一種特異性探針及將其用于快速靈敏定量金黃色葡萄球菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及W肉食品和動(dòng)物腸道內(nèi)容物為樣本對(duì)病原菌檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)，具體設(shè) 及一種快速定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌(51日地如〇(3(3〇(3118 aureus)的核酸探針雜交方法的建 立，其屬于微生物學(xué)和分子生物學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（S化曲^ococcus aureus),屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，是引起細(xì)菌性食 物中毒的重要病原菌之一。美國(guó)疾病控制中屯、報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染位居第 二位，僅次于大腸桿菌。我國(guó)每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。根據(jù)北京、溫州、長(zhǎng)沙、南 通、長(zhǎng)春市等多省市地區(qū)研究機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防控制中屯、報(bào)道，當(dāng)?shù)厣i、雞、牛、羊肉、水產(chǎn) 品、熟肉制品W及水果蔬菜中均檢測(cè)出金黃色葡萄球菌，總體檢出率為2.45-9.32%。由次可 見，我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品金黃色葡萄球細(xì)菌污染較為嚴(yán)重，對(duì)消費(fèi)者易造成潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)食 品衛(wèi)生安全領(lǐng)域，我國(guó)衛(wèi)生部經(jīng)過(guò)多次修訂，制定了針對(duì)畜禽等農(nóng)產(chǎn)品中金黃色葡萄球檢 測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.10-2010。標(biāo)準(zhǔn)W傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，包括前增菌、分離培 養(yǎng)、結(jié)合生化及血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行判定，其步驟繁瑣，時(shí)間冗長(zhǎng)，工作量大，報(bào)告結(jié)果通常需要 5-7天。過(guò)長(zhǎng)的檢驗(yàn)時(shí)間，使得生產(chǎn)部口延誤時(shí)間，增加成本，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，而且無(wú) 法應(yīng)對(duì)緊急情況。此外，在現(xiàn)代高密度集約化動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，隨著飼料中抗生素的濫用現(xiàn) 象愈演愈烈，因養(yǎng)殖動(dòng)物腸道菌群失調(diào)而引起的金黃色葡萄球菌腸炎現(xiàn)象大大增加，因此 開展動(dòng)物腸道內(nèi)容物中的細(xì)菌檢測(cè)已成為健康養(yǎng)殖研究的重要內(nèi)容。相較于肉食品，動(dòng)物 腸道內(nèi)容物中包含糞便、飼料殘?jiān)⒓?xì)菌W及脫落細(xì)胞等等，面對(duì)此類更為復(fù)雜的樣本，包 括各級(jí)食品衛(wèi)生防疫部口W及其他研究機(jī)構(gòu)迫切需要一種快速準(zhǔn)確定量檢測(cè)金黃色葡萄 球菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明針對(duì)目前國(guó)內(nèi)畜禽產(chǎn)品及養(yǎng)殖衛(wèi)生安全狀況嚴(yán)峻、致病菌檢測(cè)方法研究滯 后等問(wèn)題，通過(guò)利用巧光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)(FISH-FCM)相結(jié)合的方法對(duì)建立起一套金 黃色葡萄球菌定量檢測(cè)方法。在對(duì)致病菌分子遺傳信息充分了解的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性的 核酸探針，將巧光素染料標(biāo)記于核酸探針，與目標(biāo)細(xì)菌發(fā)生特異性結(jié)合，并且通過(guò)利用細(xì)胞 核巧光染料對(duì)細(xì)菌和樣品細(xì)胞染色，結(jié)合流式細(xì)胞儀的應(yīng)用原理，應(yīng)用雙標(biāo)記的方法降低 檢測(cè)中可能發(fā)生的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，從而保證鑒定結(jié)果的可靠性。 為此本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:本發(fā)明基于金黃色葡萄球菌16s-rRNA保守端序列設(shè)計(jì) 特異性的互補(bǔ)核酸探針，命名為SA-1，并在5'端標(biāo)記上異硫氯酸巧光素 FITC; SA-1 序列號(hào)為：5 ' -GCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGC -3 '。 一種檢測(cè)復(fù)雜樣品中金黃色葡萄球菌的方法，按照W下步驟進(jìn)行:其處理對(duì)象為肉樣 品或動(dòng)物腸道內(nèi)容物，首先制備樣品稀釋液，低速離屯、去除較大雜質(zhì)，多聚甲醒固定并高速 離屯、后恒溫雜交； 巧光素標(biāo)記探針與樣本雜交后應(yīng)用PI對(duì)樣本進(jìn)行整體染色并加入巧光微球，通過(guò)流式 細(xì)胞儀進(jìn)行巧光參數(shù)分析，根據(jù)一定數(shù)量分析樣本中已知巧光微球的濃度即可計(jì)算出目標(biāo) 細(xì)菌的數(shù)量。 述探針標(biāo)記所用的FITC最大激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。 所述PI最大激發(fā)波長(zhǎng)為535nm，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm。 所述巧光微球激發(fā)光為紫外至635nm，散射光波長(zhǎng)為385至800nm。 一種FISH-FCM法驗(yàn)證所述探針特異性的方法，按照W下步驟進(jìn)行： 將各種菌株按照常規(guī)劃線培養(yǎng)法獲得單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)菌濃度調(diào)整 為106個(gè)/ml，雜交方法如下：（1)取20化1菌液用等體積8%多聚甲醒溶液4°C固定比； (2) 固定完畢后，將樣品于12000g高速離屯、lOmin，用PBS緩沖液洗涂3次； (3) 取10μ1固定的菌液加入85μ1預(yù)熱的雜交緩沖液(0.9M NaCl，20mM Tris/HCl pH 7.2，0.1%SDS)中，加入lOOng/μΙ濃度的探針化1，50°C雜交化； (4) 在ImlPBS緩沖液中加入50μ1雜交溶液，滿旋震蕩； (5 )將溶液上流式細(xì)胞儀，對(duì)每個(gè)樣品分析2000個(gè)物體。 一種FISH-FCM法并利用所述探針檢測(cè)金黃色葡萄球菌含量靈敏度的方法，按照W下步 驟進(jìn)行： 經(jīng)顯微鏡計(jì)數(shù)，金黃色葡萄球菌液原始濃度為5.0 X 106個(gè)/ml，10倍比稀釋菌液，W5.0 X106、5.0X105、5.0X104、5.0X103、5.0X102、5.0X10l梯度的菌液進(jìn)行檢?i;檢測(cè)方法如 權(quán)利要求6( 1 )-(4)步驟，在混合液中加入1000個(gè)/μ1的巧光微球50μ1，流式細(xì)胞儀對(duì)每個(gè)樣 品分析5000個(gè)物體。 本發(fā)明基于金黃色葡萄球菌16s-rRNA保守端序列設(shè)計(jì)特異性的互補(bǔ)核酸探針，命名為 SA-1，在5'端標(biāo)記上異硫氯酸巧光素 FITC，門TC標(biāo)記的SA-1能夠與經(jīng)過(guò)處理的金黃色葡萄 菌特異性結(jié)合，從而使其激發(fā)巧光，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用艦化丙晚PI對(duì)細(xì)菌、肉樣細(xì)胞或腸道 內(nèi)容物進(jìn)行整體染色處理，并且W已知濃度的巧光微球?yàn)閮?nèi)參，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)巧光參 數(shù)的分析從而達(dá)到細(xì)菌定量的目的。 相比傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法，F(xiàn)ISH-FCM全程僅需幾個(gè)小時(shí)，大大節(jié)約了時(shí)間，因而能有效提 高食品衛(wèi)生監(jiān)管部口的工作效率，保證了應(yīng)對(duì)措施的及時(shí)實(shí)行。而巧光原位雜交(FISH)法 鑒定微生物最初應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，巧光素標(biāo)記的核酸探針可與目的細(xì)菌結(jié)合使其在巧光顯 微鏡下顯示出相應(yīng)顏色，該方法具有特異性高且直觀的特點(diǎn)，但由于通常情況下為保證統(tǒng) 計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性，操作人員需要選擇多達(dá)數(shù)十個(gè)視野進(jìn)行分析，運(yùn)無(wú)疑增加了工作量，降低 了實(shí)驗(yàn)效率。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是一種能夠?qū)渭?xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行理化、免疫及分子 生物學(xué)等多參數(shù)性狀檢測(cè)的現(xiàn)代分析技術(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。此外，已 報(bào)道的應(yīng)用FISH-FCM檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法中僅針對(duì)純培養(yǎng)的菌液，而實(shí)際檢測(cè)中面對(duì) 肉樣品甚至更為復(fù)雜的樣本，在探針雜交過(guò)程中可能存在假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。本發(fā)明應(yīng) 用FISH-FCM進(jìn)行致病菌的快速定量分析，將克服W往傳統(tǒng)培養(yǎng)方法報(bào)告延滯的缺點(diǎn)，通過(guò) 檢測(cè)探針的特異性并且應(yīng)用雙標(biāo)記方法降低樣本檢測(cè)中其他物質(zhì)對(duì)探針雜交的干擾，因此 從整體使得FISH-FCM技術(shù)在金黃色葡萄球菌的實(shí)際檢測(cè)中更加合理。
【附圖說(shuō)明】
[0004]圖1、2巧光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合(FISH-FCM)驗(yàn)證探針SA-1的有效性；圖1 為陰性結(jié)果，圖2為陽(yáng)性結(jié)果。 圖3巧光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合法(FI甜-FCM)檢測(cè)肉樣中的金黃色葡萄球菌。 區(qū)域A表示目的細(xì)菌;區(qū)域B表示其它細(xì)菌;區(qū)域C表示非細(xì)菌物質(zhì)；區(qū)域D表示巧光微球。 圖4、5、6、7、8、9、10巧光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合法(FISH-FCM)檢測(cè)金黃色葡萄 球菌的靈敏度；圖4、5、6、7、8、9、10金黃色葡萄球菌溶液濃度依次為5.0X10U5.0X102、 5.0X103、5.0X104、5.0X105、5.0X106、5.0X107 個(gè)/ml。 圖11、12巧光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合法(FISH-FCM)檢測(cè)肉錯(cuò)腸道內(nèi)容物中的金 黃色葡萄球菌，圖11為患病錯(cuò)腸道內(nèi)容物樣本，圖12為正常錯(cuò)腸道內(nèi)容物樣本。 【具體實(shí)施方式】 [000引 實(shí)施例1: 核酸探針的特異性驗(yàn)證 1.1菌種 大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙口氏菌、豬霍亂沙口氏菌、普通 變形桿菌、枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、尿腸球菌 1.2寡核巧酸探針 試驗(yàn)采用金黃色葡萄球菌特異性探針SA-1，序列為:5 ' -GCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGC-3'。其中5'端由異硫氯酸醋巧光素 FITC標(biāo)記，大連寶生物公司合成并標(biāo)記探針。 1.3 FISH-FCM法驗(yàn)證探針特異性 將十一種菌株按照常規(guī)劃線培養(yǎng)法獲得單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)菌濃度調(diào) 整為1 〇6個(gè)/ml，雜交方法如下：（1)取20化1菌液用等體積8%多聚甲醒溶液4°C固定化。（2)固 定完畢后，將樣品于12000g高速離屯、lOmin，用PBS緩沖液洗涂3次。（3)取10μ1固定的菌液加 入85μ1預(yù)熱的雜交緩沖液(0.9Μ化Cl，20mM Tris/肥1 pH 7.2,0.1%505)中，加入100叫/41 濃度的探針扣1，50°C雜交化。（4)在ImlPBS緩沖液中加入50μ1雜交溶液，滿旋震蕩。巧)將溶 液上流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur?，Becton Dickinson,美國(guó)），對(duì)每個(gè)樣品分析2000個(gè)物 體。 1.4結(jié)果分析 WCellQuest Pro軟件（版本5.2. l，Becton Dickinson,美國(guó)）分析。在dot plot 圖上， X軸表