專利名稱：一種食物中毒菌多聯(lián)融合毒素及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體包括多聯(lián)融合細菌毒素及其建立方法，成為廣譜性免疫學檢測方法的開始。
背景技術：
食物中毒菌是食品衛(wèi)生中經(jīng)常遇到的問題，細菌(毒素)性食物中毒又是最常見的形式之一。對食品中細菌檢驗的常規(guī)方法是在檢驗時要鑒定每一個細菌(毒素)及其型別，優(yōu)點是科學準確，但這個過程復雜而又較為漫長，對產(chǎn)毒菌株在分離后再確定是否為產(chǎn)毒株或什么種類的毒素。目前使用的快速檢測方法又難以滿足檢測覆蓋面廣的要求。在食品中病原或毒素的檢測方法學方面，一是尋找精確的檢測技術，另一方面是尋找快速檢測技術，再就是尋找廣泛性的檢測技術。對于食品中或其他領域的細菌或細菌毒素還沒有廣泛意義的檢測方法，能夠在較短時間內(nèi)同時判斷食品中是否含有可疑食物中毒菌或毒素，而不管哪種菌或毒素；如果陰性就表明在一定范圍內(nèi)該食品安全，如果陽性則需要在限定范圍內(nèi)進一步確定檢測。這在食品工業(yè)具有重要的經(jīng)濟學意義，在食品衛(wèi)生與安全上有時甚至比精確檢驗更有意義。在多聯(lián)融合細菌毒素的基礎上所建立的這種方法有可能成為廣譜性免疫學檢測方法的開始。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種食物中毒菌多聯(lián)融合毒素及其用途，以解決目前食品檢測過程復雜而又較為漫長，缺乏廣泛性多聯(lián)融合毒素試劑盒的問題。本發(fā)明采取的技術方案是5個毒素基因肉毒梭菌毒素A基因Hc、金黃色葡萄球菌腸毒素A基因SEA、B基因SEB、大腸桿菌O 157:H7 veroB亞基毒素基因VT1B、VT2B，用連接序列l(wèi)inker串聯(lián)起來形成Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB。
Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的核苷酸序列如SEQ ID NO1。
食物中毒菌多聯(lián)融合毒素的核苷酸序列，其所編碼表達的可溶性食物中毒菌多聯(lián)融合毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2。
一種抗原，由食物中毒菌多聯(lián)融合毒素核酸序列表達產(chǎn)生，該表達產(chǎn)生的是基因工程菌表達的可溶性蛋白。
一種抗體，采用該上述抗原，用2mg/次加等體積的完全佛氏佐劑免疫家兔第一次，每隔7天再分別以同樣量蛋白和不完全佛氏佐劑免疫家兔4次，測抗體效價后采血獲得血清。
上述抗體在制備食品毒素檢測試劑盒中的應用。
本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果在于將大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌和肉毒梭菌三種菌的5個毒素基因或片段用linker串聯(lián)起來得Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB，2928bp，在pET22-b中獲得包涵體和可溶性兩種表達產(chǎn)物。免疫家兔，得到抗5種細菌毒素的血清抗體，與五種毒素具有非常高的特異性和反應敏感性，同時與一定范圍(同屬內(nèi))相近型別的毒素有交叉反應，這樣就獲得了在一定范圍內(nèi)有限交叉的廣譜性抗體。為多基因抗原串聯(lián)及在食物中毒菌或毒素廣譜、快速篩檢方法的建立奠定了方法學基礎。用以解決目前食品檢測過程復雜而又較為漫長，缺乏廣泛性多聯(lián)融合毒素試劑盒的問題


圖1、本發(fā)明基因PCR的linker連接和擴增。
圖2、SDS-PAGE電泳結果，M蛋白marker，1、未誘導的HVSVS-pET-226，2、37℃包涵體蛋白上清，3、37℃包涵體蛋白，4、25℃包涵體蛋白上清，5、25℃包涵體蛋白，6、4h/2PTG誘導的HVSVS-pET-226重組質粒。
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明食物中毒菌多聯(lián)融合毒素的核苷酸序列的制備材料和方法1.1菌株金黃色葡萄球菌A\B(26072，26075)Staphylococcus aureus A\B(26072，26075)，肉毒梭菌A(62A)Clostridium botulinum A(62A)，大腸桿菌O157:H7E.coli O157:H7；other strains綠膿桿菌Pseudomonasaerugionsa，金黃色葡萄球菌C(C1，C2)Staphylococcus aureus C(C1，C2)，金黃色葡萄球菌E Staphylococcus aureus E，單核細胞增多性李氏桿菌Listeria monocytogene，小腸結腸耶氏菌(52207)Yersinia enterocolitica(52207)，弗氏耶氏菌Yersinia frederiksenii，中間型耶氏菌Yersiniaintermedia，克氏耶氏菌Yersinia kristensenii，假結核耶氏菌Yersiniapseudotuberculosis，鼠疫耶氏菌Yersinia pestis，副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus，亞利桑那沙門氏菌Salmonella arizonae，副傷寒沙門氏菌A Salmonella paratyphi A，副傷寒沙門氏菌C Salmonella paratyphi C，豬霍亂沙門氏菌Salmonella choleraesuis，腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis，傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium，雞沙門氏菌Salmonella pullorum，都柏林沙門氏菌Salmonella Dublin，倫敦沙門氏菌Salmonella London，阿伯丁沙門氏菌Salmonella aberdeen，紐波特沙門氏菌Salmonella newport，蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus，枯草桿菌Bacillus subtilis，炭疽桿菌(弱毒株)Bacillus anthracis(low toxic strain)，空腸彎桿菌Campylobacter jejuni，宋內(nèi)氏志賀氏菌Shigella sonnei，魏氏梭菌Clostridium welcii，肉毒梭菌BClostridium botulinum B，肉毒梭菌CClostridium botulihum，C..
1.2分子克隆1.2.1引物和連接序列l(wèi)inker引物P15’-CCA TGG ACC TTT CCA AAT ACG TAG ATA ATC-3’P25’-CGT GCC CGG ACC CAG TGG CCT TTC TCC CCA TC-3’P35’-ACT GGG TCC GGG TCC GGG CAC GCC TGA TTG TGT AACTGG-3’P45’-TGC CCG GAC CCG GAC CAC GAA AAA TAA CTT CGA TGAATC-3’P55’-TTC GTG GTC CGG GTC CGG GCA GCG AGA AAA GCGAAG AAA-3’P65’-GCC CGG ACC ACT TGT ATA TAA ATA TAT ATC AAT-3’P75’-AAG TGG TCC GGG TCC GGG CGC GGA TTG TGC TAA AGGTAA-3’P85’-TCG CCC GGA CCC GGA CCG TCA TTA TTA AAC TGC ACTTCA-3’P95’-TGA CGG TCC GGG TCC GGG CGA GAG TCA ACC AGATCC TAA-3’P105’-CTC GAG TTA TTC AAA TAC CCG AAC AGT AAT ACT-3’Linker5’-ggt ccg ggt ccg ggc-3’1.2.2基因組提取按Vitagene基因組提取說明書分別提取肉毒梭菌毒素A的基因Hc，其核苷酸序列如SEQ ID NO3、金黃色葡萄球菌腸毒素A的基因SEA，其核苷酸序列如SEQ ID NO4、金黃色葡萄球菌腸毒素B的基因SEB，其核苷酸序列如SEQ ID NO5、大腸桿菌O 157:H7 veroB亞基毒素基因VT1B，其核苷酸序列如SEQ ID NO6和大腸桿菌O 157:H7 veroB亞基毒素基因VT2B，其核苷酸序列如SEQ ID NO7。
1.2.3PCR擴增目的基因Hc(肉毒梭菌毒素A的重鏈無毒性片段)94℃ 5min，94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 1min，每退火一個循環(huán)下降1℃，至33℃，35循環(huán)，4℃保存，其它毒素基因的PCR條件94℃5min，94℃ 1min，43℃(SEA)，48℃(SEB)，57℃(VT2B)，55℃(VT1B)，50sec，72℃1min。Hc1338bp，VT1B2137bp，VT2B210bp，SEB414bp，SEA699bp。
1.2.3連接毒素基因 Hc1332bp，VT1B207bp，VT2B210bp，SEA699bp，SEB 414bp，Linker。重組基因全長為2928bp。見圖1，第一次PCRHc、VT1B、SEA、VT2B、SEB，擴增5個基因片段；第二次PCRVT1B-SEA、VT2B-SEB，擴增兩個基因連接產(chǎn)物第三次PCRVT1B-SEA-VT2B-SEB，擴增四個基因連接產(chǎn)物第四次PCRHc-VT1B-SEA-VT2B-SEB，擴增五個基因連接產(chǎn)物。
該重組基因Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的核苷酸序列如SEQ ID NO1。
經(jīng)測序表明重組毒素基因分別為原基因或部分基因序列。實施例2本發(fā)明重組毒素的表達與純化Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB基因，以下簡稱HVSVS，pET-22b表達載體、在宿主菌E.coli DH5α中分別在37℃或25℃、1～6h，或者過夜表達，1mmol/L IPTG誘導。在pET-22b表達載體表達的可溶性蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，切下目的蛋白帶，回收后作為免疫原。見圖2。
HVSVS在pET-22b中37℃、4h的表達形式為可溶性(5.29％)和包涵體(4.69％)兩種，以1mmol/L IPTG誘導。25℃時幾乎全是可溶性表達蛋白(9.9％)。表達蛋白分子量為112.33kDa。大部分可溶性蛋白位于胞漿，小部分位于細胞周質。
該食物中毒菌多聯(lián)融合毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2。實施例3抗重組毒素抗體的制備用TE(pH8.0)緩沖液將表達菌體沉淀懸起，用超聲波將表達菌體打碎后，離心，去沉淀；上清裝入透析袋中，用PEG20000透析濃縮2h，濃縮后的上清經(jīng)SDS-PAGE電泳后切下目的蛋白帶，于勻漿器中使之漿化，用2倍的TE(pH8.0)緩沖液混勻，置4℃12h，期間振搖3～4次，然后用10000r/min離心20min，上清即為融合毒素HVSVS表達蛋白。用紫外分光光度計測定蛋白濃度。用純化的可溶性表達蛋白2mg/次加等體積的完全佛氏佐劑用注射器混勻法混勻或完全乳化后免疫家兔第一次，采取背部皮下多點注射法。以后每間隔7天再分別以同樣量蛋白和不完全佛氏佐劑混合后免疫家兔4次。最后一次免疫7天心臟采血，37℃ 1h，使血液凝固，再放4℃過夜，使血塊收縮。10000g離心10min分離獲得血清。用瓊脂擴散或ELISA方法測抗體效價后按常規(guī)采血獲得血清。
實施例4抗體特性鑒定用瓊脂擴散試驗和ELISA測定抗體效價瓊脂擴散用1.8％瓊脂，血清分別稀釋0×，2×，4×，8×，16×，32×等幾個稀釋倍數(shù)，24～48h后觀察抗原抗體沉淀帶的情況；ELISA方法用pH9.6的包被液稀釋5種天然毒素幾個稀釋度，每孔加100μL，然后分別測定其敏感度。用同屬內(nèi)的毒素和29種其它常見食源性病原菌做特異性檢測。見表1。
表1抗體特異性(OD490nm)

注A、B、E、C1、C2為金黃色葡萄球菌，C.bA，C.bB，C.bC為肉毒梭菌。
瓊脂擴散試驗表明，V T1B為64×，其它毒素的抗體效價均為16×。ELISA試驗結果表明，V T1B為51200×，SEA為6400×，VT2B為12800×，Hc為6400×，SEB為6400×?？扇苄员磉_蛋白和包涵體免疫家兔產(chǎn)生的抗體效價幾乎相同。與相關毒素屬以外的毒素和其它26種常見食源性病原菌培養(yǎng)物沒有明顯可見的ELISA反應，但與在這三種菌屬內(nèi)的毒素有一定的交叉反應?？贵w與對應毒素的ELISA反應敏感性分別為Hc31.25ng/mL，VT1B3.75ng/mL，SEA125.00ng/mL，VT2B7.50ng/mL，SEB62.50ng/mL。
實施例5模擬食物樣品的檢測將5種產(chǎn)毒菌種培養(yǎng)物與牛奶混合，制備成5個稀釋系列，血清被稀釋成3000×，用ELISA測定模擬食物樣品，每個稀釋系列模擬樣品30份。
對于乳的模擬樣品的共150份樣品的ELISA檢測均出現(xiàn)了陽性結果，而對照并有雜菌干擾的樣品均為陰性。不同稀釋度測定結果表明，ELISA的檢測敏感性可達4×10-2ng毒素/mL乳。見表2表2模擬樣品(乳)ELISA敏感性測定

實施例6食品中細菌毒素ELISA檢測試劑盒試劑和材料1、聚苯乙烯塑料微量組織培養(yǎng)板2、包被液(pH9.6moL碳酸鹽緩沖液)3、洗滌液(pH7.4、0.01moLPBS)4、保溫液(含BSA0.1g，0.05％PBS-Tween-20/100mL)5、底物溶液①pH5.0，0.2moL的磷酸鹽—檸檬酸緩沖液；②用磷酸鹽—檸檬酸緩沖液100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配，加入鄰苯二胺(OPD)40mg，30％H2O20.15mL6、終止液(2moLH2SO4)
7、血清抗體(3000倍稀釋)8、酶標羊抗兔抗體(1∶400倍稀釋)操作方法1.樣品處理乳類食品鮮奶可直接作為樣品，如果濃稠的用PBS稀釋2倍。
肉類食品將肉粉碎后用PBS稀釋3倍，取上清作為測定樣品。
2.抗原包被用百百液做10倍稀釋后，每孔加100μL，不家抗原作空白對照，4℃過夜。
3.洗滌用洗滌液洗滌3次，每次浸潤3分鐘，瀝干。
4.將保溫液稀釋的血清每孔加100μL，37℃1小時。
5.同樣洗滌3次。
6.加入酶標二抗100μL/孔，37℃1小時。
7.同樣洗滌3次。
8.加入底物，100μL/孔，置暗盒內(nèi)顯色20分鐘。
9.加入終止液50μL/孔，靜止5分鐘。
10.490nm測OD值。與陰性值相差兩倍以上即為陽性。
<110>吉林大學畜牧獸醫(yī)學院<120>食物中毒菌多聯(lián)融合毒素<130>liuzs2005<160>7<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2928<212>DNA<213>人工<400>1atggaccttt ccaaatacgt agataatcaa agattattat ctacatttac tgaatatatt60aagaatatta ttaatacttc tatattgaat ttaagatatg aaagtaatca tttaatagac120ttatctaggt atgcatcaaa aataaatatt ggtagtaaag taaattttga tccaatagat180aaaaatcaaa ttcaattatt taatttagaa agtagtaaaa ttgaggtaat tttaaaaaat240gctattgtat ataatagtat gtatgaaaat tttagtacta gcttttggat aagaattcct300aagtatttta acagtataag tctaaataat gaatatacaa taataaattg tatggaaaat360aattcaggat ggaaagtatc acttaattat ggtgaaataa tctggacttt acaggatact420caggaaataa aacaaagagt agtttttaaa tacagtcaaa tgattaatat atcagattat480ataaacagat ggatttttgt aactatcact aataatagat taaataactc taaaatttat540ataaatggaa gattaataga tcaaaaacca atttcaaatt taggtaatat tcatgctagt600aataatataa tgtttaaatt agatggttgt agagatacac atagatatat ttggataaaa660tattttaatc tttttgataa ggaattaaat gaaaaagaaa tcaaagattt atatgataat720caatcaaatt caggtatttt aaaagacttt tggggtgatt atttacaata tgataaacca780tactatatgt taaatttata tgatccaaat aaatatgtcg atgtaaataa tgtaggtatt840
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權利要求
1.一種食物中毒菌多聯(lián)融合毒素的核苷酸序列，其特征在于5個毒素基因肉毒梭菌毒素A基因Hc、金黃色葡萄球菌腸毒素A基因SEA、B基因SEB、大腸桿菌O 157H7veroB亞基毒素基因VT1B、VT2B，用連接序列l(wèi)inker串聯(lián)起來形成Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB。
2.根據(jù)權利要求1所述的食物中毒菌多聯(lián)融合毒素的核苷酸序列，其特征在于Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的核苷酸序列如SEQ ID NO1。
3.根據(jù)權利要求2所述的食物中毒菌多聯(lián)融合毒素的核苷酸序列，其所編碼表達的可溶性食物中毒菌多聯(lián)融合毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2。
4.一種抗原，由如權利要求2所述的食物中毒菌多聯(lián)融合毒素核酸序列表達產(chǎn)生，該表達產(chǎn)生的是基因工程菌表達的可溶性蛋白。
5.一種抗體，采用如權利要求4所述抗原，用2mg/次加等體積的完全佛氏佐劑免疫家兔第一次，每隔7天再分別以同樣量蛋白和不完全佛氏佐劑免疫家兔4次，測抗體效價后采血獲得血清。
6.如權利要求5所述的抗體在制備食品毒素檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食物中毒菌多聯(lián)融合毒素及其用途，屬于生物技術領域。肉毒梭菌毒素A基因Hc、金黃色葡萄球菌腸毒素A基因SEA、B基因SEB、大腸桿菌O 157H7veroB亞基毒素基因VT
文檔編號C07K19/00GK1818066SQ20051001714
公開日2006年8月16日 申請日期2005年9月21日 優(yōu)先權日2005年9月21日
發(fā)明者柳增善, 于師宇, 孟憲梅 申請人:吉林大學