。
[0036]⑤處理后的種子用Top agar (0.1%瓊脂水溶液)均勻涂布在相應(yīng)的抗性固體篩選培養(yǎng)基表面，每塊150 mm直徑的平皿最多種1500棵。
[0037]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恒溫室培養(yǎng)。將篩選出的轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)到合適的大小后移栽到土壤中。
[0038]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和分析
(I)擬南芥DNA的提取
將適量的經(jīng)篩選的擬南芥葉片放入1.5 ml的離心管中，加入400 μ I的SDS抽提緩沖液，用藍(lán)色小棒研磨成漿狀，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，猛烈搖勻，12，000rpm，離心10 min。取上清至新的離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇和0.1倍體積的3M醋酸鈉(PH5.2)，劇烈混勻使DNA成團(tuán)，放入_20°C沉淀2hr以上。隨后12，000 rpm,離心10 min。棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次后室溫晾干，加適量的TE或超純水溶解。
[0039](2)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的鑒定
以抽提的 DNA 為模板、使用引物 CsMADSl-Fl:GAATTCTTATGGAGCGGTGGAG GTTA 和CsMADSl-Rl:TCTAGATTCCAGTGGCTGAAAGAAGC 擴(kuò)增 CsMADSl 片段，PCR 的 25 μ I 體系為:PCR緩沖液(10Χ)2.5μ l、Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ IUOyM CsMADS 1-FI引物I μ 1、10 μ M CsMADSl-Rl引物I μ 1、使用無(wú)菌水補(bǔ)足25 μ I。反應(yīng)條件為:94°C5min,35個(gè)循環(huán)，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反應(yīng)lOmin。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。抽提陽(yáng)性植株花蕾的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA第一鏈，以CsMADS1-FI和CsMADSl-Rl為引物進(jìn)行RT-PCR分析，反應(yīng)體系和程序同上。內(nèi)參為CsACTIN基因，弓丨物序列為:CsACTIN_F:GACATTCAATGTGCCTGCTATG, CsACTIN-R: CATACCGATGAGAGATGGCTG, PCR 的 25 μ I 體系為:PCR緩沖液(10Χ)2.5μ I, Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ IUOyM CsACTIN-F引物1μ1、10μΜ CsACTIN-R引物I μ 1、使用無(wú)菌水補(bǔ)足25 μ I。反應(yīng)條件為:94°C 5min，26個(gè)循環(huán)，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，72°C反應(yīng)1min。檢測(cè)結(jié)果見圖4所
/Jn ο
[0040](3)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型分析
通過PCR和RT-PCR的結(jié)果，對(duì)獲得的陽(yáng)性植物進(jìn)行觀察，獲得的CsMADSl轉(zhuǎn)基因植株不能正常抽苔開花，頂端分生組織處異位生長(zhǎng)出許多簇生的針狀葉片或退化的小花分枝(圖 5)。
【權(quán)利要求】
1.黃瓜Cs姻Λ?2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.—種黃瓜CsMADSI基因花特異表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為pCAMBIA1301-CsMADSl，其含有黃瓜E族基因CsMADSI，基因的上游連有35S啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜CsMADSl基因花特異表達(dá)載體，其特征在于，由下述方法構(gòu)建而成: 根據(jù)CuGI上登錄號(hào)為Csa004117的黃瓜CsMADSl序列設(shè)計(jì)兩端引物，其中CsMADS1-F引物引入了 NcoI位點(diǎn)，CsMADS1-R引物引入了 BglII位點(diǎn)，
CsMADS1-F:5’ -aaaaCCATGGATGGGAAGAGGAAGAGTAG-3’，CsMADS1-R:5’ -aaaaAGATCTTCAAAGCATCCAACCAGGGAG-3’，以黃瓜花蕾的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CsMADSl全長(zhǎng); 回收CsMADSl的cDNA全長(zhǎng)，將其連接到pMD18載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD18-CsMADSl ； 使用NcoI和BglII酶切pMD18-CsMADSl，回收CsMADSl片段，同時(shí)用NcoI和BglII酶切pCAMBIA1301，回收后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得植物表達(dá)載體pCAMBIAl301-CsMADSI。
4.如權(quán)利要求3所述黃瓜CsMADSl基因花特異表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，將獲得的植物表達(dá)載體pCAMBIAl301-CsMADSI轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，再轉(zhuǎn)入到擬南芥中，收獲植株的種子，晾干后通過潮霉素篩選獲得抗性苗，再通過PCR鑒定和RT-PCR檢測(cè)后獲得轉(zhuǎn)基因植株。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104450735SQ201410659838
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】胡麗芳, 劉世強(qiáng), 賀浩華, 蔣倫偉, 黃長(zhǎng)干, 肖偉 申請(qǐng)人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)