專利名稱：H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種AIV亞型抗原蛋白——H5HA蛋白。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種家禽和野禽的感染和/或疾病綜合征。AIV具有高度變異性，基于血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)兩種表面抗原的抗原性不同，可分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)HA亞型15個(gè)、NA亞型9個(gè)。根據(jù)流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)和基質(zhì)蛋白(Matrix proteins，M)抗原性的不同，將流感病毒分為三個(gè)血清型，即A、B、C型(或稱甲、乙、丙型)，各型之間可以通過AGP試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等檢測區(qū)分。所有AIV均為A型流感病毒。
自Perroncito于1878首次報(bào)道在意大利發(fā)生禽流感、1959年發(fā)生高致病性禽流感以來，全球至少有23次大規(guī)模的暴發(fā)與流行，每次都造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前世界許多國家和地區(qū)均有本病的暴發(fā)和流行。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為A類傳染病。我國也將其列為一類動(dòng)物疫病。1997年香港禽流感事件中，H5N1 AIV首次突破種間障礙直接感染人并引起人死亡，打破了自然條件下僅有H1、H2、H3亞型流感病毒可以感染人的常規(guī)，由此賦予了AIV全新的公共衛(wèi)生意義。2003年末至2004年初，在韓國、日本、泰國、越南、中國大陸、中國臺灣等國家和地區(qū)先后暴發(fā)了禽流感，毒株為H5N1亞型。2005年我國青海又發(fā)生了H5N1的感染，再次引起全世界對AI的廣泛關(guān)注。
禽流感是嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的病毒性烈性傳染病。我國是世界第一養(yǎng)禽大國，養(yǎng)禽總量達(dá)100億羽，近年，禽流感的發(fā)生與流行，在我國已造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的社會影響，尤其1997和1999年出現(xiàn)了禽流感病毒(AIV)直接感染人的事件，2003年末至2004年初，先后在東南亞國家和地區(qū)爆發(fā)了禽流感。2004年亞洲有53人感染禽流感病毒，41人死亡，禽流感引起全世界的廣泛關(guān)注乃至恐慌。禽流感的公共衛(wèi)生意義更引起世人的震撼和關(guān)注，其防制已直接關(guān)系到我國養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和人民的身體康。因而早期快速診斷和免疫抗體監(jiān)測是禽流感防制的關(guān)鍵，具有重要意義。
目前，國內(nèi)外對AIV早期診斷技術(shù)和檢測技術(shù)的研究均取得了不同程度的進(jìn)展。禽流感H5、H7、H9亞型多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒在深圳研制成功；臺灣中興大學(xué)研發(fā)檢測H5及H7抗體的酵素免疫吸附反應(yīng)(ELISA)快速檢驗(yàn)套組法，已可應(yīng)用于大量血清檢體篩檢；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院、香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合流感研究中心與廈門大學(xué)合作研制出世界首個(gè)禽流感病毒H5N1快速診斷藥盒試劑盒；韓國研制出一種可迅速確診禽流感的簡易診斷盒。同時(shí)，禽流感疫苗的研制也在廣泛進(jìn)行之中。這說明AIV的早期診斷、檢測及防治方法的研究已引起世界范圍的關(guān)注。
對禽流感的診斷，目前主要有檢查雞血清抗體、禽流感病毒分離鑒定、核酸檢測等方法。而直接檢測禽流感病毒抗原的方法的，目前還沒有相關(guān)研究。鑒于目前國內(nèi)已開始廣泛使用AIV滅活苗，檢測血清抗體診斷本病已不可能；病毒分離需要接種敏感動(dòng)物或培養(yǎng)細(xì)胞，存在耗時(shí)長、操作繁瑣等缺點(diǎn)；免疫熒光需要熒光顯微鏡等設(shè)備，而且結(jié)果判斷存在主觀性；RT-PCR方法要求提取組織RNA，技術(shù)要求較高，不適于基層實(shí)驗(yàn)室操作。此外，上述方法均不便于進(jìn)行大批量樣品的檢測，難以滿足當(dāng)前禽流感疫情發(fā)展的需要。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有敏感、準(zhǔn)確、快速、簡單等其它方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，而該方法建立的瓶頸在于是否有大量具生物活性的、特異性的抗原蛋白。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明提供一種能有效檢測致病致死率極高的禽流感H5亞型的HA抗體的H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白。
本發(fā)明首先將pUCM-TH5HA質(zhì)粒由BamH I、EcoRV雙酶切，經(jīng)補(bǔ)平后回收得到目的片段；pPIC9K質(zhì)粒由EcoR I線性化，兩端分別補(bǔ)平、去磷后回收；將以上回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后即獲得目的質(zhì)粒pPIC9K-H5HA；再用Sal I線性化pPIC9K-H5HA重組質(zhì)粒，線性化后將其電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)中，再在MD平板中培養(yǎng)，而后挑取單個(gè)菌落于YPD培養(yǎng)基中復(fù)蘇，提重組體基因組進(jìn)行PCR鑒定，篩選出的陽性菌株于BMGY培養(yǎng)基中搖菌，離心后轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基中開始甲醇誘導(dǎo)，產(chǎn)物離心后取上清，加入飽和硫酸銨沉淀蛋白，收集蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化即得到H5HA抗原蛋白。
由上述方法所獲得的H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白SEQ ID NO1。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為本發(fā)明開展了利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)制備用于HPAIVELISA快速檢測的抗原蛋白的研究。由于HA具有免疫原性，為保護(hù)性抗原，其誘導(dǎo)的相應(yīng)抗體稱血凝抑制抗體，能抑制血凝現(xiàn)象和中和病毒的感染性，為保護(hù)性抗體，所以本發(fā)明以H5HA為研究對象，成功獲得了針對H5HA抗體的抗原蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、間接ELISA檢測，具良好生物活性。其表達(dá)量高、特異性強(qiáng)、易于純化、具有完整的空間構(gòu)象等特點(diǎn)完全符合ELISA快速檢測試劑盒的鑒定要求。
1、發(fā)明得到的抗原蛋白，一方面可檢測機(jī)體內(nèi)AIV抗體；另一方面可輔助AIV檢測工具的研制并為AIV新型基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
2、發(fā)明中所涉及的抗原蛋白，針對致病性最高的AIV亞型(H5HA)之一，針對性強(qiáng)，具有很重要的實(shí)踐意義。
3、發(fā)明中所涉及的抗原蛋白，利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，除具有良好的生物活性外，還可大量表達(dá)及純化，易于產(chǎn)業(yè)化。
4、至今國內(nèi)還沒有利用酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行AIV亞型的表達(dá)，因此，本發(fā)表有極高的創(chuàng)新性。


圖1是本發(fā)明pPIC9K-H5HA質(zhì)粒構(gòu)建圖；圖2是本發(fā)明H5HA抗原蛋白真核表達(dá)及制備模式圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先將pUCM-TH5HA質(zhì)粒由BamH I、EcoRV雙酶切，經(jīng)補(bǔ)平后回收得到目的片段；pPIC9K質(zhì)粒由EcoR I線性化，兩端分別補(bǔ)平、去磷后回收；將以上回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后即獲得目的質(zhì)粒pPIC9K-H5HA；再用SalI線性化pPIC9K-H5HA重組質(zhì)粒，線性化后將其電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)中，28℃條件下再在MD平板中培養(yǎng)2～3天，而后挑取單個(gè)菌落于YPD培養(yǎng)基中復(fù)蘇，提重組體基因組進(jìn)行PCR鑒定，篩選出的陽性菌株于BMGY培養(yǎng)基中28℃條件下?lián)u菌16～18h，離心后轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基中開始甲醇誘導(dǎo)，產(chǎn)物離心后取上清，加入飽和硫酸銨沉淀蛋白，使硫酸銨終濃度達(dá)到70％，收集蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化即得到H5HA抗原蛋白。
由上述方法所獲得的H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白SEQ ID NO1。
下面敘述本發(fā)明的實(shí)施方法1、方法1.1分子生物學(xué)常規(guī)的基因操作大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取及限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段的回收、線性DNA片段的連接、重組質(zhì)粒的篩選與鑒定、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)相關(guān)章節(jié)進(jìn)行。
1.2重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-H5HA的構(gòu)建pUCM-TH5HA質(zhì)粒由BamH I、EcoRV雙酶切，經(jīng)補(bǔ)平后回收得到目的片段；pPIC9K質(zhì)粒由EcoR I線性化，兩端分別補(bǔ)平、去磷后回收；將以上回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后即獲得目的質(zhì)粒pPIC9K-H5HA。
1.3酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取巴斯德畢赤酵母菌GS115單個(gè)菌落至5ml YPD液體培養(yǎng)基中，30℃振搖過夜。次日轉(zhuǎn)接到500ml新鮮YPD培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)至OD600＝1.3～1.5。于4℃2500r/min離心5分鐘，收集菌體。用冰預(yù)冷的無菌去離子水懸浮，洗滌2次，再用冰預(yù)冷的無菌1M的山梨醇洗滌一次，最后取沉淀用1/500體積冰預(yù)冷的無菌1M的山梨醇懸浮，制備成酵母感受態(tài)細(xì)胞，即可用于轉(zhuǎn)化。
1.4重組工程菌的制備將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-H5HA用Sal I線性化，取5～20μg線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒與剛剛制備的GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，用加樣器將樣品滴加于0.2cm電轉(zhuǎn)杯兩電極間，冰浴5min，用ECM830電轉(zhuǎn)儀于電壓300V，電容25μF，電阻200Ω條件下電轉(zhuǎn)化。電擊后，立即加入1ml 1M冰浴冷山梨醇，混勻，取200～600μl菌液涂布于MD選擇平板上，30℃孵育2～3天，挑取單個(gè)菌落YPD擴(kuò)菌后用玻璃珠法提取酵母基因組，以所提基因組為模板PCR擴(kuò)增，挑選外源基因整合入酵母基因組內(nèi)的陽性菌，然后對這些菌進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，挑選高表達(dá)菌株，同時(shí)對培養(yǎng)基和表達(dá)時(shí)氧飽和度等條件進(jìn)行優(yōu)化。
上游引物5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3；下游引物5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。
1.5酵母工程菌株的甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)接種單個(gè)陽性菌株或甘油菌(-20℃保存)于100mlYPD培養(yǎng)基中，28～30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)約16～18h，5000rpm離心10min收菌，用100ml BMGY培養(yǎng)基重懸，28～30℃，250rpm搖瓶培養(yǎng)，使OD600達(dá)到2～6(約16～18h)，離心收集菌體，沉淀用5～10倍體積的BMMY培養(yǎng)基重懸，28～30℃， 250rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～6d，并于誘導(dǎo)表達(dá)起始后，每隔24小時(shí)補(bǔ)加甲醇至總體積的0.5～1.0％，每隔24h取出1ml樣品用于測試表達(dá)量。
1.6外源基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將工程酵母菌在BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間后，5000rpm離心10min收集菌體和培養(yǎng)基上清，菌體采用直接煮沸裂解法在Loadingbuffer中裂解菌體蛋白，培養(yǎng)基上清中的表達(dá)蛋白裝入透析袋中，先在PBS中4℃透析24h，用PEG20000進(jìn)行10倍濃縮后，再在PBS中進(jìn)行透析12h，取出濃縮產(chǎn)物與2倍Loading buffer等量混合，與裂解的酵母菌菌體蛋白一起進(jìn)行SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達(dá)。
1.7間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18936-2003)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》中間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，對所表達(dá)抗原進(jìn)行測定。過程如下除A1、B1、C1和D1孔不加樣品，留做空白調(diào)零，pPIC9K空載體表達(dá)產(chǎn)物和H5HA標(biāo)準(zhǔn)抗原分別作為陰性對照和陽性對照外，其余孔取1∶400稀釋的被檢蛋白，每孔100μl包被板，將加樣位置做好記錄。倒掉孔內(nèi)包被液，用PBS洗三次。加入H5HA標(biāo)準(zhǔn)血清，將反應(yīng)板蓋好蓋子后置37℃環(huán)境下作用30min。倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上空干，每孔加滿洗液，靜置1～2min后倒掉，空干，再重復(fù)沈2次。除A1、B1、C1和D1孔外，其他每孔加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗雞二抗100μl，蓋好蓋子后置37℃環(huán)境下作用30min。用上述同樣的方法再洗滌三次，加入底物使用液(堿性磷酸酶緩沖液中加入BCIP/NBT混合液)，每孔90μl，置室溫避光顯色2～3min，加入中止液(濃硫酸11.1ml+蒸餾水88.9ml)，每孔90μl，使其終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定每個(gè)孔在490nm波長的光密度值(即OD490值)，OD≥0.2者判定為陽性，0.18≤OD＜0.2需重復(fù)測試1次，若仍在此范圍則判為陽性，OD＜0.18者判定為陰性。
1.8表達(dá)條件的優(yōu)化根據(jù)畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)的特點(diǎn)，通過不同的溶解氧(95％、85％、75％、65％、55％)、培養(yǎng)時(shí)間(2d、3d、4d、5d)、甲醇濃度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5.％)、轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)數(shù)(100、150、200、250)和pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)來優(yōu)化表達(dá)條件。
1.9酵母轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性分析分別將陽性酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行10個(gè)周期的菌體擴(kuò)增和誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行PCR鑒定及表達(dá)檢測，分析外源基因是否丟失。
2、結(jié)果分析
2.1重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-H5HA的構(gòu)建酶切鑒定圖見說明書附圖1，從圖中可見，重組質(zhì)粒pPIC9K-H5HA經(jīng)Kpn I單酶切后，正向連接應(yīng)出現(xiàn)8800、1600、612三條帶，反向連接應(yīng)出現(xiàn)8300、2100、612三條帶；經(jīng)Sac I單酶切后，正向連接應(yīng)出現(xiàn)9000、2000兩條帶，反向連接應(yīng)出現(xiàn)9500、1500兩條帶；經(jīng)Sal I單酶切后線性化。證明構(gòu)建正確。
2.2酵母重組子的PCR鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果見說明書附圖2，從圖中可見，GS115/pPIC9K-H5HA轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出1.9kb大小的帶，正好與目的基因H5HA加分泌信號的大小相當(dāng)，證明我們的目的基因已整合入酵母基因組中。
2.3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE將經(jīng)篩選的轉(zhuǎn)化子接種BMGY和BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)上清用70％硫酸銨沉淀，取沉淀溶于原1/10體積的PBS(PH7.4)中，取樣進(jìn)行SDS-PAGE，其結(jié)果見說明書附圖3。從說明書附圖3可以看出，GS115/pPIC9K-H5HA轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物在62kDa處出現(xiàn)與預(yù)計(jì)大小相符條帶。
2.4表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果經(jīng)系列優(yōu)化，最終確定目標(biāo)蛋白最佳表達(dá)條件是大于80％的溶解氧、1％甲醇誘導(dǎo)、培養(yǎng)4d、搖瓶轉(zhuǎn)速大于200rpm、培養(yǎng)基pH值為6.0。最高表達(dá)量達(dá)培養(yǎng)液上清中可溶性蛋白的17％，約為47.9mg/L。
2.5遺傳穩(wěn)定性分析將構(gòu)建的酵母工程菌GS115/pPIC9K-H5HA接種在YPD液體培養(yǎng)基和BMMY培養(yǎng)基中傳代10次后，進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增和表達(dá)產(chǎn)物的檢測。結(jié)果表明，酵母工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能在多次傳代后的酵母工程菌染色體中擴(kuò)增出目的基因片段，用甲醇誘導(dǎo)后可在培養(yǎng)液上清中檢測到目的蛋白的表達(dá)。
2.6間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)ELISA檢測，GS115/pPIC9K-H5HA表達(dá)產(chǎn)物測定值OD490≥0.2，可判定為陽性；GS115/pPIC9K表達(dá)產(chǎn)物測定值OD490＜0.18，可判定為陰性。證明所制備抗原蛋白具良好生物活性，能特異地中和H5HA抗體。
3、結(jié)論通過以上方法實(shí)施，成功獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-H5HA、酵母重組子GS115/pPIC9K-H5HA，并經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后可獲得目的抗原蛋白H5HA，具生物學(xué)活性，可特異性地中和H5HA抗體。在甲醇誘導(dǎo)過程中，其表達(dá)條件不斷優(yōu)化可增加表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)酵母轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。綜上所述，本發(fā)明成功獲得具有生物活性的H5HA抗原蛋白，其將在抗體檢測、AIV基因工程疫苗的研制及AIV抗原檢測制品的研制中均體現(xiàn)出重要的開發(fā)利用價(jià)值，其高效性和穩(wěn)定性還為產(chǎn)業(yè)化制備提供良好前景。
序列表<110>金寧一<120>H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1707<212>DNA<213>Avian<221>CDS<222>(1)..(1707)<400>1atg gag aga ata gtg ctt ctt ctt gca ata gtc agt ctt gtt aaa agt 48gat cag att tgc att ggt tac cat gca aac aac tcg aca gag cag gtt 96gac aca ata atg gaa aag aac gtt act gtt aca cat gcc caa gac ata 144ctg gaa aag aca cac aac ggg aag ctc tgc gat cta gat gga gtg aag 192cct cta att ttg aga gat tgt agt gta gct gga tgg ctc ctc gga aac 240cct atg tgt gac gaa ttc atc aat gtg ccg gaa tgg tct tac ata gtg 288gag aag gac agt cca gcc aat gac ctc tgt tac cca ggg gat ttc aac 336gac tat gaa gaa ctg aaa cac cta ttg agc aga ata aac cat ttt gag 384aaa att cag atc atc ccc aaa agt tct tgg tcc aat cat gaa gcc tca 432tca ggg gtg agc tca gca tgt cca tac aat ggg aag ccc tcc ttt ttc 480aga aat gtg gta tgg ctt att aaa aag aac agt gca tac cca aca ata 528aag agg agc tac aat aat acc aac caa gaa gat ctt ttg gta ctg tgg 576ggg att cac cat cct aat gat gcg gca gag cag aca aaa ctc tat caa 624aac cca acc acc tat att tcc gtt gga aca tca aca cta aac ctg aga 672ttg gtc cca aaa ata gct act aga tcc aaa gta aac ggg caa agt gga 720
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1.一種H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白的制備方法，其特征在于首先將pUCM-TH5HA質(zhì)粒由BamH I、EcoRV雙酶切，經(jīng)補(bǔ)平后回收得到目的片段；pPIC9K質(zhì)粒由EcoR I線性化，兩端分別補(bǔ)平、去磷后回收；將以上回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后即獲得目的質(zhì)粒pPIC9K-H5HA；再用SalI線性化pPIC9K-H5HA重組質(zhì)粒，線性化后將其電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)中，再在MD平板中培養(yǎng)，而后挑取單個(gè)菌落于YPD培養(yǎng)基中復(fù)蘇，提重組體基因組進(jìn)行PCR鑒定，篩選出的陽性菌株于BMGY培養(yǎng)基中搖菌，離心后轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基中開始甲醇誘導(dǎo)，產(chǎn)物離心后取上清，加入飽和硫酸銨沉淀蛋白，收集蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化即得到H5HA抗原蛋白。
2.由權(quán)利要求1的方法所獲得的H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白SEQ ID NO1。
全文摘要
一種H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種H5亞型禽流感病毒基因抗原蛋白。本發(fā)明提供一種能有效檢測致病致死率極高的禽流感H5亞型的HA抗體的H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白。本發(fā)明首先將pUCM－TH5HA質(zhì)粒由BamH I、EcoRV雙酶切，得到的pPIC9K質(zhì)粒由EcoR I線性化，再經(jīng)T4連接酶連接獲得質(zhì)粒pPIC9K－H5HA；用Sal I線性化pPIC9K－H5HA重組質(zhì)粒，經(jīng)過一系列工作后即得到H5HA抗原蛋白。本發(fā)明表達(dá)量高、特異性強(qiáng)、易于純化、具有完整的空間構(gòu)象等特點(diǎn)完全符合ELISA快速檢測試劑盒的鑒定要求。
文檔編號C07K14/11GK1936014SQ200510017149
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月21日
發(fā)明者金寧一, 徐一鳴, 魯會軍, 李昌, 韓松, 金擴(kuò)世 申請人:金寧一