專利名稱：新型抗腫瘤化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型kahalalide抗腫瘤化合物，特別是kahalalide F的類似物，含有它們的藥物組合物以及它們作為抗腫瘤、抗病毒、抗真菌劑和在銀屑病治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Kahalalide化合物是從一種夏威夷海洋中草食性軟體動物Elysiarufescens及其食物，綠藻羽藻屬物種(green alga Bryopsis.sp.)中分離出來的肽。關(guān)于Kahalalides F的描述見于Hamman，M等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，5825-5826。
關(guān)于Kahalalide A-G地描述見于Hamann，M.等，J.Org.Chem，1996，61，6594-6600″Kahalalidesbioactive peptides from a marine mollusk Elysiarufescens and its algal diet Bryopsis sp.″。
關(guān)于Kahalalide H和J的描述見于Scheuer P.J.等，J.Nat.Prod.1997，60，562-567″Two acyclic kahalalides from the sacoglossan mollusk Elysiarufescens″。
關(guān)于Kahalalide O的描述見于Scheuer P.J.等，J.Nat.Prod.2000，63(1)152-4A new depsipeptide from the sacoglossan mollusk Elysia ornata and thegreen alga Bryopsis species″。
關(guān)于kahalalide K，參見Kan，Y.等，J.Nat.Prod.1999 62(8)1169-72″Kahalalide KA new cyclic depsipeptide from the hawaiian green algaBryopsis species″。
相關(guān)報道還參見Goetz等，Tetrahedron，1999，55；7739-7746″Theabsolute stereochemistry of Kahalalide F″；Albericio，F(xiàn).等TetrahedronLetters，2000，41，9765-9769″Kahalalide B.Synthesis of a naturalcyclodepsipeptide″；Becerro等J.Chem.Ecol.2001，27(11)，2287-99″Chemical defenses of the sarcoglossan mollusk Elysia rufescens and its hostAlga bryopsis sp.″。
在kahalalide化合物中，kahalalide F因其抗腫瘤活性而最具前景。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含六個氨基酸作為環(huán)狀部分和七個氨基酸的末端具有脂肪酸基團(tuán)的環(huán)外鏈。據(jù)報道原始的kahalalide F具有結(jié)構(gòu)(I)。
在WO 04035613中描述了下式(II)的4(S)-甲基乙基化合物。WO04035613中所有內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
Kahalalide F抗人肺癌A-549和人結(jié)腸癌HT-29的體外細(xì)胞培養(yǎng)物的活性報道于EP 610 078。還證明Kahalalide F具有抗病毒和抗真菌性能，以及在銀屑病的治療中的用途。
WO 02 36145描述了含Kahalalide F的藥物組合物和這種化合物在癌癥治療中新的應(yīng)用，其完整地結(jié)合于此作為參考。
WO 03 33012描述了Kahalalide化合物在腫瘤學(xué)中的臨床應(yīng)用，其完整地結(jié)合于此作為參考。
關(guān)于天然及合成kahalalide化合物的合成及細(xì)胞毒活性的描述參見WO 01 58934，其完整地結(jié)合于此作為參考。WO 01 58934描述了Kahalalide F的合成及末端脂肪酸鏈被其它脂肪酸替代的具有相似結(jié)構(gòu)的化合物的合成。
仍需提供更多的抗腫瘤化合物，特別是更多具有改良了的性能的Kahalalide化合物。
發(fā)明概述
我們發(fā)現(xiàn)了具有改善的生物學(xué)活性的Kahalalide類似物化合物。
本發(fā)明涉及式1的化合物，
其中環(huán)狀或環(huán)外部分中的一個或多個氨基酸被其它天然或非天然氨基酸替代，被有機(jī)基團(tuán)掩蔽或被除去。本發(fā)明還涉及式1的化合物，其中脂肪族末端酸基被其它?；娲虮怀ァ?br> 本發(fā)明還涉及包含前述化合物及藥用載體，賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療患癌癥、病毒感染、真菌感染或銀屑病的任何哺乳動物，尤其是人的方法，包括對被感染的個體施用治療有效量的上述化合物。
本發(fā)明可特別用于治療對其它治療無有利應(yīng)答的難治癌癥的患者。特別是，本發(fā)明的組合物可在其它化療嘗試和無效后使用。
本發(fā)明特別涉及對前列腺癌，乳腺癌，肝細(xì)胞癌，黑素瘤，結(jié)直腸癌，腎癌，卵巢癌，NSCL癌，上皮癌，胰腺癌及過表達(dá)Her2/neu癌基因的腫瘤患者的治療。
另一方面本發(fā)明涉及上述定義的化合物在制備藥物中的應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物用于癌癥，銀屑病，病毒感染或真菌感染的治療。
本發(fā)明另外提供包含獨(dú)立容器的試劑盒，容器含有藥物組合物和重構(gòu)試劑，該組合物含有以上定義的化合物。還提供了重構(gòu)方法。
發(fā)明詳述
我們鑒定了Kahalalide F的類似物，其表現(xiàn)出相對于Kahalalide F的顯著活性改進(jìn)。
本發(fā)明涉及式1的化合物，
其中環(huán)外或環(huán)上的一個或多個氨基酸被其它天然或非天然氨基酸替代，被有機(jī)基團(tuán)掩蔽或被除去。本發(fā)明還涉及式1的化合物，其中脂肪族甲基己酸?；黄渌；娲虮怀?。
環(huán)外氨基酸
本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括式1的化合物，其中環(huán)外鏈的一個或多個氨基酸被其它天然或非天然氨基酸替代，被有機(jī)基團(tuán)掩蔽或被除去。
特別地，優(yōu)選的化合物包括那些環(huán)外鏈中有1、2或3個替代氨基酸的化合物；以及那些環(huán)外鏈上有1、2、3、4、5或6個氨基酸被除去的化合物。
特別優(yōu)選的是式1的那些化合物，其中一個環(huán)外鏈氨基酸被另一個天然或非天然氨基酸替代，和/或被一個或多個替代有機(jī)基團(tuán)掩蔽。此項(xiàng)優(yōu)選特別適用于8位上的L-Orn氨基酸。
因此，本發(fā)明的另一方面，提供了式1的化合物，其中8位上不是L-Orn。
該L-Orn可被D-Orn替代，或被其它天然或非天然氨基酸替代。例如，L-Orn可被天然氨基酸替代，如賴氨酸；或是被掩蔽了的天然氨基酸，如具有一個或多個烷基、苯基或寡亞甲基取代基的精氨酸或賴氨酸，例如N(Me)2，N′(Me)2-Arg，N(Me，Ph)，N′(Me)2-Arg，N(CH2)4，N′(Me)2-Arg，N(CH2)4，N′(CH2)4-Arg，Nε(Me)3-Lys。
該L-Orn可被掩蔽。例如，L-Orn的氨基可含有取代基，尤其是烷基取代基，其可被進(jìn)一步取代，尤其是被雜環(huán)基團(tuán)取代，例如Nδ(CHN(CH2)4，N′(CH2)4)-Orn；或更復(fù)雜的取代基如生物素鳥氨酸或Orn(NδTfa)。
環(huán)上氨基酸
本發(fā)明其它優(yōu)選的化合物包括式1的那些化合物，其中環(huán)鏈上的一個或多個氨基酸被其它天然或非天然氨基酸替代，被有機(jī)基團(tuán)掩蔽或被除去。
特別地，優(yōu)選的化合物包括環(huán)鏈上有1、2或3個替代氨基酸的化合物。
特別優(yōu)選的是式1的那些化合物，其中一個或多個氨基酸被其它天然或非天然氨基酸替代，和/或被有機(jī)基團(tuán)掩蔽。此項(xiàng)優(yōu)選特別適用于3位上的L-Phe氨基酸。
因此，從本發(fā)明的一方面，提供了式1的化合物，其中3位上的L-Phe被替代或掩蔽。
該L-Phe可被D-PHe替代，或被另外的天然或非天然氨基酸替代。例如，L-Phe可被天然氨基酸替代，如酪氨酸；或是烷基取代的氨基酸，如N-甲基酪氨酸；芳基取代的氨基酸，如2-氨基-3-聯(lián)苯-4-基-丙酸，2-氨基-3-萘-2-基-丙酸或氨苯乙酸；雜環(huán)基取代的氨基酸，如2-氨基-3-噻吩-2-基-丙酸；或環(huán)狀氨基酸其中氨基是雜環(huán)的一部份，如1，2，3，4-四異喹啉-3-羧酸或八氫異吲哚-1-羧酸。
該L-Phe可被掩蔽。例如，苯環(huán)可被部分或完全飽和，以及被一個或多個取代基取代。苯環(huán)的取代基可被指定，優(yōu)選鹵素或硝基。氨基可有1個或2個取代基，尤其是烷基如甲基，特別是1甲基取代基。
末端?；?br> 除了環(huán)外鏈和/或環(huán)上部分氨基酸的修飾以外，還有環(huán)外鏈上末端酰基修飾的化合物。
例如，該?；砂粋€或多個取代基，特別是芳香族、雜環(huán)或碳環(huán)基團(tuán)，這些基團(tuán)又可含有一個或多個取代基，例如可以是含有一個或多個取代基的苯甲?；?，含有一個或多個取代基的苯烷?；蚴呛幸粋€或多個取代基的肉桂酰基。另外，此末端酰基可以是另外的脂肪酸，典型的是含有3到26個碳原子的飽和或不飽和脂肪酸，更特別是12到20個碳原子。
用于替代式1中末端?；牡湫突鶊F(tuán)包括
-多至26個碳原子并含有一個或多個取代基的直鏈烷?；貏e是選自任選取代的環(huán)烷基如4-甲基環(huán)己基的取代基；烷基，特別是短鏈烷基如甲基；任選取代的芳基，特別是苯基如二氟苯基；鹵素如氟基到全氟基；氧基；氨基；或亞氨基。
-任選取代的苯甲酰基如苯甲?；陨?，p-甲基苯甲酸，p-三氟甲基苯甲酸，胡椒基酰(piperonyloyl)。
-在鏈烯?；?alkenoyl)中優(yōu)選含有兩個碳原子的芳鏈烯?；?，特別是肉桂?；鏿-三氟甲基肉桂?；?。
而且，此?；杀黄渌；娲?，優(yōu)選式R′CO-。R’如所定義的并適于是烷基，鏈烯基，芳基，雜環(huán)基，或碳環(huán)基，而且其自身可被替代。
最后，還有環(huán)外鏈脂肪酸上有獨(dú)特修飾的化合物，提供5-甲基己基末端基團(tuán)。
組合的變化
在環(huán)外氨基酸，環(huán)上氨基酸和末端酰基上的可能變化可以組合進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的其它優(yōu)選的化合物是式1的那些化合物，其中環(huán)外鏈上一個或多個氨基酸和/或環(huán)狀部分一個或多個氨基酸被修飾，如上所述，和/或末端?；恍揎?。
8位上L-Orn被替代或掩蔽的化合物可接受其它優(yōu)選的修飾，包括側(cè)鏈末端基團(tuán)上的4(S)-甲基己基或其它基團(tuán)。
3位上L-Phe被替代或掩蔽的化合物可接受其它優(yōu)選的修飾，包括側(cè)鏈末端基團(tuán)上的4(S)-甲基己基或其它基團(tuán)。
取代基的實(shí)例包括C1-C18烷基，C2-C18鏈烯基，C2-C18炔基，芳基，雜環(huán)基團(tuán)，OR′，SR′，SOR′，SO2R’，NO2，NHR′，N(R′)2，NHCOR′，N(COR′)2，NHSO2R′，CN，鹵素，C(＝O)R′，CO2R′，OC(＝O)R′，其中每個R′基團(tuán)都獨(dú)立選自H，OH，NO2，NH2，SH，CN，鹵素，C(＝O)H，C(＝O)烷基，CO2H，取代的或未取代的C1-C18烷基，取代的或未取代的C1-C18鏈烯基，取代的或未取代的C1-C18炔基，和取代的或未取代的芳基。本發(fā)明的化合物中合適的鹵素取代基包括F，Cl，Br和I。
烷基基團(tuán)含有飽和的線性或支化的烴基，包括，例如，甲基，乙基，異丙基，異丁基，t-丁基，庚基，十二烷基，十八烷基，戊基，2-乙基己基，2-甲基丁基，5-甲基己基，9-甲基-3-癸基等，特別是含有單分支甲基的烷基。合適的烷基是長鏈的并含有1至20個碳原子，更典型地1至15或1至10個碳原子，或者是短鏈的含有1至6個或1至3個碳原子。長碳鏈?zhǔn)怯糜谀┒酥舅峄鶊F(tuán)的候選者。
本發(fā)明的化合物中優(yōu)選的鏈烯基和炔基含有一個或多個不飽和鍵并含2至12個碳原子，更優(yōu)選地是2至8個碳原子，還更優(yōu)選的是2至6個碳原子，甚至更優(yōu)選的是2、3或4個碳原子。此處所用術(shù)語鏈烯基和炔基指環(huán)狀和非環(huán)狀基團(tuán)，盡管直鏈的或支化的非環(huán)狀基團(tuán)通常更為優(yōu)選。在通常意義上，我們在鏈烯基中包括了亞烷基，它們都是含雙鍵的取代基。
本發(fā)明的化合物中合適的芳基包括單環(huán)和多環(huán)化合物，包括含有分離的和/或稠合的芳基的多環(huán)化合物。典型的芳基含有1至3個分離的或稠合的環(huán)和6至大約18個碳環(huán)原子。特別優(yōu)選的芳基包括取代的或未取代的苯基，萘基，聯(lián)苯，菲基和葸基。
合適的?；ê?至約12個碳原子，更優(yōu)選地2至約8個碳原子，還更優(yōu)選2至約6個碳原子，甚至更優(yōu)選2個碳原子的烷酰基。其它的?；ㄦ溝；?，炔?；?，芳?；s環(huán)?；?。
合適的雜環(huán)基包括雜環(huán)芳基和雜脂環(huán)基。本發(fā)明的化合物中合適的雜環(huán)芳基含有一個、兩個或三個選自N、O或S原子的雜原子并包括，例如，包括8-香豆素基的香豆素基(coumarinyl)，包括8-喹啉基的喹啉基，吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，呋喃基，吡咯基，噻吩基，噻唑基，噁唑基，咪唑基，吲哚基，苯并呋喃基和苯并噻唑基。本發(fā)明的化合物中合適的雜脂環(huán)基含有一個、兩個或三個選自N、O或S原子的雜原子并包括，例如，四氫呋喃基，四氫吡喃基，哌啶基，嗎啉代，pyrrolindinyl。
上述基團(tuán)可在一個或多個可用位置上被一個或多個取代基取代。
天然氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，組氨酸和羥脯氨酸。
我們還涉及WO 0158934，其所有內(nèi)容已合并于此作為參考。那篇早期的文章給出了可適用于本發(fā)明的化合物的指導(dǎo)，我們引入其定義用于本發(fā)明的化合物。
在下面對氨基酸的描述和對肽的表示中用到的縮寫遵循IUPAC-IUB生化命名委員會(Commission of Biochemical Nomenclature)發(fā)布于J.Biol.Chem.，1972，247，977-983的原則。
使用下述另外的縮寫
除非特別聲明，氨基酸符號指L-構(gòu)型。
本發(fā)明的化合物的例子包括式1的化合物其中有
-Glu或Lys代替了8位的L-Orn；
-Gly，Phe，Ala，Leu，D-Val，Pro，Gln，Orn，Thr或Glu代替了11位的L-Val；
-Val或D-Thr代替了12位的L-Thr；
-Gly，D-Ala，D-Leu，D-Phe，D-Pro，Val，D-Glu，D-Gln或D-Thr代替了13位的D-Val；
-hCh代替了11位的L-Val和/或D-Cha代替了13位的D-Val；
-Ala，Gly，Leu，Pro，Glu，Orn或Gln代替了12位的L-Thr以及13位的氨基酸缺失。
-D-Ile或D-Val代替了7位的D-allo-Ile；
-D-Orn代替了8位的L-Orn和L-Pro代替了9位的D-Pro；
-D-Cys代替了7位的D-allo-Ile和L-Cys代替了11位的L-Val；或
-D-Cys或D-homo-Cys代替了7位的D-allo-Ile和D-Cys或D-homo-Cys代替了10位的D-Val。
-Icos，(c/t)-4-Me-cHexa，Und，(4R)-MeHex，(4RS)-MeHex，(4S)-MeHex，Oct，p-MeBza，Bza，p-CF3Bza，3，5-dFPhAc，Pipe，p-CF3Cinn，p-CF3PhAc，Pfh，6-OHep，6，6-dFHep，4-GuBut，AM，AO或C(＝N(CH3)2)代替了14位的5-MeHex，而且，任選地，Lys代替了8位的L-Orn；
-Pro，D-Pip，D-Tic或(5R)-Ph-Pro代替了9位的D-Pro和(4S)-MeHex代替了14位的5-MeHex；
-N(Me)2，N’(Me)2-Arg，N(Me，Ph)，N’(Me)2-Arg，N(CH2)4，N’(Me)2-Arg，N(CH2)4，N’(CH2)4-Arg，Nδ(CHN(CH2)4，N’(CH2)4-Orn，Nε(Me)3-Lys，Orn(NδTfa)或Orn(Biot)代替了8位的L-Orn，和，任選地(4S)-MeHex代替了14位的5-MeHex和，任選地，Thr(OTfa)代替了12位的L-Thr；
-Thr(OTfa)代替了12位的L-Thr和(4S)-MeHex或Lit(OTfa)代替了14位的5-MeHex；
-N-(Hep)2-D-Val代替了13位的D-Val和14位上有5-MeHex缺失；或
-11、12和13位上氨基酸缺失，和，任選地，Mst代替了14位的5-MeHex；
-Dha或E-Dhb代替了2位的Z-Dhb；
-D，L-Ser，Gly或Aib代替了2位的Thr，成為氫化類似物；
-D-Val代替了1位的L-Val；
-D-Trp代替了3位的L-Phe；或
-D-Thr或D-Ser代替了6位的D-alo-Thr；
-hCh，Phe(3，4-Cl2)，Phe(F5)，Phe(4-I)，Phe(4-NO2)，Phe(4-F)，Tyr(Me)，Thi，Tic，Tyr，Oic，NMePhe，Phe(2-Cl)，Phe(3-Cl)，Phe(4-Cl)，Phe(3，4-F2)，NaI，Bip或Phg代替了3位的L-Phe，和，任選地，(4S)-MeHex或p-CF3Cinn代替了14位的5-MeHex；
-D-Val或D-Cha代替了5位和7位的D-alo-Ile和，任選地，D-Cha代替了4位的D-Val；或
-D-Val代替了1位的L-Val，D-Phe代替了3位的L-Phe，Val代替了4位的D-Val，L-alo-Ile代替了5位的D-alo-Ile，L-alo-Thr代替了6位的D-alo-Thr，L-alo-Ile代替了7位的D-alo-Ile，D-Orn代替了8位的L-Orn，L-Pro代替了9位的D-Pro，L-Val代替了10位的D-Val，D-Val代替了11位的L-Val，D-Thr代替了12位的L-Thr和L-Val代替了13位的D-Val。
適當(dāng)?shù)?，這些建議的變化可組合進(jìn)行。
本發(fā)明還包括其藥用鹽、前藥、互變異構(gòu)體及溶劑化物。
本發(fā)明的化合物具有不對稱中心并因此存在不同的對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體形式。本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物的所有旋光異構(gòu)體和立體異構(gòu)體及其混合物的應(yīng)用，和涉及可以使用或含有它們的所有藥物組合物和治療方法。
本發(fā)明的化合物可以是作為自由化合物或作為溶劑化物(例如水合物)的晶體形式，認(rèn)為兩種形式均在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。溶劑化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物，以及其藥用鹽，其中一個或多個氫原子，碳原子或其它原子被其同位素所替代。這樣的化合物可用作藥代動力學(xué)研究及結(jié)合測定中的研究和診斷工具。
如本文所用，本發(fā)明的化合物，包括式1的化合物，定義為包括其藥用衍生物或其前藥。“藥用衍生物或前藥”指任何藥用鹽，酯，酯鹽或本發(fā)明化合物的其它衍生物，其經(jīng)施用于受體后能提供(直接或間接)本發(fā)明的化合物或其代謝物或殘余物。尤其適宜的衍生物和前藥是那些當(dāng)將這些化合物施用于患者后有下列效應(yīng)的物質(zhì)增加本發(fā)明化合物的生物利用度(如，通過口服施用化合物以便更容易吸收入血)，增強(qiáng)母體化合物向給定生物隔室的傳遞，增加了溶解度以能夠通過注射給藥，改變代謝或改變分泌速率。
本發(fā)明化合物的鹽可以包含式1或2化合物中衍生自氮的酸式加成鹽。治療活性在于衍生于本文定義的本發(fā)明化合物的部分，其它組分的特性較不重要，盡管出于治療和預(yù)防目的其優(yōu)選對于患者來說是藥學(xué)可接受的。藥用酸式加成鹽的例子包括衍生于無機(jī)酸和有機(jī)酸的那些，所述無機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，磷酸，偏磷酸，硝酸和硫酸，所述有機(jī)酸如酒石酸，乙酸，三氟乙酸，檸檬酸，蘋果酸，乳酸，富馬酸，苯甲酸，乙醇酸，葡萄糖酸，琥珀酸和甲磺酸及芳基磺酸，如對甲苯磺酸。優(yōu)選的鹽包括三氟乙酸鹽和鹽酸鹽。
本發(fā)明化合物可依據(jù)WO 01 58934所述的合成方法制備，或依據(jù)本文所述的改善了的方法制備。因此本發(fā)明還包括依照式1的化合物的制備方法。
Kahalalide F及其類似物更經(jīng)濟(jì)和安全地合成的優(yōu)化了的方法中的關(guān)鍵步驟是(i)在0.5mmol/g初始載量下部分結(jié)合Fmoc-D-Val-OH于氯三苯甲基氯(chlorotritylchloro)-聚苯乙烯樹脂；(ii)在接下來結(jié)合保護(hù)氨基酸和脂肪族羧酸中用DIPCDI-HOBt偶聯(lián)法代替了HATU-DIPEA；(iii)DIPCDI/HOBt/DIPEA在CH2Cl2中的環(huán)化步驟；這些條件避免了兩個副反應(yīng)纈氨酸殘基的差向異構(gòu)化，這包含于激活中，和Phe或其替代者的三氟乙酸化；(iv)在除去Alloc后使用二乙基-二硫代氨基甲酸鈉以避免終產(chǎn)物中Pd(0)的存在。
此合成優(yōu)選為固相合成方法。
本發(fā)明的合成方法的優(yōu)選實(shí)施方案詳述于方案1，該方案涉及目標(biāo)化合物的形成。
方案1
如方案1所示，kahalalide F類似物的合成形式優(yōu)選的方法是基于固相方法，例子參見Lloyd-Williams，P.等，Chemical Approaches to the Synthesisof Peptides and Proteins；CRC Press，Boca Raton(FL)，1997及其后已有描述的為制備kahalalide F而對該方法的修飾(WO01 58934)。
方案1的方法包括下列連續(xù)的步驟
(a)將Fmoc-DVal-OH結(jié)合到氯三苯甲基氯樹脂上，形成酯鍵。
(b)采取Fmoc/tBu策略將用3個氨基酸[DaIle，DaThr(自由OH)，DaIle]延長肽鏈；
(c)采取Alloc/tBu策略結(jié)合[Val(1)]；
(d)采取Fmoc/tBu策略用余下的氨基酸和脂肪族羧酸延長肽鏈；
(e1)結(jié)合二肽Alloc-Phe-ZDhb-OH，其已在溶液中被合并(combined)并脫水。
(e2a)用兩個氨基酸優(yōu)選Thr和Phe延長肽鏈。Thr的OH是未被保護(hù)的并且Phe或其替代者的氨基被Fmoc保護(hù)或優(yōu)選被Alloc保護(hù)；在某些情況下如果其被Fmoc保護(hù)，這個Fmoc被去除并在固相上引入Alloc；
(e2b)在固相脫水以生成二脫氫肽(didehydropeptide)；
(f)當(dāng)肽仍然錨定于固相載體上時，去除Phe或其替代者的Alloc/Fmoc基團(tuán)。
(g)從固相載體上切下側(cè)鏈被保護(hù)的肽；
(h)在溶液中環(huán)化肽；
(i)去除TFA不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；
(j)在液相中對官能團(tuán)的進(jìn)一步修飾；
所以此方法可如下進(jìn)行
Fmoc-DVal-OH優(yōu)選地被結(jié)合于氯三苯甲基聚苯乙烯樹脂，參見Barlos，K.；Gatos，D.；Schfer，W.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1991，30，590-593，在DIPEA存在下保持約0.5mmol/g的取代水平。使用更高的載量會給終產(chǎn)物中帶來末端化(terminated)的肽，參見Chiva，C.；Vilaseca，M.；Giralt，E.；Albericio，F(xiàn).J.Pept.Sci.1999，5，131-140。
除非特別聲明，所有的溶劑比例為體積/體積。
Fmoc基團(tuán)的去除可采用哌啶-DMF進(jìn)行(2∶8，v/v)(1×2min，2×10min)。Fmoc-aa-OH(4-5當(dāng)量)和14位上酸的偶聯(lián)可采用DIPCDI-HOBt(相對于羧酸成分每個等摩爾量)或PyBOP-DIPEA(等摩爾量的PyBOP和雙倍量的DIPEA)在DMF或DMF-甲苯(1∶1)中進(jìn)行90分鐘。偶聯(lián)之后進(jìn)行茚三酮或氯醌檢測且如果檢測呈陽性則在相同條件下重復(fù)偶聯(lián)，否則方法繼續(xù)進(jìn)行。在去保護(hù)、偶聯(lián)和再次去保護(hù)步驟之間的沖洗可采用DMF(5×0.5min)和CH2Cl2(5×0.5min)進(jìn)行，使用例如每次10mL溶劑/g樹脂。
Alloc-Val-OH(5當(dāng)量)的結(jié)合可采用等摩爾量的DIPCDI和10％的DMAP進(jìn)行。本次偶聯(lián)至少重復(fù)兩次。
Alloc基團(tuán)的去除可用Pd(PPh3)4(0.1當(dāng)量)在PhSiH3(10當(dāng)量)存在下進(jìn)行，參見Gómez-Martínez，P.；Thieriet，N.；Albericio，F(xiàn).；Guibé，F(xiàn).J.Chem.Soc.Perkin I 1999，2871-2874，用二乙基二硫代氨基甲酸鈉在DMF 0.02M中洗滌樹脂(3×15min)。
二肽Alloc-Phe-ZDhb-OH(4當(dāng)量)，其在溶液中從Alloc-Phe-OH和H-Thr-OtBu用EDC·HCl制備，并接著脫水和用TFA處理，該二肽可用DIPCDI-HOAt(各4當(dāng)量)偶聯(lián)5小時至過夜。使用基于HOBt的其它偶聯(lián)劑，如HBTU或DIPCDI-HOBt，導(dǎo)致二肽的不完全結(jié)合。
脫水可在固相中進(jìn)行，用EDC·HCl(水溶性碳二亞胺，20當(dāng)量)在CH2Cl2-DMF(9∶1)中CuCl(12當(dāng)量)存在下處理7天。EDC·HCl/CuCl已被應(yīng)用于在溶液中乳酸菌肽(Nisin)片段中Thr殘基的脫水(Fukase，K.；Kitazawa，M.；Sano，A.；Shimbo，K.；Horimoto，S.；Fujita，H.；Kubo，A.；Wakamiya，T.；Shibe，A.Bull.Chem.Soc.Jpn.1992，65，2227-2240)和在固相中從Thr、Ser和苯基絲氨酸中制備二脫氫肽(Royo，M.；Jiménez，J.C.；López-Macià，A.；Giralt，E.；Albericio，F(xiàn).Eur.J.Org.Chem.2001，45-48)。
從樹脂上切下被保護(hù)的肽可通過TFA-CH2Cl2(1∶99)完成(5×30秒)。
環(huán)化步驟可用DIPCDI/HOBt/DIPEA在CH2Cl2中進(jìn)行。這些條件避免了兩個副反應(yīng)纈氨酸殘基的差向異構(gòu)化，這包含于激活中，和Phe或其替代者的三氟乙酸化；
最后的去保護(hù)可采用TFA-H2O(95∶5)處理1小時進(jìn)行。
請認(rèn)識到保護(hù)基團(tuán)的具體選擇并不苛刻，其它選擇廣泛可用。例如，Bzl類基團(tuán)可替代tBu/Boc；Boc代替Fmoc；Fmoc代替Alloc；Wang樹脂代替氯三苯甲基。
合成的進(jìn)一步細(xì)節(jié)在實(shí)施例中給出。
本發(fā)明的制備方法可由初始原料以立體對映的或立體控制的且快速的方式進(jìn)行，利用固相合成方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，其中構(gòu)建中的分子在整個合成操作中都與不溶性載體相結(jié)合。
本發(fā)明化合物的藥物制劑可適合任何適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥，例如通過口服(包括頰或舌下)，直腸，鼻腔，局部(包括頰，舌下或經(jīng)皮)，陰道或非腸道(包括皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑。這些制劑可通過藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法制備，如將載體或賦形劑與活性成分相聯(lián)。
本發(fā)明化合物的優(yōu)選藥物組合物包括具有適用于靜脈給藥的適當(dāng)組成的液體(溶液，混懸劑或乳劑)，它們可含有純的化合物或結(jié)合有任何載體或其它藥物活性的化合物。關(guān)于藥劑組合物的進(jìn)一步指導(dǎo)可見于WO 0236145，其所有內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。
因此，非離子型表面活性劑和有機(jī)酸的組合與填充劑一起適用于提供本發(fā)明化合物的凍干形式，其適合重構(gòu)(reconstitution)。重構(gòu)優(yōu)選通過乳化加溶劑，鏈烷醇和水來實(shí)現(xiàn)。
凍干組合物優(yōu)選主要含有填充劑，如至少90％或至少95％的填充劑。填充劑的實(shí)例眾所周知且包括蔗糖和甘露醇。也可使用其它填充劑。
凍干組合物中的非離子型表面活性劑優(yōu)選脫水山梨糖醇酯，更優(yōu)選聚乙烯脫水山梨糖醇酯，如聚氧乙烯山梨糖醇酐烷酸酯，特別是聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯，例如polysorbate 80。非離子型表面活性劑典型地構(gòu)成(comprise)組合物的一定百分比，如組合物的0到5％，例如組合物的2到3或4％。
凍干組合物中的有機(jī)酸典型地是脂族酸，優(yōu)選羥基羧酸，更優(yōu)選羥基多羧酸，特別是檸檬酸。有機(jī)酸典型地構(gòu)成組合物的一定百分比，如組合物的0到5％，例如組合物的2到3或4％。
本發(fā)明化合物在凍干組合物中的量典型地小于混合物的1％，或經(jīng)常小于0.1％。合適的量在50到200μg，比如每100mg組合物中有大約100μg。
重構(gòu)劑的乳化加溶劑適當(dāng)?shù)睾芯垡蚁┮叶减ィ貏e是脂肪酸酯，更優(yōu)選的是PEG油酸酯如PEG-35油酸酯。乳化加溶劑適當(dāng)?shù)貫橹貥?gòu)劑的0到10％，典型地約3到7％，比如約5％。鏈烷醇通常是乙醇，適當(dāng)?shù)貫橹貥?gòu)劑的0到10％，典型地約3到7％，比如約5％。重構(gòu)劑的其余部分是水，提供適于靜脈注射的重構(gòu)溶液。
用0.9％鹽水進(jìn)一步稀釋重構(gòu)的溶液將適于kahalalide化合物的輸注。適宜的輸注設(shè)備優(yōu)選包括玻璃容器而不是聚乙烯容器。導(dǎo)管宜用硅氧烷導(dǎo)管。
然后優(yōu)選的重構(gòu)劑含有2到7％，比如約5％的乳化加溶劑，2到7％，比如約5％的醇，以及剩余的水。
制劑可以單劑量或多劑量容器給出，例如密封的安瓿或小瓶，并存放于(冰凍-干燥)凍干條件下，使用前只需立即加入消毒過的液體載體，例如注射用水。
本發(fā)明另外提供包含獨(dú)立容器的試劑盒，所述容器含有凍干組合物和重構(gòu)劑。還提供重構(gòu)方法。
本發(fā)明的化合物或組合物的給藥可以通過靜脈輸注進(jìn)行。輸注時間可達(dá)72小時，更優(yōu)選的是1到24小時，最優(yōu)選約1或約3小時。輸注時間短到在醫(yī)院不過夜而能進(jìn)行治療就十分理想。然而，如果需要的話輸注時間將會在24小時左右或甚至更長。
給藥按周期進(jìn)行，在優(yōu)選應(yīng)用方法中，在每個周期的第一周將本發(fā)明化合物靜脈輸注提供給患者，允許患者在周期剩余部分中恢復(fù)。每個周期優(yōu)選的持續(xù)時間是1，3或4周；如果需要可以提供多個周期。在備選的劑量給藥方案中，本發(fā)明的化合物每3周連續(xù)施用5天，每天約1小時。其它方案可根據(jù)變化設(shè)計。
根據(jù)患者個體對治療的耐受性需要時可延遲劑量和/或減少劑量并調(diào)整用藥計劃，特別是對肝轉(zhuǎn)氨酶或堿性磷酸酶高于正常血清水平的患者建議減少劑量。
從一個方面說，本發(fā)明提供了一種對患有癌癥的人患者的治療方法，包含對所述患者施用本發(fā)明的化合物，劑量低于1200mcg/m2/天，優(yōu)選低于930mcg/m2/天且更優(yōu)選低于800mcg/m2/天。適宜的劑量最少為320mcg/m2/天。優(yōu)選的劑量在400-900mcg/m2/天范圍內(nèi)，優(yōu)選在500-800mcg/m2/天，更優(yōu)選在600-750mcg/m2/天。特別優(yōu)選的是約650-700mcg/m2/天的劑量。
另一方面本發(fā)明提供了一種對患有癌癥的人患者的治療方法，包含對所述患者施用本發(fā)明的化合物，在5天內(nèi)每天施用，劑量低于930mcg/m2/天，隨后休息1到4周，其間不施用kahalalide化合物。劑量優(yōu)選在650-750mcg/m2/天，更優(yōu)選在約700mcg/m2/天。輸注時間優(yōu)選在1到24小時之間，更優(yōu)選在1到3小時之間。特別優(yōu)選的輸注時間為大約1或約3小時。休息時間優(yōu)選為2-3周，更優(yōu)選大約2周。
本發(fā)明還提供了一種對患有癌癥的人患者的治療方法，包含對所述患者施用本發(fā)明的化合物，每周一次，劑量低于800mcg/m2/天。該劑量優(yōu)選為600-700mcg/m2/天，更優(yōu)選650mcg/m2/天。輸注時間優(yōu)選在1到24小時之間，更優(yōu)選在1到3小時之間。
盡管上文給出了關(guān)于劑量的指導(dǎo)，正確的化合物劑量將依具體的制劑，施用方式及具體的部位、宿主和治療的腫瘤而變化。其它因素如年齡，體重，性別，飲食，給藥時間，分泌速率，宿主狀況，藥物組合，反應(yīng)靈敏性和病情嚴(yán)重性都要考慮。在最大耐受劑量內(nèi)可連續(xù)用藥或周期性用藥。
本發(fā)明特別涉及對前列腺癌，乳腺癌，肝細(xì)胞癌，黑素瘤，結(jié)直腸癌，腎癌，卵巢癌，NSCL癌，上皮癌，胰腺癌及過表達(dá)Her2/neu癌基因的腫瘤患者的治療。更優(yōu)選地本發(fā)明涉及對肝細(xì)胞癌，黑素瘤，乳腺癌，胰腺癌和前列腺癌的治療方法。
本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動物中與真皮細(xì)胞過度增殖有關(guān)的疾病的方法，包含對該哺乳動物施用有效的、無毒性量的本發(fā)明的化合物。所述皮膚病優(yōu)選銀屑病。本發(fā)明優(yōu)選涉及對患有銀屑病，特別是嚴(yán)重銀屑病的人患者的治療。
本發(fā)明化合物和組合物可與其它藥物共用以提供聯(lián)合治療。其它藥物可形成同一組合物的一部分，或作為獨(dú)立的組合物提供在同一時間或不同時間施用。對其它藥物的特性沒有特別的限制，盡管與其它化療、激素或抗體藥劑的結(jié)合要予以關(guān)注。本發(fā)明化合物和其它藥物活性試劑或藥劑的量以及相對用藥時間要進(jìn)行選擇以獲得期望的聯(lián)合治療效果。
實(shí)施例
一般方法
Cl-TrtCl-樹脂、被保護(hù)的Fmoc-氨基酸衍生物、HOBt、HOAt來自ABI(Framingham，MA)，Bachem(Bubendorf，瑞士)，NovaBiochem(Lufelfingen，瑞士)，4-MeHex衍生物來自Narchem，HATU和其它胍基化(guanidylation)衍生物來自ABI(Framingham，MA)或其制備依據(jù)delFresno，M.；El-Faham，A.；Carpino，L.A.；Royo，M.；Albericio，F(xiàn).OrganicLett.，2000，2，3539-3542。
Alloc-氨基酸基本依據(jù)Dangles等的描述制備，參見Dangles，O.；Guibé，F(xiàn).；Balavoine，G.；Lavielle，S.；Marquet.A.J.Org.Chem.l987，52，4984-4993，和Alloc-Z-Dhb-Phe-OH和Kahalalide F依據(jù)WO 01 58934中的描述制備，DIPEA、DIPCDI、EDC·HCl、哌啶、TFA來自Aldrich(Milwaukee，WI)。DMF和CH2Cl2來自SDS(Peypin，法國)。乙腈(HPLC級)來自Scharlau(Barcelona，西班牙)。除CH2Cl2外所有商品試劑和溶劑均在收到后直接使用，CH2Cl2則被通過氧化鋁柱以去除酸性污染物。
固相合成在裝有聚乙烯多孔盤(disc)的聚丙烯注射器(10-50mL)內(nèi)進(jìn)行。溶劑和可溶性試劑通過抽吸去除。Fmoc基團(tuán)的去除用哌啶-DMF(2∶8，v/v)(1×2min，2×10min)完成。去保護(hù)、偶聯(lián)和再一次去保護(hù)步驟之間的洗滌用DMF(5×0.5min)和CH2Cl2(5×0.5min)完成，每次使用10mL溶劑/g樹脂。肽合成轉(zhuǎn)化和洗滌在25℃進(jìn)行。固相上進(jìn)行的合成通過中間產(chǎn)物的HPLC分析進(jìn)行控制，中間產(chǎn)物通過用TFA-H2O(1∶99)切一份(約2mg)肽基樹脂1分鐘而得到。HPLC反相柱[Nucleosil-C18 4,6×250mm，10μm(柱A)；Nucleosil-C4 4,6×250mm，10μm(柱B)來自Sharlau(西班牙)；SymmetryTM C18 4,6×150mm，5μm(柱C)；Symmetry300TM C18 4,6×50mm，5μm(柱D)來自Waters(愛爾蘭)；Zorbax SB C18 4,6×150mm，3.5μm(柱E)來自Agilent(美國)]。分析性HPLC用Water儀器和Agilent 1100儀器完成，Water儀器配有兩個溶劑傳輸泵(Waters 1525)、自動注射器(Waters717自動進(jìn)樣器)、雙波長檢測器(Waters 2487)和系統(tǒng)控制器(BreezeV3.20)，Agilent 1100儀器配有兩個溶劑傳輸泵(G1311A)、自動注射器(G1329A)、DAD(G1315B)。UV檢測在215或220nm處進(jìn)行，在H2O(+0.045％TFA)中線性梯度的CH3CN(+0.036％TFA)運(yùn)行于下列條件
表I
肽樣品的MALDI-TOF和ES-MS的分析使用PerSeptive BiosystemsVoyager DE RP，(其用DHB基質(zhì))，Waters Micromass ZQ分光計和AgilentIon Trap 1100系列LC/MSD Trap。肽-樹脂樣品在12N的HCl-丙酸(1∶1)水溶液中155℃水解1-3小時，無肽樣品在6N的HCl水溶液中155℃水解1小時。隨后的氨基酸分析在Beckman System 6300自動分析儀上進(jìn)行。1H-NMR光譜分析[1H，NOESY，TOCSY在(278K)]在Varian Unity Plus(500MHz)上進(jìn)行。化學(xué)位移(δ)表示為來自TMS每百萬低磁場的部分?jǐn)?shù)(partsper million downfield from TMS)。偶聯(lián)常數(shù)表示為赫茲。
類似物名稱的命名相對于式(I)的Kahalalide F的5-甲基己基異構(gòu)體，在方括號內(nèi)表明修飾的殘基；下標(biāo)″no″表示從序列上去除天然殘基。
實(shí)施例1
(4S)-MeHex-D-Val-ThrVal-D-Val-D-Pro-Om-D-allo-Ile-cyclo[D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-(Z)Dhb-Val]，[(4S)-MeHex14]-Kahalalide F(化合物1)
步驟1
H-D-Val-O-TrtCl-樹脂。
Cl-TrtCl-樹脂(1g，1.64mmol/g)置于裝有聚乙烯濾器盤(filter disk)的20mL聚丙烯注射器內(nèi)。然后用CH2Cl2洗滌樹脂(5×0.5min)，加入Fmoc-D-Val-OH(238mg，0.7mmol，0.7當(dāng)量)和DIPEA(0.41mL)的CH2Cl2(2.5mL)溶液，將混合物攪拌15分鐘，當(dāng)加入超量DIPEA(0.81mL，共7當(dāng)量，7mmol)時將混合物攪拌45分鐘。攪拌10分鐘后，反應(yīng)通過加入MeOH(800μL)而終止。用CH2Cl2(3×0.5min)，DMF(3×0.5min)，哌啶(按一般方法中的說明)和DMF(5×0.5min)對Fmoc-D-Val-O-TrtCl-樹脂進(jìn)行隨后的洗滌/處理。根據(jù)Fmoc測定計算的載量是0.50mmol/g。
步驟2
Fmoc-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂.
用DIPCDI(310μL，2mmol，4當(dāng)量)和HOBt(307mg，2mmol，4當(dāng)量)的DMF(2.5mL)溶液將Fmoc-D-allo-Ile-OH(707mg，2mmol，4當(dāng)量)、Fmoc-D-allo-Thr-OH(游離羥基)(683mg，2mmol，4當(dāng)量)和Fmoc-D-allo-Ile-OH(707mg，2mmol，4當(dāng)量)依次加入到如上得到的H-D-Val-O-TrtCl-樹脂中。在所有情況下，90分鐘的偶聯(lián)之后，茚三酮反應(yīng)為陰性。按一般方法中的描述去除Fmoc基團(tuán)并洗滌。在DMAP(30.6mg，0.25mmol，0.5當(dāng)量)和DIPEA(88μL，0.5mmol，1當(dāng)量)存在下將Alloc-Val-OH(502mg，2.5mmol，5當(dāng)量)和DIPCDI(387mg，2.5mmol，5當(dāng)量)偶聯(lián)45min。在相同條件下重復(fù)此偶聯(lián)兩次。用TFA處理一份肽基-樹脂，對蒸發(fā)后所得粗產(chǎn)物的HPLC分析(tR 7.8min，條件S，柱D)顯示純度＞98％。ESMS，C45H63N5O11計算值，849.45。實(shí)驗(yàn)值m/z850.1[M+H]+。
步驟3
Fmoc-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂。
去除Fmoc基團(tuán)，用DIPCDI(310μL，對于2.0mmol和4當(dāng)量；388μL，對于2.5mmol，5當(dāng)量)和HOBt(307mg，對于2.0mmol和4當(dāng)量；395mg，2.5mmol，5當(dāng)量)將Fmoc-Orn(Boc)-OH(912mg，2mmol，4當(dāng)量)、Fmoc-D-Pro-OH(843mg，2.5mmol，5當(dāng)量)和Fmoc-D-Val-OH(255mg，2.5mmol，5當(dāng)量)依次加入到上述肽基-樹脂(步驟2)中90分鐘。結(jié)合Orn和D-Pro后的茚三酮檢測為陰性。結(jié)合D-Val后的氯醌檢測呈弱陽性，因此用Fmoc-D-Val-OH(678mg，2.0mmol，4當(dāng)量)、DIPCDI(310μL，2.0mmol，4當(dāng)量)和HOBt(307mg，2.0mmol，4當(dāng)量)對此殘余物進(jìn)行90分鐘的再偶聯(lián)。用TFA處理一份肽基-樹脂，對蒸發(fā)后所得粗產(chǎn)物的HPLC分析(tR 10.1min，條件S，柱D)顯示純度＞98％。MALDI-TOF-MS，C65H97N9O16計算值，1,259.71。實(shí)驗(yàn)值m/z 1,282.16[M+Na]+。
步驟4
(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂
去除Fmoc基團(tuán)，用DIPCDI(233μL，對于1.5mmol和3當(dāng)量；310μL，對于2mmol和4當(dāng)量；以及388μL，對于2.5mmol，5當(dāng)量)和HOBt(230mg，對于1.5mmol和3當(dāng)量；307mg，對2mmol和4當(dāng)量；及395mg，2.5mmol.5當(dāng)量)將Fmoc-Val-OH(678mg，2mmol，4當(dāng)量)，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH(992mg，2.5mmol，5當(dāng)量)，F(xiàn)moc-D-Val-OH(678mg，2mmol，4當(dāng)量)，和(4S)-MeHex-OH(195mg，1.5mmol，3當(dāng)量)順序加到上述肽基-樹脂(步驟3)中90分鐘。在所有情況下，經(jīng)過90分鐘的偶聯(lián)，茚三酮測試為陰性。Fmoc基團(tuán)的去除及洗滌如一般方法中所述進(jìn)行。
步驟5
(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂
在PhSiH3(617μL，5mmol，10當(dāng)量)存在時在氬氣氣氛中用Pd(PPh3)4(58mg，0.05mmol，0.1當(dāng)量)除去Alloc基團(tuán)，用DMF(1.25mL)溶解Alloc-Phe-Z-Dhb-OH(666mg，2mmol，4當(dāng)量)和HOAt(273mg，2mmol，4當(dāng)量)并加到肽基-樹脂中，然后加入DIPCDI(310μL，2mmol，4當(dāng)量)并攪拌混合物5小時，茚三酮測試呈陰性。用DMF和CH2C12洗滌后將等分部分的肽基-樹脂用TFA-H2O(1∶99)處理1分鐘，產(chǎn)物用MALDI-TOF-MS表征，C88H146N14O21計算值，1,735.08。實(shí)驗(yàn)值m/z 1,758.67[M+Na]+，1,774.62 1,618.2[M+K]+。
步驟6
(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-allo-Ile-D-Val-OH.
DMF和CH2Cl2洗滌后，在PhSiH3(617μL，5mmol，10當(dāng)量)存在時在氬氣氣氛下用Pd(PPh3)4(58mg，0.05mmol，0.1當(dāng)量)去除Alloc基團(tuán)。用TFA-CH2Cl2(1∶99)(5×30秒)從樹脂上裂解被保護(hù)的肽。濾出液用水收集(4mL)并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去部分水分。然后加入ACN溶解除去水分時出現(xiàn)的固體，然后將溶液凍干，生成639mg(387μmol，產(chǎn)率77％)標(biāo)題化合物，用HPLC(條件R，C柱，tR 10.5分鐘)測得純度為＞95％。
步驟7
(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-cyclo(D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)
被保護(hù)的肽(步驟6)(639mg，387μmol)溶于CH2Cl2(390mL，1mM)，HOBt(237mg，1.55mmol)溶于最小體積的DMF以溶解HOBt，加入DIPEA(203μL，1.16mmol，3當(dāng)量)，DIPCDI(240μL，1.55mmol，4當(dāng)量)。攪拌混合物1小時，然后用HPLC檢查環(huán)化步驟的進(jìn)程。減壓蒸發(fā)除去溶劑。用TFA-H2O(19∶1，85mL)溶解被保護(hù)的環(huán)肽并攪拌混合物1小時。減壓蒸發(fā)除去溶劑，加入二噁烷(30mL)并減壓蒸發(fā)除去溶劑(該過程重復(fù)了三次)，然后加入H2O(40mL)并凍干。粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC(Kromasil C8 5μm，205×50mm)純化，用含44％乙腈(+0.05％TFA)的水(+0.05％TFA)等度洗脫，55mL/h，在220nm處檢測，生成標(biāo)題產(chǎn)物(192mg，0.13mmol，產(chǎn)率26％，92.3％)。MALDI-TOF-MS，C75H124N14O1計算值，1,476.93。實(shí)驗(yàn)值m/z1,500.12[M+Na]+，1,515.97[M+K]+。該化合物的1H-NMR(2.5mM；500MHz，H2O-D2O(9∶1))譜見表II。
表II
實(shí)施例2
表III中描述的類似物依實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)步驟合成，除了(步驟)欄所示的步驟以外，該欄所示殘基(A)被另外的殘基(B)替代或被去除(無)。
表III
實(shí)施例3
5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-cyclo[D-allo-Thr-D-alo-Ile-D-Val-hCh-(Z)-Dhb-Val](化合物63)
如實(shí)施例1所述實(shí)驗(yàn)步驟，除了在步驟4中用5-MeHex代替了(4S)-MeHex和步驟5依下述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行
在氬氣氣氛中PhSiH3存在的條件下，用Pd(PPh3)4依上述方法去除來自5-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-alo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-2-Clorotrityl-Ps(250mg，初始載量＝0.5mmol/g樹脂)的Alloc基團(tuán)。用溶于DMF的DIPCDI(96.8mg；0.63mmol；5當(dāng)量)和HOBt(85mg；0.63mmol；5當(dāng)量)將Fmoc-Thr-OH(游離羥基)(213.2mg；0.63mmol；5當(dāng)量)和Fmoc-hCha-OH(254.0mg；0.63mmol，5當(dāng)量)依次加入到上述肽基樹脂中。用DMF充分洗滌后(5×30秒)，用EDC·HCl(479mg；2,5mmol，20當(dāng)量)，CuCl(184mg，1,5mmol，12當(dāng)量)在CH2Cl2-DMF(1∶9)中的溶液處理肽基樹脂6天。用DMF、CH2Cl2、DMF充分洗滌后，繼續(xù)實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)方法以得到KF類似物。
實(shí)施例4
表IV中所述類似物根據(jù)實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)方法合成，除了在步驟4中用5-MeHex代替了(4S)-MeHex；步驟5依實(shí)施例3所述進(jìn)行，但結(jié)合Fmoc-Phe-OH而不是Fmoc-hCh-OH，并且在(步驟)欄所示的步驟中，用其它殘基(B)代替了殘基(A)。在類似物64-66中，未使用脫水反應(yīng)，因?yàn)樵擃愃莆锸菤浠摹?br> 表IV
實(shí)施例5
表V中所述的類似物依實(shí)施例1中所述實(shí)驗(yàn)步驟合成，除了步驟5依實(shí)施例3所述進(jìn)行，并且(步驟)欄所示步驟中殘基(A)被另外的殘基(B)替代。此外，在固相脫水之前，依一般方法中所述去除Fmoc基團(tuán)，然后在DIPEA(5當(dāng)量)存在下以DMF作為溶劑與Allo-OSu(5當(dāng)量)反應(yīng)(2小時)而以Alloc的形式保護(hù)氨基基團(tuán)。
表V
實(shí)施例6-Kahalalide F(化合物89)
將DIPEA(1.73μL；10.17μmol)和HATU(3.86mg；10.15μmol)加入到溶于DMF(5ml)的Kahalalide F(10.0mg；6.76μmol)中。反應(yīng)后進(jìn)行HPLC，4小時后，減壓去除DMF并將殘?jiān)苡贑H3CN-H2O-AcOH(4.5∶4.5∶1，20ml)、凍干并用半制備型HPLC純化以生成標(biāo)題所示的類似物(4.5mg，40％)。
實(shí)施例7-Kahalalide F(化合物90)
實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例6所述，但用HAPyU(4.87mg；10.15μmol)代替了HATU1.63mg，12％。
實(shí)施例8-Kahalalide F(化合物91)
實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例6所述，但用M2A(4.12mg；10.14μmol)代替了HATU5.2mg，46％。
實(shí)施例9-Kahalalide F(化合物92a)和[Nδ(CHN(CH2)4，N′(CH2)4)-Orn8]-Kahalalide F(化合物92b)
實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例6所述，但用BTFFH(含約50％的1，1’-(氟亞甲基)二吡咯烷)(3.16mg；10.16μmol)代替了HATU。得到兩種產(chǎn)物，92a和92b，不可能分離它們(比例為1∶1的4.0mg混合物，35.6％)。
HPLC(條件A，柱A)，tR20.8分鐘(92b)45％和tR20.9分鐘(43a)46％。EM(MALDI-TOF，m/z)(92a)計算值1,627,05；實(shí)驗(yàn)值1,630.8[M+H]+1,652.6[M+Na]+。(43b)計算值1,629.06；實(shí)驗(yàn)值1,632.7[M+H]+1,670.6[M+K]+。
實(shí)施例10-KF(化合物93)
將DIPEA(10μL，58.8μmol)和MeI(6μL，0.100mmol)加入到溶于DMF/DCM(1∶1，5ml)的[Lys8，(4S)-MeHex14]-Kahalalide F(化合物30)(5.0mg；3.35μmol)中。反應(yīng)后進(jìn)行HPLC，12小時后減壓去除溶劑并將殘?jiān)苡贑H3CN-H2O-AcOH(4.5∶4.5∶1，20ml)、凍干并用半制備型HPLC純化以生成標(biāo)題所示類似物(2.2mg，44％)。
實(shí)施例11-Kahalalide F(化合物94)
將[4(S)MeHex14]-Kahalalide F(化合物1；10.0mg；6.7μmol)溶于TFA-DCM(1∶1，20mL)并允許在室溫下攪拌3天。然后，減壓去除溶劑并將殘?jiān)苡贖2O-CH3CN(1∶9)并立即純化以使樣品溶于H2O中的時間最少。與標(biāo)題所示類似物相對應(yīng)的級分收集于浸于液氮中的圓底燒瓶并凍干(2.5mg；25％)
實(shí)施例12-Kahalalide F(化合物95)
將[(4S)-MeHex14]-KF(化合物1；10mg；6.7μmol)溶于DCM(8ml)；加入TFAA(18.9μL；134μmol)和DIPEA(22.8μL；134μmol)并允許反應(yīng)12小時。然后，減壓去除溶劑，重溶于H2O-CH3CN(1∶1)，并立即純化(2.0mg，20％)。
實(shí)施例13-Kahalalide F(化合物96)
如實(shí)施例12所述的實(shí)驗(yàn)步驟，但在純化前將類似物溶于H2O-CH3CN(1∶1)，置于溶液中2小時，然后純化(4,3mg，43％)。
實(shí)施例14-Kahalalide F(化合物97)
如實(shí)施例1所述實(shí)驗(yàn)步驟，除了在步驟4中(4S)-MeHex被Lit-OH替代和步驟7中，將環(huán)狀肽溶于TFA-DCM(1∶1，20ml)并允許室溫下攪拌3天。這之后，從一份(10％)減壓去除溶劑并將固相殘?jiān)苡贖2O-CH3CN(1∶9)后立即純化以使樣品溶于H2O的時間最少。與標(biāo)題所示類似物相對應(yīng)的級分收集于浸于液氮中的圓底燒瓶并凍干(5,6mg；從起始樹脂算起6％的產(chǎn)率)
實(shí)施例15-Kahalalide F(化合物98)
實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例1所述，除了步驟4中，將溶于DMF-AcOH(99∶1；2mL)的heptanaldehyde(60.65μL；0.75mmol；5當(dāng)量)加入至H-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-alo-Thr(Val-Alloc)-D-allo-Ile-D-Val-O-2-Clorotrityl-Ps(300mg；初始載量＝0.5mmol/g樹脂)，5分鐘后加入溶于DMF-AcOH(99∶1；1mL)的NaBH3CN(28.28mg；0.45mmol；3當(dāng)量)，允許混合物反應(yīng)12小時。用HPLC監(jiān)測反應(yīng)將這種處理再重復(fù)2次。
實(shí)施例16-Kahalalide F(化合物99)
將Kahalalide F(150.0mg；94.3μmol)，d-生物素(37.0mg，151.5μmol)和HATU(114.0mg，299.8μmol)在Ar氣氛下溶于無水DCM(6.0ml)并加入NMM(58μl，524.0μmol)。允許攪拌混合物20小時。然后，減壓去除溶劑后將殘?jiān)苡贛eOH并純化。與標(biāo)題所示類似物相對應(yīng)的級分被凍干(74.0mg；43％)。
Kahalalide F類似物的表征
表征示于表VI和VII。表VI中的EM對應(yīng)于MALDI-TOF，精確的質(zhì)量用Chemwind 6.0計算，表VII中的EM對應(yīng)于陽性模式下的APCI。
表VI
表VII
實(shí)施例17
生物學(xué)活性
本發(fā)明的化合物的生物活性由下列表中的結(jié)果證明，這些結(jié)果的獲得依照如下所述方法。
這些測定的最終目的是通過使細(xì)胞持續(xù)與待測樣品接觸以中斷“體外”腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的生長。
細(xì)胞系
一種利用硫代羅丹明B(SRB)反應(yīng)的比色型分析用于定量測量細(xì)胞生長及生存力[根據(jù)Philip Skehan，等(1990)，New colorimetric cytotoxicityassay for anticancer drug screening，J.Natl.Cancer Inst.，821107-1112所述技術(shù)]。
此形式的分析使用直徑9mm的96孔細(xì)胞培養(yǎng)微孔板(Faircloth，1988；Mosmann，1983)。大多數(shù)細(xì)胞系來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，衍生自不同的人癌癥類型。
細(xì)胞維持于RPMI 1640 10％FBS，其中添加0.1g/l青霉素和0.1g/l硫酸鏈霉素，在37℃，5％CO2和98％濕度下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時，用胰蛋白酶消化分匯合的培養(yǎng)物以收獲細(xì)胞并在平板接種前重懸于新鮮培養(yǎng)基中。
細(xì)胞接種于96孔微量滴定板，每孔195μL培養(yǎng)基5×103細(xì)胞，在無藥物培養(yǎng)基中生長18小時使細(xì)胞貼壁。然后加入濃度范圍在10到10-8μg/ml的等分試樣5μL樣品，其溶于DMSO∶EtOH∶PBS(0.5∶0.5∶99)。作用48小時后，用SRB方法檢測抗腫瘤效果細(xì)胞用50μL冷的50％(wt/vol)三氯乙酸(TCA)固定并在4℃下溫育60分鐘。平板用去離子水清洗并干燥。每個微量滴定孔中加入100μL SRB溶液(0，4％wt/vol于1％乙酸中)并于室溫溫育10分鐘。用1％乙酸洗滌除去未結(jié)合的SRB。平板在空氣中干燥后，結(jié)合的染料溶于Tris緩沖液。用自動分光光度平板讀數(shù)器在單波長490nm處讀取光密度值。
計算三個平行樣品孔數(shù)據(jù)的平均+/-SD值。可計算細(xì)胞反應(yīng)的一些參數(shù)GI＝生長抑制，TGI＝總生長抑制(抑制細(xì)胞效應(yīng))和LC＝細(xì)胞殺死(細(xì)胞毒性效應(yīng))
表VIII和IX舉例說明了關(guān)于本發(fā)明化合物的生物活性的數(shù)據(jù)。
表VIII活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
Table VIII(cont)Activity data(Molar)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表VIII(續(xù))活性據(jù)(摩爾)
表IX活性數(shù)據(jù)(摩爾)
表IX活性數(shù)據(jù)(摩爾)
權(quán)利要求
1.一種化合物，其基于kahalalide F結(jié)構(gòu)，該化合物至少在一個方面與kahalalide F不同。
2.依照權(quán)利要求1的化合物，其具有式1
其中一個或多個氨基酸被其它天然或非天然氨基酸替代，被有機(jī)基團(tuán)掩蔽或被去除。
3.依照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其中甲基己酰基基團(tuán)被另外的carboxoyl替代或被去除。
4.依照權(quán)利要求1的化合物，其中環(huán)狀部分中的氨基酸與kahalalide F的不同。
5.依照權(quán)利要求4的化合物，其中3位上的L-Phe被改變。
6.依照權(quán)利要求5的化合物，其中3位上的氨基酸是被掩蔽了的L-Phe。
7.依照權(quán)利要求5的化合物，其中3位上的氨基酸是不同的天然氨基酸或是非天然氨基酸。
8.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的化合物，其中8位上的L-Orn被改變。
9.依照權(quán)利要求8的化合物，其中8位上的氨基酸是被掩蔽了的L-Orn。
10.依照權(quán)利要求5的化合物，其中8位上的氨基酸是不同的天然氨基酸或是非天然氨基酸。
11.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的化合物，其中側(cè)鏈被改變。
12.依照權(quán)利要求11的化合物，其中末端酰基發(fā)生了變化。
13.依照權(quán)利要求12的化合物，其中末端?；?(S)-甲基己基。
14.一種化合物，其基于表示為KF的式1的kahalalide F的結(jié)構(gòu)，其選自[D-Thr6]-KF，[D-Ser6]-KF，[Glu8]-KF，
[Lys8]-KF，[Val12]-KF，[D-Thr12]-KF，[D-Cha13]-KF，[hCh11]-KF，[hCh11，D-Cha13]-KF，[D-Cha4，D-Cha5，D-Cha7]-KF，[D-Val5，D-Val7]-KF，
[Icos14]-KF，[(c/t)-4-Me-cHexa14]-KF，[Und14]-KF，[(4R)-MeHex14]-KF，[(4RS)-MeHex14]-KF，[Oct14]-KF，[p-MeBza14]-KF，[Bza14]-KF，[p-CF3Bza14]-KF，[3，5-dFPhAc14]-KF，[Pipe14]-KF，[p-CF3Cinn14]-KF，[p-CF3PhAc14]-KF，[Ph14]-KF，[6-OHep14]-KF，[6，6-dFHep14]-KF，[4-GuBut14]-KF，[Lys8，(4S)-MeHex14]-KF，[noVal11，noThr12，noD-Val13]-KF，[noVal11，noThr12，noD-Val13，Mst14]-KF，[Gly13]-KF，[D-Ala13]-KF，[D-Leu13]-KF，[D-Phe13]-KF，[D-Pro13]-KF，[Val13]-KF，[D-Glu13]-KF，[D-Gln13]-KF，[D-Thr13]-KF，[Gly11]-KF，[Phe11]-KF，[Ala11]-KF，[Leu11]-KF，[D-Val11]-KF，[Pro11]-KF，[Gln11]-KF，[Orn11]-KF，[Thr11]-KF，[Glu11]-KF，[Ala12，noD-Val13]-KF，[Gly12，noD-Val13]-KF，[Leu12，noD-Val13]-KF，[Pro12，noD-Val13]-KF，[Glu12，noD-Val13]-KF，[Orn12，noD-Val13]-KF，[Gln12，noD-Val13]-KF，[Pro9，(4S)-MeHex14]-KF，[D-Pip9，(4S)-MeHex14]-KF，[D-Tic9，(4S)-MeHex14]-KF，[(5R)-Ph-Pro9，(4S)-MeHex14]-KF，[hCh3]-KF，[D，L-Ser2]-KF，[Gly2]-KF，[Aib2]-KF，[Dha2]-KF，[Trp3]-KF，[D-Val1，D-Phe3，Val4，allo-Ile5，allo-Thr6，allo-Ile7，D-Orn8，Pro9，Val10，D-Val11，D-Thr12，Val13]KF，[Phe(3，4-Cl2)3，(4S)-MeHex14]-KF，[Phe(F5)3，(4S)-MeHex14]-KF，[Phe(4-I)3，(4S)-MeHex14]-KF，[Phe(4-NO2)3，(4S)-MeHex14]-KF，[Phe(4-F)3，(4S)-MeHex14]-KF，[Tyr(Me)3，(4S)-MeHex14]-KF，[Thi3，(4S)-MeHex14]-KF，[Tic3，(4S)-MeHex14]-KF，[Tyr3，(4S)-MeHex14]-KF，[Oic3，(4S)-MeHex14]-KF，[NMePhe3，(4S)-MeHex14]-KF，[Phe(2-Cl)3]-KF，[Phe(3-Cl)3]-KF，[Phe(4-Cl)3]-KF，[Phe(3，4-F2)3]-KF，[NaI3]-KF，[Bip3]-KF，[Phg3]-KF，[Phe(3，4-Cl2)3，p-CF3Cinn14]-KF，[N(Me)2，N’(Me)2-Arg8]-KF，[N(Me，Ph)，N’(Me)2-Arg8]-KF，[N(CH2)4，N’(Me)2-Arg8]-KF，[N(CH2)4，N’(CH2)4-Arg8]-KF，[Nδ(CHN(CH2)4-N’(CH2)4)-Orn8]-KF，[Nε(Me)3-Lys8，(4S)-MeHex14]-KF，[Thr(OTFA)12，(4S)-MeHex14]-KF，[Orn(NδTFA)8，Thr(OTFA)12，(4S)-MeHex14]-KF，[Orn(NδTFA)8，(4S)-MeHex14]-KF，[Thr(OTFA)12，Lit(OTFA)14]-KF，[no 5-MeHex14，N(Hep)2-Val13]-KF，[Orn(Biot)8]-KF，[L-Val-d811]-KF，[AM14]-KF，[AO14]-KF，[C(＝N(CH3)2)14]-KF，[D-Ile7]-KF，[D-Val7]-KF，[D-Orn8，L-Pro9]-KF，[D-Cys7，L-Cys11]-KF，[D-Cys7，D-Cys10]-KF，[D-homoCys7，D-homoCys10]-KF，[Gly12]-KF，[Ala12]-KF，[Leu12]-KF，[Phe12]-KF，[Glu12]-KF，[Orn12]-KF，[Pro12]-KF，[D-Orn13]-KF，[Gln12]-KF and[D-Val1]-KF，
其中括號內(nèi)所示氨基酸或基團(tuán)是引入kahalalide F結(jié)構(gòu)的修飾。
全文摘要
提供了新的kahalalide F的類似物。
文檔編號C07K7/64GK1849333SQ200480025890
公開日2006年10月18日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者F·阿爾伯里克奧·帕洛海拉, A·費(fèi)爾南德斯·多尼斯, E·希拉爾特·列多, C·格拉西亞·坎塔多, P·洛佩斯·羅德里格斯, S·巴龍·科洛梅爾, C·奎瓦斯·馬昌特, A·洛佩斯·馬西亞, A·弗蘭切斯凱·索洛索, J-C·希門尼斯·加西亞, M·羅約·?？怂共ㄎ魍?申請人:馬爾藥品公司