專利名稱：Q型人對氧磷酶1基因表達載體的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥技術(shù)領(lǐng)域。
二.
背景技術(shù)：
對氧磷酶1(PON1)屬于對氧磷酶基因家族，是一種鈣離子依賴的廣譜水解酶，其化學本質(zhì)是由354個氨基酸組成的分子量為43-54kDa的糖蛋白[Zhu J，etal.Appl Microbiol Biotechnol，2006，72103-108]。哺乳動物體內(nèi)的對氧磷酶1由肝細胞合成，主要分布于血液、肝臟、腎臟等組織器官中。PON1在體外表現(xiàn)出對多種底物的芳香酯酶活性、內(nèi)酯酶活性和有機磷酸酯酶活性。血清中PON1主要與高密度脂蛋白結(jié)合，結(jié)合后酶活性提高40倍以上。PON1的主要生理功能為水解低密度脂蛋白中的氧化脂質(zhì)，從而降低機體的氧化壓力。人體內(nèi)PON1活性與包括肝臟疾病在內(nèi)的很多疾病密切相關(guān)。血清PON1活性的降低數(shù)值可作為慢性肝炎和肝硬化病人肝臟損傷程度的指征。HDL-PON1復合物在防止肝臟纖維化和抗肝細胞凋亡方面也發(fā)揮著重要作用。實驗證明體內(nèi)誘導表達的內(nèi)源性PON1通過與HDL結(jié)合發(fā)揮強大的抗氧化功能，從而阻止肝臟脂質(zhì)過氧化，緩解肝臟纖維化的進程[Ferre N，et al.J Hepatol，2006，4551-59]。
PON1活性很大程度上取決于其第192位氨基酸上的多態(tài)性。若此位點的氨基酸為谷氨酰胺的Q型PON1的內(nèi)酯酶活性強于此位點的氨基酸為精氨酸的R型。流行病學統(tǒng)計表明基因型為Q型純合體的人具有較高的血清PON1活性，其患上述疾病的概率則因此而降低[Li H，et al.J Mol Med，2003，81766-769]。
我國是肝臟疾病高發(fā)國家，病毒性肝炎、酒精及藥物中毒性肝病、其他疾病引起的肝臟損傷以及隨之而來的慢性肝纖維化、肝功能衰竭等，已成為危害健康的最常見疾病之一。傳統(tǒng)的保肝藥物包括抗氧化劑、內(nèi)源性保護因子、抗膽汁淤積藥物和部分植物藥等。但是它們大多具有作用時間短、起效較慢、需長期多次用藥等缺點。因此，利用基因治療的方法導入護肝基因并使之長期穩(wěn)定地高效表達以預防和治療肝臟疾病已成為臨床保肝治療中一種有良好應(yīng)用前景的策略。
作為基因轉(zhuǎn)移的方法之一，電刺激可介導裸露質(zhì)粒DNA在多種細胞和組織中的高效表達。與病毒載體相比，此技術(shù)具有生物安全性好、實驗步驟簡單、節(jié)約成本等諸多優(yōu)點。骨骼肌組織細胞數(shù)量龐大，易于進行各種操作，組成細胞多為成熟的多核肌細胞且更新非常緩慢，這些生理特征都決定了其可作為理想的基因轉(zhuǎn)移的靶組織[McMahon JM，et al.Biodrugs，2004，18155-165]。電刺激介導下外源基因在骨骼肌組織中的表達水平可比傳統(tǒng)非病毒載體轉(zhuǎn)移方法提高2-4個數(shù)量級，且基因可持續(xù)表達9個月以上。我們應(yīng)用成都儀器廠生產(chǎn)的YC-2型程控刺激器，接上不銹鋼針狀電極，摸索了適當?shù)碾姶碳?shù)，達到了較好的電轉(zhuǎn)移效果。
我們構(gòu)建Q型人對氧磷酶1基因的哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.0-hPON1Q，并利用國產(chǎn)YC-2型程控刺激器，經(jīng)電刺激介導首次將其導入小鼠骨骼肌組織中以達到高效表達hPON1Q基因的目的。當腹腔注射給予四氯化碳建立小鼠急性肝損傷模型后，通過生化指標測定和病理學分析，證實轉(zhuǎn)基因表達的人對氧磷酶1對肝細胞損傷有明顯的保護作用。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利的目的是構(gòu)建重組Q型人對氧磷酶1基因的哺乳動物細胞表達載體，利用電刺激介導的方法將其轉(zhuǎn)入小鼠骨骼肌組織高效表達并通過自身N端信號肽持續(xù)分泌以提高血清PON1的活性，從而作為新型基因藥物對抗由四氯化碳誘導的肝細胞損傷以有效地保護肝臟。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括1.重組Q型人對氧磷酶基因1哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.0-PON1Q的設(shè)計與構(gòu)建。2.電刺激介導的pcDNA3.0-hPON1Q在小鼠肌肉組織中的高效表達與分泌。3.重組Q型人PON1作為基因藥物可提高的血清hPON1Q應(yīng)用于肝臟損傷的保護。
1.pcDNA3.0-hPON1Q質(zhì)粒的構(gòu)建流程如附圖1所示。以pBluescript-hPON1Q為模板，用引物1，2經(jīng)PCR法擴增1065bp的全長hPON1Q基因序列，并將其克隆到pcDNA3.0載體的EcoR I和HindIII位點之間，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.0-hPONIQ，使hPON1Q基因處于CMV啟動子的控制之下。經(jīng)測序證明，得到的基因序列與設(shè)計一致。pcDNA3.0-hPON1質(zhì)粒用CaCl2法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中并進行擴增，質(zhì)粒大量提取的產(chǎn)率為2.4μg/ml大腸桿菌，OD260/280＝1.83。
引物15’CGAAGCTTATGGCGAAGCTGATTGCG 3’引物25’CGGAATTCGGAGCTCACAGTAAAGAG 3’2.將50μl 1μg/μl的pcDNA3.0-hPON1Q質(zhì)粒肌肉注射入10只預先麻醉的ICR小鼠右側(cè)脛骨頭肌中。30秒后，用將兩根接入電刺激器的針狀電極沿肌纖維方向插入注射部位兩側(cè)進行基因電轉(zhuǎn)移操作，電場參數(shù)見權(quán)利要求2?？蛰d質(zhì)粒對照組小鼠肌肉注射相同質(zhì)量的pcDNA3.0質(zhì)粒并給予相同條件的電刺激，PBS對照組小鼠僅注射50μl PBS。各組小鼠注射后每兩天自眥靜脈取血并離心分離1μl血清測定其對乙酸苯酯的芳香酯酶活性。
重組質(zhì)粒pcDNA3.0-hPON1Q于電擊介導下轉(zhuǎn)移進入小鼠骨骼肌組織中表達hPON1Q，具有生物活性的hPON1Q蛋白大量分泌至血液中。各組小鼠血清PON1活性隨時間的變化如附圖2所示。轉(zhuǎn)基因組小鼠血清PON1活性自注射質(zhì)粒后4天起與兩對照組相比顯著升高(P＜0.05)，第10天達到最高值(84.7U/ml)，接近PBS對照組血清PON1活性(56.1U/ml)的1.5倍。第16天轉(zhuǎn)基因組小鼠血清PON1水平仍然維持在對照組的1.3倍以上。兩對照組小鼠血清PON1活性從第1天至第16天無明顯變化。說明電擊介導下hPON1Q基因可在小鼠骨骼肌組織中持續(xù)大量表達并通過自身信號肽分泌進入血液循環(huán)，異位表達的hPON1Q使血清PON1水平維持在較高水平(與對照組相比P＜0.05)至少達13天以上。
3.轉(zhuǎn)基因組小鼠注射重組質(zhì)粒并電刺激10天后，腹腔注射四氯化碳0.8ml/kgb.w.以建立小鼠急性肝損傷模型，同時取10只健康同齡同來源雌性小鼠注射相同劑量四氯化碳作為陽性對照，另10只注射20μl植物油作為陰性對照。24小時后摘眼球取血并處死小鼠取肝臟組織，測定各組小鼠血清PON1、ALT、AST水平，并制作肝臟組織切片以觀察肝臟的損傷情況。
各組小鼠腹腔注射四氯化碳或植物油24小時后，陽性對照組小鼠血清ALT、AST與陰性對照組相比顯著升高(P＜0.01)，陽性對照組小鼠肝臟組織切片與陰性對照組相比，細胞壞死、空泡、出血及水腫等病理學改變的比率均顯著增加(P＜0.01)，說明小鼠急性肝損傷模型建立成功。陽性對照組小鼠血清PON1水平下降到32.9U/ml，為正常小鼠的58％，而轉(zhuǎn)基因組小鼠血清PON1水平下降到52.2U/ml，仍為正常小鼠的91％。這也同時證明了轉(zhuǎn)基因組小鼠血清PON1的提高源于肌肉所表達PON1的貢獻。注射四氯化碳后各組小鼠血清PON1的變化見附圖3。與陽性對照組相比，轉(zhuǎn)基因組小鼠血清ALT降低44％，AST降低38％，差異都具有極顯著性(P＜0.01 )，且病理學分析顯示小鼠肝臟組織出現(xiàn)壞死的細胞比率由71％降低到27％，水腫、空泡的發(fā)生比率及細胞間出血點數(shù)量也顯著降低(P＜(0.01)。注射四氯化碳后各組小鼠血清ALT、AST的變化見附圖4；小鼠肝臟典型病理學切片照片見附圖5。以上結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因表達10天后，高水平的血清對氧磷酶活性可對抗四氯化碳誘導的急性肝細胞損傷，即hPON1Q可在制備預防和治療肝臟損傷藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果有保肝效果顯著，起效較快，一次給藥可維持藥效時間較長，毒副作用小，成本低廉等。
四.


圖1 Q型人對氧磷酶基因1哺乳動物細胞表達載體的構(gòu)建流程2 轉(zhuǎn)基因組和對照組小鼠血清PON1水平隨時間變化曲線圓點轉(zhuǎn)基因組方塊空質(zhì)粒加電擊對照組三角PBS對照組圖3注射四氯化碳24小時后各組小鼠血清PON1的變化圖4注射四氯化碳24小時后各組小鼠血清ALT、AST的變化圖5注射四氯化碳24小時后各組小鼠典型肝臟病理學照片(a)陰性對照組小鼠(b)陽性對照組小鼠(c)轉(zhuǎn)基因組小鼠五.具體實施方式
1.pBluescript-hPON1Q質(zhì)粒由C.E.Furlong教授饋贈。以pBluescript-hPON1Q為模板，用引物1，2經(jīng)PCR法擴增hPON1Q全長基因共1065bp，經(jīng)EcoR I和HindIII雙酶切后插入pcDNA3.0質(zhì)粒的多克隆位點。hPON1Q基因處于CMV啟動子的控制之下。經(jīng)測序證明，結(jié)果與設(shè)計序列完全一致(流程見附圖1)。將pcDNA3.0-hPON1Q轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)TOP10大腸桿菌，并按照《分子克隆》第三版的操作流程擴增大腸桿菌進行質(zhì)粒的大量提取。用紫外分光光度法測定所提取質(zhì)粒的純度和產(chǎn)率，并用PBS將質(zhì)粒濃度調(diào)整為1μg/μl。所有生化試劑均購自Sigma公司，酶購自Invitrogen公司。
2.健康雌性ICR小鼠30只，SPF級，4-6周齡，體重19-21克，購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心。動物按體重隨機分為3組，分別為轉(zhuǎn)基因組，空質(zhì)粒對照組和PBS對照組，每組10只。實驗前1天按照下節(jié)所述方法測定各組小鼠血清PON1活性的基礎(chǔ)值。實驗前20分鐘各組小鼠腹腔注射巴比妥鈉200mg/kg b.w.進行麻醉。用漢密爾頓注射器將50μl 1μg/μl的pcDNA3.0-hPON1Q質(zhì)粒肌肉注射入轉(zhuǎn)基因組各小鼠的右側(cè)脛骨頭肌中。30秒后，將接入電刺激器連接的兩根不銹鋼針狀電極沿肌纖維方向插入注射部位兩側(cè)，插入深度約0.3cm，電極間距0.5cm。電刺激由成都儀器廠生產(chǎn)的YC-2型程控刺激器發(fā)生，電場參數(shù)為方波，200V/cm，波寬20ms，頻率為1Hz，脈沖數(shù)8?？召|(zhì)粒對照組小鼠注射相同質(zhì)量的pcDNA3.0質(zhì)粒并給予相同的電場刺激。PBS對照組僅肌肉注射50μlPBS。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房內(nèi)，自由飲食，環(huán)境溫度22±2℃，濕度45-75％。
血清PON1活性的測定實驗前1天及實驗后的每兩天，用微量采血管自小鼠眥靜脈采血20μl，2000rpm×10分鐘以分離血清。取1μl血清加入1ml反應(yīng)體系并充分混勻。反應(yīng)體系包括50mM Tris/HCl(pH8.0)、2mM CaCl2及10mM乙酸苯酯。反應(yīng)于37℃水浴中進行10分鐘，加入100μl 0.1M EDTA終止。測定反應(yīng)液于270nm處的光吸收并通過水解產(chǎn)物苯酚的摩爾消光系數(shù)計算血清中PON1的芳香酯酶活性。采用方差分析以及兩兩比較對各組小鼠血清PON1活性數(shù)值進行統(tǒng)計學分析并繪制各組小鼠血清PON1活性隨時間變化的曲線圖。
3.轉(zhuǎn)基因組小鼠注射重組質(zhì)粒并電刺激10天后腹腔注射給予四氯化碳0.8ml/kgb.w.(四氯化碳預先以植物油按體積比1∶10溶解)，另取兩組各10只來源、性別、周齡相同的小鼠作為對照。其中一組腹腔注射相同劑量的四氯化碳作為陽性對照，另一組腹腔注射20μl植物油作為陰性對照。24小時后，將各組小鼠摘眼球取血并離心分離血清，按上節(jié)所述方法測定血清PON1活性，并用測定血清ALT、AST水平。處死小鼠后，立即剪取肝臟主頁，置于福爾馬林溶液中浸泡固定24小時。梯度濃度酒精溶液脫水及二甲苯清洗后，肝組織塊被石蠟包埋，并用切片機切成厚度為1mm的組織切片。切片用蘇木精和伊紅染色，于倒置顯微鏡下觀察、拍照并進行病理學分析。實驗數(shù)據(jù)均采用方差分析以及兩兩比較進行統(tǒng)計學分析。所有動物實驗操作均遵守《江蘇省實驗動物管理條例》。
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動物細胞內(nèi)表達Q型人對氧磷酶1hPON1Q的重組質(zhì)粒，其特征是將PCR擴增后的hPON1Q基因克隆于pcDNA3.0載體的EcoRI和HindIII位點之間，使hPON1Q基因位于CMV啟動子的控制之下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-hPON1Q在電擊介導下于小鼠骨骼肌組織中大量表達并分泌的轉(zhuǎn)基因操作方法，其特征是50μl 1μg/μl的pcDNA3.0-PON1Q質(zhì)粒肌肉注射入小鼠脛骨頭肌后，將兩根接入電刺激器的不銹鋼針狀電極沿肌纖維方向插入注射部位兩側(cè)，電極距離0.5cm。電刺激由成都儀器廠生產(chǎn)的YC-2型程控刺激器發(fā)生，電場參數(shù)為方波，200V/cm，波寬20ms，脈沖數(shù)8，頻率為1Hz。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述表達載體在制備預防和治療肝臟損傷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用重組的Q型對氧磷酶基因1(hPON1Q)表達質(zhì)粒經(jīng)骨骼肌電刺激轉(zhuǎn)移異位分泌表達，有效地提高血清PON1水平，防治肝臟的損傷，從而作為新型基因藥物而保護肝臟。構(gòu)建hPON1Q在哺乳動物細胞中表達的重組質(zhì)粒pcDNA3.0－h(huán)PON1Q，運用電刺激介導的方法使之在小鼠骨骼肌組織中高效表達并大量分泌，血清對氧磷酶活力在轉(zhuǎn)基因10天后上升到正常小鼠的1.5倍并可維持到第16天以上。轉(zhuǎn)基因組和正常小鼠(陽性對照組)分別腹腔注射四氯化碳建立小鼠急性肝損傷模型24小時后，轉(zhuǎn)基因組小鼠血清ALT和AST水平顯著低于陽性對照組(P＜0.01)，病理學分析顯示轉(zhuǎn)基因組小鼠各項肝細胞損傷指標均顯著低于陽性對照組(P＜0.01)。以上結(jié)果表明重組人PON1Q質(zhì)?？勺鳛榛蛩幬锾岣哐錚ON1活性，用于肝臟損傷的預防和治療。
文檔編號A61P1/16GK1962874SQ200610097968
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月24日
發(fā)明者秦浚川, 張馳, 朱潔, 臧宇輝, 彭薇, 姜曉玲 申請人:南京大學