專利名稱：人對氧磷酶3基因表達載體的構(gòu)建及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術制藥技術領域。二. 背景技術對氧磷酶3 (PON3)是對氧磷酶基因家族發(fā)現(xiàn)最晚，研究最少的成員。人 PON3基因cDNA全長1075 bp,其中編碼區(qū)長1065 bp，編碼354個氨基酸?；?因表達產(chǎn)物PON3是分子量約40kDa的糖蛋白，是一種鈣離子依賴性酯酶，具 有芳香酯酶活性、內(nèi)酯酶活性及抗氧化功能[Lu H Q, W a/.及'oc/iew Wwm^o, 2005， 70: 019-1025]。人PON3主要由肝細胞合成分泌入血，在血清中98%與HDL結(jié)合， 但血清中PON3的含量僅為PON1的1/50。實驗證明，PON3不僅有抑制HDL 和LDL氧化修飾的作用，而且有更強的抗氧化能力，純化的兔血清PON3在體 外保護LDL抗銅離子誘導的氧化修飾的能力比PONl強100倍[DraganovDI, 5WCA訓，2000, 275: 33435-33442],因此目前大部分的研究集中在PON3降低體內(nèi) 的氧化壓力，防治動脈粥樣硬化方面。已有的研究表明，氧化壓力和脂質(zhì)超氧化物的升高是多種肝臟疾病的共同病 理機制，氧化壓力升高導致活性自由基增加是肝損傷的重要致病因素，因此抗氧 化治療可應用于肝損傷防治。我們曾發(fā)現(xiàn)肌肉電轉(zhuǎn)移介導外源hPONlQ基因 的表達與分泌，有效降低了肝臟的氧化壓力，對四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷 有很好的保護作用[秦浚川等，專利申請?zhí)?00610097968.6]。由于PON3表現(xiàn)出比 PON1更強的抗氧化作用，且文獻未見PON3應用于肝臟疾病預防的相關報道， 我們研究了用轉(zhuǎn)基因表達來提高血清PON3的活性以降低氧化壓力，保護肝臟， 這可能是一種新的防治肝損傷的途徑。四氯化碳單次注射誘導小鼠急性肝損傷是一種廣泛使用的篩選和評價保肝 護肝藥物的模型，本發(fā)明同時建立了多次隔日注射四氯化碳誘導亞急性肝損傷模型用于評估電轉(zhuǎn)移hPON3抗肝損傷的效果，此模型與急性肝損傷模型相比更接 近于臨床肝臟疾病的發(fā)生過程，因此更具有實際意義。我國是肝臟疾病高發(fā)國家，病毒性肝炎、酒精及藥物中毒性肝病等引起的肝 損傷以及隨之而來的慢性肝纖維化、肝功能衰竭等，己成為最常見疾病之一。傳 統(tǒng)的保肝藥物包括抗氧化劑、內(nèi)源性保護因子、抗膽汁淤積藥物和部分植物藥等。 但是它們大多具有作用時間短、起效較慢、需長期多次用藥等缺點，利用基因治 療的方法導入護肝基因藥物并使之長期高效表達以預防和治療肝臟疾病己成為 一種有良好應用前景的策略。作為基因轉(zhuǎn)移的方法之一，電刺激可介導裸露質(zhì)粒DNA在多種細胞和組織 中的高效表達。與病毒載體相比，此技術具有生物安全性好、實驗步驟簡單、節(jié) 約成本等諸多優(yōu)點。骨骼肌組織細胞數(shù)量龐大，易于進行各種操作，組成細胞多 為成熟的多核肌細胞且更新非常緩慢，供血豐富，蛋白合成能力強，細胞表達的 蛋白質(zhì)能正常分泌進入血液循環(huán)，這些特征決定了其可作為理想的基因轉(zhuǎn)移的靶 組織[McMahon JM, et al. Biodrugs, 2004， 18: 155-165]。有報道證明，電刺激介導下外源 基因在骨骼肌組織中的表達水平比傳統(tǒng)非病毒載體轉(zhuǎn)移方法提高2-4個數(shù)量級， 基因最長可持續(xù)表達9個月以上。我們應用成都儀器廠生產(chǎn)的YC-2型程控刺激 器，接上不銹鋼針狀電極，摸索了適當?shù)碾姶碳?shù)，達到了較好的電轉(zhuǎn)移效果。 三.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的問題是構(gòu)建重組人對氧磷酶3基因的哺乳動物細胞表達 載體，利用電刺激介導的方法將其轉(zhuǎn)入小鼠骨骼肌組織高效表達并通過自身N 端信號肽持續(xù)分泌以提高血清PON3的活性，從而作為新型基因藥物對抗由四氯 化碳誘導的肝細胞損傷以有效地保護肝臟。本發(fā)明的技術方案包括1.重組人對氧磷酶基因3哺乳動物細胞表達載體 pCI-hPON3的設計與構(gòu)建。2.電刺激介導pCI-hPON3在小鼠骨骼肌中的高效表 達與分泌。3.重組人PON3作為基因藥物可提高血清hPON3水平，應用于防治 肝損傷。1. pCI-hPON3的設計與構(gòu)建pCI-hPON3質(zhì)粒的構(gòu)建流程如附圖1所示。以pMD18T-hPON3為模板，用 引物l， 2經(jīng)PCR法擴增1065bp的全長hPON3基因序列，并將其克隆到pCI載體(購自Promega公司)的五coR I和Sa/I位點之間，使hPON3基因處于CMV啟動子的控制之下，得到重組質(zhì)粒pCI-hPON3。經(jīng)測序證明，得到的基因序列與設計一致。pCI-hP0N3質(zhì)粒用CaCl2法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中并進行擴增，質(zhì)粒大量提取的產(chǎn)率為3.15pg/ml大腸桿菌，OD260/280=1.82。弓I物1: 5 ， AAGAATTCATGGGGAAGCTCGTGGCG 3'引物2: 5'CCGTCGACCTAGAGCTCACAGTACAG3，2.電刺激介導的P0N3骨骼肌表達將25pl 2pg/W的pCI-hPON3質(zhì)粒注射入10只預先麻醉的雄性ICR小鼠左 側(cè)脛骨頭肌中。30秒后，將兩根接入電刺激器的針狀電極沿肌纖維方向插入注 射部位兩側(cè)進行基因電轉(zhuǎn)移操作，電場參數(shù)見權(quán)利要求2?？蛰d質(zhì)粒對照組小鼠 肌肉注射相同質(zhì)量的pCI質(zhì)粒并給予相同條件的電刺激，PBS對照組小鼠僅注射 25pl PBS。各組小鼠注射后每兩天自眥靜脈取血并離心分離5pl血清測定hPON3 水解二氫香豆素的活性。電轉(zhuǎn)24小時后，空載質(zhì)粒對照組和轉(zhuǎn)基因組小鼠分別 取肝臟和電轉(zhuǎn)移部位的肌肉組織10mg提取總RNA，用引物3,4做RT-PCR，以 確定電轉(zhuǎn)的pCI-PON3在肌肉中的表達。RT-PCR結(jié)果見附圖2。小鼠p-actin的 表達作為內(nèi)參。引物3: 5 ， ATACTGTGTATCTTTATGTTGTG 3' 引物4: 5'TGAAGCACAGAGCCATTGTTG 3'重組質(zhì)粒pCI-hPON3在電刺激介導下轉(zhuǎn)移進入小鼠骨骼肌組織中表達 hPON3蛋白，具有生物活性的hPON3蛋白分泌至血液中。轉(zhuǎn)基因組小鼠血清 PON3活性自注射質(zhì)粒后24小時起與兩對照組相比開始升高，第8天達到最高 值(2.40± 0.05U/ml)，接近PBS對照組血清PON3活性(1.69 ±0.11 U/ml)和pCI對 照組血清PON3活性(1.69士0.12U/ml)的1.4倍(P<0.05)，高水平的表達至少可 持續(xù)24天，兩對照組小鼠血清PON3活性在此期間無明顯變化，說明電擊介導 下hPON3基因可在小鼠骨骼肌組織中持續(xù)表達并分泌進入血液循環(huán)。RT-PCR 結(jié)果顯示，小鼠肝臟表達的PON3水平與對照組無顯著差異，轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉 組織中則有hPON3特異性表達，空載質(zhì)粒對照組小鼠肌肉無表達，結(jié)果進一步 證實hPON3基因在電刺激介導下在小鼠骨骼肌組織得到了有效表達，并分泌進 入血液循環(huán)，提高了小鼠血清的PON3活性。3. PON3重組質(zhì)粒應用于防治肝損傷轉(zhuǎn)基因組小鼠注射重組質(zhì)粒并電刺激2天后，腹腔注射10% CCl4玉米油溶 液(lml/kg b.w.)，以建立小鼠急性肝損傷模型；另取10只同齡同來源雄性小鼠 每隔一天腹腔注射相同劑量CCU玉米油溶液30天共15次，以建立亞急性肝損 傷模型。同時急性和亞急性肝損傷組分別取IO只健康同齡同來源雄性小鼠注射 相同劑量相同次數(shù)四氯化碳作為陽性對照，另10只小鼠注射相同次數(shù)lml /kg b.w.玉米油作為陰性對照。最后一次注射CC1424小時后，摘眼球取血并處死小 鼠，測定各組小鼠血清ALT、 AST水平，肝勻漿丙二醛(MDA)，還原型谷胱甘 肽(GSH)和總抗氧化活性(T-AOC)，并制作肝臟組織切片以觀察肝臟的損傷情況。 急性和亞急性肝損傷CCU對照組小鼠血清ALT、 AST與正常對照組相比顯 著升高(P<0.01)，其肝勻漿的MDA水平與正常對照組相比分別升高了 1.7倍 和2.3倍(P<0.05)，而GSH和T-AOC水平均有顯著降低(P<0.05)。 CCU對 照組小鼠肝臟組織切片與正常對照組相比，細胞壞死面積、空泡、脂滴及水腫等 病理學改變的比率均顯著增加，說明小鼠肝臟的氧化水平升高，急性與亞急性肝 損傷模型分別建立成功。急性肝損傷組注射四氯化碳后，轉(zhuǎn)基因組小鼠與CCl4對照組相比血清ALT 降低30%， AST降低32。/q，差異顯著(P<0.05);其肝勻漿的MDA水平與CC14 對照組比降低了 53%,已恢復接近正常對照組水平(P〈0.05);而GSH和T-AOC 水平則表現(xiàn)出明顯升高，恢復至正常水平(P<0.05)。病理學分析顯示轉(zhuǎn)基因小 鼠肝臟壞死細胞面積與陽性對照組相比有極顯著的降低，水腫、空泡和脂肪變性 的程度也明顯減輕。亞急性實驗也表現(xiàn)出相同的趨勢轉(zhuǎn)基因組與CCU對照組 相比ALT降低了 80%， AST水平降低了 79%， MDA， GSH和T-AOC也均回復 到了正常對照組的水平。病理切片顯示，中央小靜脈周圍的炎性細胞浸潤和肝細 胞水腫程度明顯減輕，肝細胞壞死和肝細胞索結(jié)構(gòu)的紊亂現(xiàn)象已消失。急性肝損 傷組注射四氯化碳后各組小鼠血清ALT、 AST的變化見附圖3;亞急性肝損傷組 ALT、 AST變化見圖4;急性和亞急性小鼠肝臟典型病理切片照片分別見附圖5， 圖6。以上結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因后，高水平的血清PON3可有效降低肝臟氧化壓力， 對四氯化碳誘導的急性和亞急性肝細胞損傷均有較好的保護作用，因此hPON3 可應用于制備預防和治療肝臟損傷藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果是本發(fā)明首次以防治肝損傷為目標構(gòu)建 人對氧磷酶3基因的哺乳動物細胞表達載體pCI-hP0N3，經(jīng)電刺激介導將其導入 小鼠骨骼肌組織中，并獲得分泌性表達人對氧磷酶3。腹腔注射四氯化碳建立小 鼠急性和亞急性肝損傷模型后，通過血清生化指標測定和肝臟組織病理學分析及 體內(nèi)肝細胞抗氧化實驗檢測，證實轉(zhuǎn)基因表達的人對氧磷酶3對肝細胞損傷有明 顯的保護作用。因此本發(fā)明對防治肝損傷起效較快， 一次給藥可維持藥效時間較 長，毒副作用小，成本低廉。四.


圖1人對氧磷酶基因3哺乳動物細胞表達載體的構(gòu)建流程2轉(zhuǎn)基因組和對照組小鼠PON3在肝臟和肌肉中表達的RT-PCR分析結(jié)果(1) 對照組小鼠肝臟(2) 轉(zhuǎn)基因組小鼠肝臟(3) 轉(zhuǎn)基因組小鼠肌肉(4) 對照組小鼠肌肉圖3急性肝損傷造模成功后各組小鼠血清ALT、 AST的變化 圖4亞急性肝損傷造模成功后各組小鼠血清ALT、 AST的變化 圖5急性肝損傷造模后各組小鼠典型肝臟病理學照片(A) 正常對照組小鼠(B) CCLj對照組小鼠(C) 轉(zhuǎn)基因組小鼠圖6亞急性肝損傷造模后各組小鼠典型肝臟病理學照片(A) 正常對照組小鼠(B) CCU對照組小鼠(C) 轉(zhuǎn)基因組小鼠五.具體實施方式
1.pMD18T-hPON3質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存。以pMD18T-hPON3為模板,.用引物 1 ， 2經(jīng)PCR法擴增hPON3全長基因共1065bp，經(jīng)￡coR I和Sa/I雙酶切后插入 pCI質(zhì)粒的相應多克隆位點中。hPON3基因處于CMV啟動子的控制之下。經(jīng)測 序證明，結(jié)果與設計序列完全一致(流程見附圖1)。將pCI-hPON3轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)TOP10大腸桿菌，并按照《分子克隆》第三版的操作流程擴增 大腸桿菌，PEG法進行質(zhì)粒的大量提取。用紫外分光光度法測定所提取質(zhì)粒的 純度和產(chǎn)率，并用PBS將質(zhì)粒濃度調(diào)整為2pg"l。所有生化試劑均購自Sigma 公司，酶購自Takara公司。2. 健康雄性ICR小鼠30只，SPF級，4-6周齡，體重18-22克，購自南京醫(yī)科大 學實驗動物中心。動物隨機分為3組，分別為轉(zhuǎn)基因組，空質(zhì)粒對照組和PBS 對照組，每組10只。實驗前1天按照下節(jié)所述方法測定各組小鼠血清P0N3水 解二氫香豆素活性的基礎值。實驗前20分鐘各組小鼠腹腔注射巴比妥鈉 300mg/kg b.w.進行麻醉。用漢密爾頓注射器將25^12嗎 1的pCI-hPON3質(zhì)粒肌 肉注射入轉(zhuǎn)基因組小鼠的左側(cè)脛骨頭肌中。30秒后，將接入電刺激器連接的兩 根不銹鋼針狀電極插入注射部位兩側(cè)，電極間距0.5cm。電刺激由成都儀器廠生 產(chǎn)的YC-2型程控刺激器發(fā)生，電場參數(shù)為方波，200V/cm,波寬20ms，頻率 為lHz，脈沖數(shù)8。空質(zhì)粒對照組小鼠注射相同質(zhì)量的pCI質(zhì)粒并給予相同的電 場刺激。PBS對照組僅肌肉注射25plPBS。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級實驗動物 房內(nèi)，自由飲食，環(huán)境溫度22士2。C，濕度45-75%。血清PON3活性的測定實驗前1天及實驗后的每兩天，用微量采血管自小 鼠眥靜脈采血，2000 rpmx10分鐘以分離血清。取5^1血清加入lml反應體系并 充分混勻。反應體系包括50mMTris/HCl(pH8.0)、 1 mMCaCl2及1 mM 二氫香 豆素。反應于37。C水浴中進行IO分鐘，加入10(V10.1MEDTA終止。測定反 應液于270nm處的光吸收并通過水解產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)計算血清中PON3的 酶活性。使用SPSS軟件的方差分析以及兩兩比較對各組小鼠血清PON3活性數(shù) 值進行統(tǒng)計學分析。3. 轉(zhuǎn)基因組小鼠和空載質(zhì)粒對照組小鼠在電轉(zhuǎn)移實施24小時后，分別取肝臟組 織和電轉(zhuǎn)移肌肉部位10mg提取總RNA，并DNaseI消化避免DNA的污染。使 用M-MLV反轉(zhuǎn)錄后用上文提及的引物3,4做RT-PCR反應，小鼠(3-actin的表達 水平為內(nèi)參。PCR反應條件如下94°C初始變性5min, 30個循環(huán)，每個循環(huán) 94。C變性40s， 50。C退火45s， 72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸7min, 保存于-20。C。 1.20/。瓊脂糖凝膠分離鑒定PCR產(chǎn)物。4. 轉(zhuǎn)基因組小鼠注射重組質(zhì)粒并電刺激2天后腹腔注射給予10%四氯化碳玉米油溶液1 ml/kg b.w.誘導急性肝損傷，另取10只同齡同來源雄性小鼠每隔一天腹腔 注射相同劑量CCl4玉米油溶液30天，以建立亞急性肝損傷模型。同時急性和亞 急性肝損傷組分別取兩組各10只來源、性別、周齡相同的小鼠作為對照。其中 一組腹腔注射相同劑量相同次數(shù)四氯化碳作為陽性對照，另 一組腹腔注射相同劑 量相同次數(shù)玉米油作為正常對照。最后一次注射CCU24小時后，將各組小鼠摘 眼球取血并離心分離血清，測定血清ALT、 AST水平，取肝臟制成勻漿測定MDA， GSH和T-AOC水平，另剪取肝臟主葉，置于中性福爾馬林溶液中浸泡固定24 小時，梯度濃度酒精溶液脫水及二甲苯清洗后，石蠟包埋組織塊，并用切片機切 成厚度為4pm的組織切片。切片用蘇木精和伊紅染色，于倒置顯微鏡下觀察、 拍照并進行病理學分析。實驗數(shù)據(jù)均采用方差分析以及兩兩比較進行統(tǒng)計學分 析。所有動物實驗操作均遵守《江蘇省實驗動物管理條例》。
權(quán)利要求
1.一種應用人對氧磷酶3即hPON3構(gòu)建的在哺乳動物細胞內(nèi)表達的重組質(zhì)粒，其特征是將PCR擴增的hPON3基因克隆于pCI載體的EcoR I和SalI位點之間，使hPON3基因位于CMV啟動子的控制之下。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCI-hPON3在電脈沖介導下在小鼠骨骼肌 組織中大量表達并有效分泌至血液的轉(zhuǎn)基因操作方法，其特征是..25^1 2pg/pl 的pCI-hPON3質(zhì)粒肌肉注射入小鼠脛骨頭肌后，將兩根接入電刺激器的不銹鋼 針狀電極插入注射部位兩側(cè)，電場參數(shù)為方波，200 V/cm，波寬20ms，脈沖 次數(shù)8，頻率為lHz。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組表達質(zhì)粒在制備預防和治療肝臟損傷藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術制藥技術領域。本發(fā)明應用人對氧磷酶3基因(hPON3)構(gòu)建了哺乳動物細胞中表達的重組質(zhì)粒pCI-hPON3，使用電轉(zhuǎn)移法在小鼠骨骼肌組織中使hPON3得到高效表達并分泌入血，提高了血清中PON3水平，使小鼠抗氧化壓力的能力加強，有效的防治肝臟損傷。hPON3轉(zhuǎn)基因表達小鼠血清水解二氫香豆素的活性升高約1.4倍，并可持續(xù)24天。轉(zhuǎn)基因組和正常小鼠分別腹腔注射四氯化碳建立小鼠急性和亞急性肝損傷模型后，轉(zhuǎn)基因組小鼠與CCl₄對照組相比血清ALT和AST水平顯著降低，肝臟勻漿的丙二醛(MDA)水平降低，還原型谷胱甘肽(GSH)和總抗氧化能力(T-AOC)升高，病理學切片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因組小鼠肝細胞損傷程度明顯低于CCl₄對照組，表明重組人PON3質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因表達可有效提高血清PON3活性，降低肝臟氧化壓力，可用于肝臟損傷的預防和治療。
文檔編號C12N15/87GK101240292SQ20081001969
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日
發(fā)明者呂海芹, 姜曉玲, 馳 張, 薇 彭, 潔 朱, 秦浚川, 臧宇輝 申請人:南京大學