專利名稱：原花色素低聚物的提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有效地純化高純度原花色素低聚物的方法。這種低聚物具有不同的生物活性，包括抗腫瘤、消炎、抗老化、抗氧化、抗過敏、抗菌性和生毛發(fā)活性等，并且可以有效應(yīng)用于食品、化妝品、藥物等。
背景技術(shù)：
通常，已知原花色素是一種高級植物的生物保護(hù)物質(zhì)，是一類聚合物的屬名，這類聚合物以黃烷-7-醇作為結(jié)構(gòu)單元，以4β→6、4β→8、4β→8·2β0→7等成鍵方式聚合的二聚體或多聚體形式存在。這些低聚物也稱為凝縮單寧(”E.Steinegger·R.Hnsel，Pharmacognosy[第一卷]，Approach to Chemistry and Pharmacology”(Shuji Itokawa等譯，Hirokawa出版公司)，204-208(1977)；PorterL.J.，F(xiàn)lavans and Proanthocyanidins，InHarborne J.B.(編)，“the Flavonoids，Advances in Research Science 1986”，Chapman &Hall，23-55((1994))。這些低聚物通常被稱為原花色素，原因是它們經(jīng)酸處理后生成花色素并變紅。已知原花色素表現(xiàn)出各種各樣的生物活性。已見報(bào)道的生物活性包括抗腫瘤、消炎、抗老化、抗氧化、抗過敏、抗菌性和生毛發(fā)活性等[Bart Schwitters/JackMasquelier，”21stcentury Biophylaxis Substance OPC”，AkiraSasaki譯，F(xiàn)ragrance Journal，50-135(1997)；Tomoya Takahashi等，Journal of Investigative Dermatology，112，310-316(1999)]。結(jié)構(gòu)和活性之間的所有關(guān)系，即這些生物活性和原花色素的聚合度之間的關(guān)系，并非都不清楚。例如，對于生毛發(fā)活性，有人已報(bào)道，在原花色素類物質(zhì)中二聚至五聚的原花色素低聚物(特別是二聚體和三聚體)具有最高的活性(WO96/00561)。
對于從植物體中分離和純化原花色素，已經(jīng)嘗試過從幾種植物體中分離和純化原花色素，包括葡萄種籽、松樹皮、銀杏葉、花生和可可豆等。對這些原料進(jìn)行工業(yè)萃取的例子包括從下列原料中進(jìn)行的萃取葡萄種子(日本公開未審查申請書No.3-200781，WO97/39632，US5484594)，松樹皮(US4698360，WO97/44407)等。在依據(jù)日本公開未審查申請書No.3-200781的方法中，進(jìn)行了如下的預(yù)處理，將白葡萄種子與低于70℃的水相接觸，然后用熱水萃取。所得萃取液加入Sephadex LH-20TM柱，然后用70％乙醇洗脫，由此獲得純度約為90％的含有原花色素的粉末。在根據(jù)US4698360的方法中，1噸松樹皮在壓力下進(jìn)行熱水萃取，然后重復(fù)進(jìn)行乙酸乙酯洗脫和加入氯仿沉淀的步驟，由此獲得含原花色素的粉末。然而，從上述方法得到的純化產(chǎn)品，沒有一種是僅含有90％或更多的二聚至五聚的原花色素的低聚物。這些純化產(chǎn)品也都含有單體、六聚體或更高級聚合物、或其它有機(jī)酸。
使用逆流液-液分配法作為純化原花色素的一種方法，例如，一種使用水和乙酸乙酯的方法，描述在Andrew G.H.Lea，J.Sci.Fd.Agric.，29，471-477(1978)中，在日本公開未審查申請書No.61-16982等文獻(xiàn)中。
使用固-液分配法作為純化原花色素的一種方法，例如，一種使用乙酸乙酯的方法，描述在日本公開未審查申請書No.8-176137和EP0707005中。例如，100kg的葡萄破碎后用水(1650L)、氯化鈉(300kg)和丙酮(550L)的混合溶劑萃取。接著通過蒸餾除去丙酮獲得剩余物。將剩余物用乙酸乙酯進(jìn)行固-液萃取，然后加入二氯乙烷(45L)，由此獲得1.5kg至2.5kg的原花色素沉淀(EP0707005).
此外，使用色譜法提純原花色素的方法包括使用上述SephadexLH-20TM柱的方法(一種對葡萄種子進(jìn)行萃取的方法，日本公開未審查申請書No.3-200781)，和使用以聚苯乙烯基的吸附樹脂的方法(一種對紅豆萃取的方法，日本公開已審查申請書No.7-62014)。例如，將以聚苯乙烯基的吸附樹脂“Sepabeads SP-850TM”(MITSUBISHICHEMICAL CORPORATION)加入到浸泡干燥的紅豆的水中，然后攪拌混合物，由此使原花色素吸附在樹脂上。然后，將樹脂在低于70℃的溫度下干燥，用80％(v/v)的乙醇在70℃洗脫，由此可以獲得純度約為60％的含原花色素的粗粉末。
然而，所有這些方法都是不按照聚合度提純原花色素混合物。也就是說，這些方法不能有效地和有選擇性地獲得二聚至五聚的原花色素低聚物。它們對二聚至五聚的原花色素低聚物的回收率低。
按聚合度分離原花色素，已知有一種使用正相硅膠液相色譜的方法(一種對可可豆萃取的方法J.Rigaud等，J.Chromatogr.A，654，255-260(1993)，一種對葡萄種子萃取的方法Corine Prieur等，Phytochenistry，36，781-784(1994))。前一種方法包含如下步驟，將用甲醇從可可豆中萃取獲得的包含原花色素類的樣品溶液加入硅膠柱，然后用二氯甲烷∶甲醇∶甲酸∶水[(41→5)∶(7→43)∶1∶1]的混合溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。后一種方法包含以下步驟，將用甲醇從葡萄種子中萃取獲得的包含原花色素類的樣品溶液加入硅膠柱，然后用二氯甲烷∶甲醇∶水∶三氟乙酸[(82→10)∶(18→86)∶2∶0.05]的混合溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。
然而，這些方法涉及一些問題，如由于含氯溶劑的使用和溶劑組合物復(fù)雜引起的溶劑回收和重復(fù)使用困難。而且，需要使用高濃度梯度溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。因此，考慮到安全和經(jīng)濟(jì)因素，這些方法不適合用作面向大量提純的工業(yè)分離方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于從含有原花色素的原料或其粗純化產(chǎn)品中有效提純高純度二聚至五聚的原花色素低聚物的方法。
常規(guī)技術(shù)的結(jié)合不足以除去目的成分二聚至五聚原花色素以外的物質(zhì)，例如構(gòu)成原花色素的單體，如類黃酮、兒茶素或表兒茶素等，六聚或更高聚的原花色素聚合物，以及其它雜質(zhì)。也就是說，難于有效地獲得高純度二聚至五聚的原花色素低聚物，即本發(fā)明的目的組分。另外，考慮到所用溶劑組合物的復(fù)雜性、經(jīng)濟(jì)、安全等因素，大多數(shù)已知的方法不適合用于工業(yè)處理。
作為為解決這些問題所進(jìn)行的充分研究的結(jié)果，我們已經(jīng)完成了一種有效提純高濃度二聚至五聚原花色素的方法。
第一個(gè)發(fā)明是一種純化二聚至五聚原花色素低聚物的方法，包括使用乙酸甲酯作為液相，通過固一液萃取方法，從含有原花色素的原料或從其粗純化產(chǎn)品中提純原花色素低聚物。
作為上述液相的乙酸甲酯可以以單一溶劑或混合溶劑形式使用，這種混合溶劑是乙酸甲酯和一種可與乙酸甲酯混溶的有機(jī)溶劑的結(jié)合，它是通過將這種有機(jī)溶劑加入乙酸甲酯中制備的。
第二個(gè)發(fā)明是一種純化二聚至五聚原花色素低聚物的方法，包括使用一種水解酶對含有原花色素的原料、從原料中得到的粗純化產(chǎn)品、或包含這些物質(zhì)之一的溶液進(jìn)行預(yù)處理。
第三個(gè)發(fā)明是一種純化具有均一聚合度的二聚至五聚原花色素低聚物的方法，其中原花色素低聚物通過正相硅膠液相色譜法用溶劑作為流動(dòng)相從含有原花色素的原料或從其粗純化產(chǎn)品中依聚合度進(jìn)行分離和純化，這種溶劑可以是選自酯溶劑、酮溶劑、烴溶劑、醚溶劑和醇溶劑的單一溶劑或兩種或多種溶劑的混合溶劑。優(yōu)選使用兩種或多種溶劑的混合溶劑作為上述流動(dòng)相。
而且，本發(fā)明能夠提供具有90(w/w)％或更高純度的純化二聚至五聚原花色素、純度為90(w/w)％或更高的二聚原花色素、和90(w/w)％或更高純度的三聚原花色素，這些物質(zhì)可以通過上述純化方法或其結(jié)合得到。
原花色素類物質(zhì)是凝縮單寧，存在于不同的植物體內(nèi)，并擁有一個(gè)基本結(jié)構(gòu)，其中黃烷-7-醇通過4β→6、4β→8、4β→8·2β0→7等鍵合逐步凝縮或聚合。在分類中，將二聚至五聚的原花色素和六聚或更高聚合物的原花色素分別定義為原花色素低聚物和原花色素聚合物。而且，黃烷-7-醇單體定義為構(gòu)成原花色素的單體。原花色素的低聚物的例子包括原花色素類，如原花青素、原翠雀素和原花葵素，及其所有立體異構(gòu)體。一種構(gòu)成原花色素類化合物的單體如下列結(jié)構(gòu)式(I)所示 (其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是相同或不同的基團(tuán)，代表氫、羥基或3，4，5-三羥苯甲?；?。
本發(fā)明中使用的原料或從中得到的粗純化產(chǎn)品的例子包括任何含有原花色素低聚物的物質(zhì)，特別優(yōu)選的例子具體包括植物原料，如水果、種皮、植物種子和樹皮、從中得到的萃取物、和從中得到的粗純化產(chǎn)品。例如，優(yōu)選那些富含原花色素低聚物的物質(zhì)，包括果汁、或從如葡萄、柿子、蘋果、藍(lán)莓、紅莓等的種皮或種子中得到的萃取物、或從花生殼、栗子殼等、大麥糠或蕎麥的外皮、柿子葉、松樹皮、棕櫚葉等物質(zhì)中得到的萃取物。
此外，通過非酶法或酶法獲得的粗產(chǎn)品或其粗純化產(chǎn)品也可以用作原料。用于合成原花色素低聚物的合成方法的例子包括在Journalof Chemical Society Perkin Transaction I，1535-1543(1983)中描述的用于表兒茶素或兒茶素的二聚體的制造方法，以及在Phytochemistry，25，1209-1215(1986)中描述的用于表兒茶素或兒茶素的三聚體的制造方法。根據(jù)這些方法或類似方法制得的粗產(chǎn)品或由此獲得的粗純化產(chǎn)品也可以用作本發(fā)明方法的原料。
揮發(fā)性的有機(jī)溶劑優(yōu)選作為用于第一個(gè)發(fā)明的與乙酸甲酯可混溶的有機(jī)溶劑。這種有機(jī)溶劑的例子包括醇溶劑類，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；酯溶劑類，如甲酸甲酯、甲酸乙酯和乙酸乙酯；酮溶劑類，如丙酮；腈溶劑類，如乙腈；醚溶劑類，如四氫呋喃和1，2-二甲氧基乙烷；烴溶劑類如己烷；及羧酸溶劑類如乙酸。當(dāng)使用與乙酸甲酯可混溶的有機(jī)溶劑時(shí)，整個(gè)萃取溶劑優(yōu)選含有乙酸甲酯50體積％或更多，更優(yōu)選70體積％或更多，更加優(yōu)選90體積％或更多。
在第二個(gè)發(fā)明中使用的用于水解的酶的例子包括糖苷酶和酯酶。
糖苷酶的例子包括選自下列物質(zhì)的單一物質(zhì)或兩種或多種物質(zhì)的混合物淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、右旋糖酐酶、殼多糖酶、半乳糖醛酶、溶菌酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、呋喃果糖苷酶、海藻糖酶、氨基葡糖苷酶、支鏈淀粉酶、神經(jīng)酰胺酶、巖藻糖苷酶和瓊脂酶。酯酶的例子包括選自下列物質(zhì)的單一物質(zhì)或兩種或多種物質(zhì)的混合物羧酸酯酶、芳基酯酶、脂肪酶、乙酰酯酶、膽堿酯酶、果膠酯酶、膽甾醇酯酶、葉綠素酶、內(nèi)酯酶、單寧酶和水解酶。
在第二個(gè)發(fā)明中，含有含二聚至五聚原花色素低聚物原料或從中獲得的粗純化產(chǎn)品的溶液的例子通常包括水溶液，或含有10％或更少如醇、酯或酮等有機(jī)溶劑的水溶液。
在第三個(gè)發(fā)明中，用作流動(dòng)相的酯溶劑的例子包括甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丙酯、丙酸異丙酯、丙酸丁酯、丙酸異丁酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、丁酸異丙酯、丁酸丁酯和丁酸異丁酯。酮溶劑的例子包括丙酮、甲乙酮、甲丙酮、甲基異丙基酮、甲丁酮、甲基異丁基酮、甲基叔丁基酮、二乙基酮、二異丙基酮、甲基乙烯基酮、環(huán)丁酮、環(huán)戊酮和環(huán)己酮。烴溶劑的例子包括戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十九烷、環(huán)己烷、二甲苯和甲苯。醚溶劑的例子包括四氫呋喃和1，2-二甲氧基乙烷。醇溶劑的例子包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇等。
從植物原料中的萃取和粗純化可通過例如以下所述的已知方法進(jìn)行。
包括植物果實(shí)、種皮、種子、外層、殼、葉子和樹皮等的植物原料在經(jīng)過如空氣干燥的干燥處理后，用作萃取用的材料。完整的植物原料也可以用作萃取用的材料。
從上述待萃取的材料進(jìn)行原花色素的粗萃取可以參考已知的方法[Chem.Pharm.Bull.，38，3218(1990)，Chem.Pharm.Bull.40，889-898(1992)]。例如，將已經(jīng)壓碎或粉碎的植物原料用溶劑進(jìn)行萃取。作為萃取用的溶劑，可以使用選自親水性溶劑和親油性溶劑的單一溶劑，或兩種或多種溶劑的混合溶劑。這些溶劑包括水，醇溶劑如甲醇、乙醇和異丙醇，酮溶劑如丙酮和甲乙酮，以及酯溶劑如乙酸甲酯和乙酸乙酯。萃取的溫度范圍通常為0-100℃，優(yōu)選為5-50℃。象種子等含油材料可以在不壓碎的情況下進(jìn)行萃取。如果需要的話，萃取可以重復(fù)2至3次。不溶的剩余物通過過濾或離心法從通過上述步驟獲得的萃取液中除去，從而獲得粗萃取液。植物原料，如植物汁、樹汁等，可以直接用作萃取材料，或凝縮單寧的濃縮粗萃取液可以參考Agric.Biol.Chem.，45，1885-1887(1981)來制備。
對通過化學(xué)方法，如非酶法或酶法獲得的粗產(chǎn)品的萃取和粗純化，也可以用類似于上述的方法進(jìn)行。
下面，將用實(shí)施例給出本發(fā)明純化方法的詳細(xì)描述。
在第一個(gè)發(fā)明中，二聚至五聚的原花色素低聚物通過以下步驟進(jìn)行純化使用乙酸甲酯單一溶劑或乙酸甲酯和一種可與乙酸甲酯混溶的有機(jī)溶劑的混合溶劑作為液相，將含有原花色素低聚物的原料或從中獲得的粗純化產(chǎn)品進(jìn)行固-液萃取。當(dāng)原料或從中獲得的粗純化產(chǎn)品是液體時(shí)，優(yōu)選通過噴霧干燥或冷凍干燥進(jìn)行預(yù)固體化。通常，固體和乙酸甲酯、或固體和乙酸甲酯與一種可與乙酸甲酯混溶的有機(jī)溶劑的混合溶劑的混合比(w/v)約為1∶1至1∶1000。在室溫下萃取或在加熱攪拌下進(jìn)行短時(shí)間萃取。優(yōu)選固體和乙酸甲酯、或固體和乙酸甲酯與一種可與乙酸甲酯混溶的有機(jī)溶劑的混合溶劑的混合比(w/v)為1∶5至1∶100。萃取在室溫下進(jìn)行約1小時(shí)，并更優(yōu)選在相同條件下將剩余物隨后重復(fù)萃取(幾次)。更細(xì)的粉末粒徑對于有效的固-液萃取是優(yōu)選的。當(dāng)使用混合溶劑進(jìn)行萃取時(shí)，優(yōu)選通過將溶劑混合，使混合溶劑具有與乙酸甲酯的極性類似的溶劑極性。使用這些溶劑進(jìn)行固-液萃取抑制了原花色素聚合物和其它雜質(zhì)的洗脫，并能有效純化二聚至五聚原花色素低聚物。在第一個(gè)發(fā)明中，濃縮所得乙酸甲酯萃取液，并將濃縮的剩余物重新溶解在水中或水溶劑如緩沖液中，然后，二聚至五聚原花色素低聚物可以通過冷凍干燥或噴霧干燥得到回收。
在第二個(gè)發(fā)明中，二聚至五聚的原花色素低聚物通過以下步驟進(jìn)行純化使用可水解含有原花色素低聚物的原料、從原料中得到的粗純化產(chǎn)品、或包含這些物質(zhì)之一的溶液的酶進(jìn)行預(yù)處理。原料或從中得到的粗純化產(chǎn)品通常含有除原花色素低聚物之外的許多雜質(zhì)。特別是當(dāng)原料或從中得到的粗純化產(chǎn)品是從植物得到的，則除去原花色素低聚物之外，多酚、苷、酯等都以高比例存在。用上述水解酶對這類苷或酯雜質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理獲得苷元，使在下一純化步驟中有效去除這些雜質(zhì)和提高原花色素低聚物的純度成為可能。例如，蕓香苷是在Polygonaceae家族的Fagopyrum esculentum的整個(gè)植物中大量存在的類黃酮葡糖苷酶，通過用β-糖苷酶處理使其變成作為苷元的櫟精。綠原酸和p-香豆?？崴崾窃赿icotyledons的水果或葉子中大量存在的羥基肉硅酸酯，在用羥基肉硅酸酯水解酶對其處理時(shí)，它們的縮酚酸鍵(分子內(nèi)酯鍵)被水解，分別生成咖啡酸和奎尼酸，及p-香豆酸和奎尼酸。使用水解用的酶處理的反應(yīng)條件依賴酶的類型等因素而不同。通常，反應(yīng)條件是PH3-8、溫度25-55℃、時(shí)間1-24小時(shí)。用水解酶處理得到的上述苷元成分、單糖或羧酸，可以通過常規(guī)技術(shù)如降溫、液-液或固-液萃取、或柱吸附、或這些方法相結(jié)合和正相色譜法易于除去。這些步驟允許有效去除在含有二聚至五聚原花色素低聚物的原料或從中得到的粗純化產(chǎn)品中的雜質(zhì)，并且提高了目的成分，即二聚至五聚原花色素低聚物的純度。
在第三個(gè)發(fā)明中，具有均一聚合度的二聚至五聚原花色素低聚物可以通過如下方法獲得通過正相硅膠液相色譜法用溶劑作為流動(dòng)相從含有原花色素的原料或從中得到的粗純化產(chǎn)品依聚合度進(jìn)行分離和純化，這種溶劑可以是選自酯溶劑、酮溶劑、烴溶劑、醚溶劑和醇溶劑的單一溶劑或兩種或多種溶劑的混合溶劑。對于上面的正相硅膠液相色譜法，可以使用毛細(xì)管柱色譜法或高效液相色譜法。先將含有二聚至五聚原花色素低聚物的溶液除溶劑或水，然后將剩余物溶解在流動(dòng)相或與流動(dòng)相相溶的有機(jī)溶劑中。當(dāng)原料或從中得到的粗純化產(chǎn)品是固體時(shí)，把它們直接溶解在流動(dòng)相或在與流動(dòng)相相溶的有機(jī)溶劑中。如果必要，將它們用膜濾器等過濾然后裝入色譜柱中。關(guān)于洗脫目的成分，考慮到操作的簡單化，優(yōu)選使用沒有濃度梯度流動(dòng)相的恒溶劑洗脫。在恒溶劑(isocratic)洗脫中優(yōu)選的流動(dòng)相的例子包括混合溶劑，如己烷/甲醇/乙酸乙酯、己烷/丙酮、己烷/甲醇/四氫呋喃/乙酸、己烷/甲醇/四氫呋喃/甲酸、己烷/甲醇/乙酸甲酯/乙酸、己烷/甲醇/乙酸甲酯、和己烷/乙酸甲酯/丙酮。
第三個(gè)發(fā)明的純化方法使雜質(zhì)，即構(gòu)成原花色素類物質(zhì)的單體如(+)-兒茶素、(+)-棓兒茶酸、(-)-表兒茶素、(-)-表格兒茶酸，和六聚或更高級原花色素聚合物的去除成為可能；并且使依照目的成分，即二聚至五聚原花色素低聚物的聚合度的分離和純化成為可能。
根據(jù)作為萃取源的原料、目的純度等，在本申請書中第一至第三個(gè)發(fā)明的純化方法可以自由選用、重復(fù)使用或結(jié)合使用。
為了純化二聚至五聚原花色素低聚物，結(jié)合使用兩個(gè)或多個(gè)第一至第三個(gè)發(fā)明的純化方法是優(yōu)選的。為了純化具有均一聚合度的二聚至五聚原花色素低聚物，結(jié)合使用第一個(gè)發(fā)明的純化方法和/或第二個(gè)發(fā)明的純化方法和/或第三個(gè)發(fā)明的純化方法是優(yōu)選的。而且，當(dāng)結(jié)合使用純化方法時(shí)，使用的步驟和順序可以自由選擇。
通過這些方法，可以有效地獲得具有高純度(純度為90(w/w)％或更高)的二聚至五聚的原花色素低聚物、二聚原花色素、和三聚原花色素。
通過本發(fā)明的純化方法純化的二聚至五聚的原花色素低聚物、二聚原花色素、和三聚原花色素可以用作制造食品、化妝品、藥物等的原料。


圖1顯示反相液相色譜法的結(jié)果。圖1中的符號表示下列物質(zhì)1.PB12.(+)-兒茶素3.PB24.綠原酸5.咖啡酸6.PC17.(-)-表兒茶素8.p-香豆酸酯9.p-香豆酸10.根皮苷11.根皮素圖2顯示正相液相色譜法的結(jié)果。
圖3顯示正相液相色譜法的結(jié)果。
圖4顯示反相液相色譜法的結(jié)果。圖4中的符號表示下列物質(zhì)1.PB12.(+)-兒茶素3.PB24.PC15.(-)-表兒茶素[5]，[6]相應(yīng)于圖3中餾分編號的單體餾分。
-[11]相應(yīng)于圖3中餾分編號的二聚體餾分。
-[20]相應(yīng)于圖3中餾分編號的三聚體餾分。
圖5顯示正相液相色譜法的結(jié)果。
圖6顯示反相液相色譜法的結(jié)果。圖6中的符號表示下列物質(zhì)1.PB12.(+)-兒茶素3.PB24.PC15.(-)-表兒茶素[2]-[4]相應(yīng)于圖5中餾分編號的單體餾分。
-[9]相應(yīng)于圖5中餾分編號的二聚體餾分。
-[15]相應(yīng)于圖5中餾分編號的三聚體餾分。
圖7顯示原花色素低聚物聚合度分布的分析結(jié)果。
這個(gè)說明書包括在日本專利申請書No.11-116380(本申請書的優(yōu)先權(quán)文件)中的說明書和/或圖表中公開的全部或部分內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式
下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是它并不限于這些實(shí)施例的任一個(gè)或類似實(shí)例。
實(shí)施例1通過固-液萃取進(jìn)行的純化(A)將300ml乙酸甲酯加入30g在參考實(shí)施例1中獲得的原花色素餾分中，然后，在室溫下進(jìn)行固-液萃取1小時(shí)。萃取總共進(jìn)行兩次，將兩次萃取所得的萃取液混合然后過濾。接著，萃取的剩余物用少量乙酸甲酯洗滌。將乙酸甲酯萃取液和洗滌液合并并且在減壓條件下濃縮。將少量的蒸餾水加入其中，然后在減壓條件下再次進(jìn)行濃縮，并將萃取組分溶解在水溶液中。將所得水溶液進(jìn)行冷凍干燥獲得17.5g粉末狀乙酸甲酯萃取物。然后，將萃取剩余物干燥獲得12.5g由乙酸甲酯萃取后的粉末狀非萃取物。在兩種粉末產(chǎn)品中的二聚和三聚原花色素的含量用參考實(shí)施例2中所述的反相液相色譜法測量。測定的二聚原花色素組分是原花青素B1(表兒茶素-(4β→8)-兒茶素；以下縮寫為PB1)和原花青素B2(表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素；以下縮寫為PB2)。測定的三聚原花色素組分是原花青素C1(表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素4β→8)-表兒茶素；以下縮寫為PC1)。表1列出了用乙酸甲酯萃取的結(jié)果和固含量的收率％。
表1

如表1所示，用乙酸甲酯進(jìn)行固-液萃取有效地達(dá)到了對以PB1、PB2和PC1為代表的原花色素低聚物成分的選擇性萃取和純度提高。
實(shí)施例2通過固-液萃取進(jìn)行的純化(B)乙酸甲酯和不同的溶劑以體積比9∶1(當(dāng)用乙酸甲酯∶己烷混合時(shí)，比例為9∶5)進(jìn)行混合，這樣制得固-液萃取用的溶劑。在這些不同的溶劑中使用的可以與乙酸甲酯混溶的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、四氫呋喃、己烷或乙酸。將10ml用于萃取的溶劑加入1g在參考實(shí)施例1中獲得的每一種原花色素餾分中，然后混合物在室溫下進(jìn)行固-液萃取1小時(shí)(單一萃取)。通過離心過濾從萃取液中除去固體成分后，一定量的萃取液用蒸餾水稀釋100倍(0.01→1ml)。然后PB1、PB2和PC1的含量用參考實(shí)施例2中所述的反相液相色譜法測量。同時(shí)，每一種萃取液取1ml樣品除去溶劑，然后冷凍干燥，由此測定固體萃取物的量。表2列出了用每一種萃取劑通過固-液萃取所得萃取液中PB1、PB2和PC1的萃取效率和固含量收率(％)。并且，作為對比實(shí)施例，也以上述類似的方式(除了將20ml乙酸乙酯用于2g原花色素餾分)，只用乙酸乙酯作萃取液進(jìn)行固-液萃取。表2也列出了對比試驗(yàn)的結(jié)果。
表2

實(shí)施例3通過固一液萃取進(jìn)行的純化(C)乙酸甲酯和乙酸乙酯以表3所列出的體積比進(jìn)行混合，然后進(jìn)行固-液萃取。將10ml有不同體積比的用于萃取的溶劑加入到1g在參考實(shí)施例1中獲得的每一種原花色素餾分中，然后在3O℃下進(jìn)行固-液萃取1.5小時(shí)。這個(gè)步驟重復(fù)三次。將這些萃取液合并，在減壓下濃縮，并冷凍干燥，由此獲得粉末狀產(chǎn)品(萃取液)．PB1、PB2和PC1在粉末產(chǎn)品中的含量用參考實(shí)施例2中所述的反相液相色譜法測量。表3列出了用不同體積比的溶劑萃取的結(jié)果，包括固含量收率(％)、PB1、PB2和PC1各自的萃取物量和收率、PB1、PB2和PC1的總收率(％)和純度。
表3

如表3所示，用包含乙酸甲酯的萃取溶劑進(jìn)行固-液萃取有效地實(shí)現(xiàn)了對以PB1、PB2和PC1為代表的原花色素低聚物成分的選擇性萃取和純度提高。
實(shí)施例4結(jié)合使用酶解處理的純化將在參考實(shí)施例1中制得的多酚萃取液用商店出售的食品加工用酶制劑進(jìn)行處理。這里使用的酶制劑是由曲酶衍生的脂肪酶制劑(Lipase SankyoTM，SANKYO CO.，LTD.)和水解酶制劑(羥基肉桂酸酯水解酶，Seishin Co.，LTD.)。100ml多酚萃取液先用5mol/l的NaOH調(diào)節(jié)PH至5，并用蒸餾水稀釋10倍，由此獲得樣品溶液。上述的脂肪酶制劑和上述的水解酶制劑各取1g，分別加入1L樣品溶液(最終濃度0.1％)中，酶反應(yīng)在45℃下進(jìn)行16小時(shí)。對反應(yīng)前和反應(yīng)后的樣品溶液用在參考實(shí)施例2中描述的反相液相色譜法進(jìn)行測試，結(jié)果分別列在圖1-a和圖1-b。如圖中所示，大部分主要雜質(zhì)，綠原酸和根皮苷消失了，而代之以由上述酶反應(yīng)產(chǎn)生的單體咖啡酸、p-香豆酸和根皮素的增加。下一步，將反應(yīng)后的溶液濃縮，接著進(jìn)行噴霧干燥，這樣獲得20g粉末產(chǎn)品。然后，將200ml乙酸甲酯加入其中，進(jìn)行固-液萃取。乙酸甲酯萃取液的色譜圖列于圖1-c。在圖1-a和圖1-b的基線上以峰形出現(xiàn)的原花色素聚合物通過固-液萃取除去了。再將少量的蒸餾水加入萃取液中，接著通過在減壓條件下濃縮除去乙酸甲酯，這樣提取后的成分溶解在水中。將乙酸乙酯/n-己烷(8/2)(以與水溶液相等的用量)加入到剛制備的水溶液(50ml)中進(jìn)行液-液萃取。所得有機(jī)溶劑層(上層)和水層(下層)的色譜圖分別為圖1-d和圖1-e。這樣，部分構(gòu)成原花色素的單體(兒茶素、表兒茶素)和大部分由先前的酶處理得到的主要產(chǎn)品，單體咖啡酸、p-香豆酸和根皮素，被轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑層(圖1-d)。大部分以PB1、PB2和PC1為代表的二聚至五聚原花色素低聚物在液-液萃取后仍留在水溶液層中(圖1-e)。將最終獲得的水層濃縮并冷凍干燥，由此獲得5.7g粉末。經(jīng)過這一系列步驟，總固含量中PB1+PB2+PC1的純度提高了約4倍，從11.5增加到40.3％。如上所述，通過對原料的提取液進(jìn)行酶解處理，然后進(jìn)行多種純化方法的結(jié)合使用，目的成分，二聚至五聚原花色素低聚物的純度可以有效地提高。
實(shí)施例5用正相液相色譜法的純化(A)將100ml乙酸甲酯加入到10g在參考實(shí)施例1中獲得的原花色素餾分中，進(jìn)行固-液萃取。萃取液在減壓條件下濃縮至恒定體積，得到20ml濃縮液。然后進(jìn)行用硅膠作為填充劑的正相液相色譜分離組分。色譜條件如下色譜柱Inertsil SILTM(4.6mm內(nèi)徑×150mm，GL Science)用于恒溶劑分離的流動(dòng)相己烷/甲醇/乙酸乙酯(70/30/10)進(jìn)樣量0.01ml流量1.8ml/min檢測UV280nm所得的色譜圖見圖2。在這些條件下，原花色素低聚物組分按聚合度從二聚體至更高聚合物依次分離，然后從柱上洗脫。也就是說，它證實(shí)了具有均勻聚合度的低聚物成分(二聚體、三聚體等)，依照各自的目的通過用硅膠作填料的正相液相色譜達(dá)到了選擇性分離。
而且使用相同的濃縮液體樣品，可在制備規(guī)模上進(jìn)行正相液相色譜的分級。分級條件如下硅膠填料球型多孔硅膠(75μm，120A)柱尺寸6mm內(nèi)徑×500mm×2的柱子用于恒溶劑分離的流動(dòng)相己烷/甲醇/乙酸乙酯(70/30/10)進(jìn)樣量0.5ml流量3ml/min分級15ml/5min./1餾分檢測UV280nm如圖3所示，樣品中的原花色素低聚物即使在制備規(guī)模上也能依聚合度分離。
隨后，在色譜圖中相應(yīng)于單體、二聚體和三聚體的洗脫餾分進(jìn)行取樣。然后，在每一種洗脫餾分中低聚物組分的組成用參考實(shí)施例2中描述的反相液相色譜法進(jìn)行檢測。如圖4-[5]和圖4-[6]所示，單體餾分主要由兒茶素和表兒茶素組成，如圖4-[7]至圖4-[11]所示，二聚體餾分主要由PB1和PB2組成，如圖4-[12]至圖4-[20]所示，三聚體餾分主要由PC1組成。分離后的餾分各由具有相同聚合度的低聚物組分構(gòu)成。
以上所得純化的二聚和三聚原花色素產(chǎn)品的純度分別是93和92(w/w)％。
實(shí)施例6用正相液相色譜法的純化(B)使用在實(shí)施例5中濃縮的液體樣品進(jìn)行正相液相色譜分級。分級條件如下硅膠填料球型多孔硅膠(75μm，120A)柱尺寸6mm內(nèi)徑×500mm×2的柱子用于恒溶劑分離的流動(dòng)相己烷/丙酮(40/60)進(jìn)樣量0.05ml流量3ml/min分級15ml/5min./1餾分檢測UV280nm
圖5是所得色譜圖。對在色譜圖中相應(yīng)于單體峰、二聚體峰和三聚體峰的洗脫餾分進(jìn)行取樣。然后，對每一種洗脫餾分中低聚物組分的組成用參考實(shí)施例2中描述的反相液相色譜法進(jìn)行研究。如圖6-[2]至圖6-[4]所示，單體餾分主要由兒茶素和表兒茶素組成，如圖6-[5]至圖6-[9]所示，二聚體餾分主要由PB1和PB2組成，如圖6-[10]至圖6-[15]所示，三聚體餾分主要由PC1組成。與實(shí)施例5相似，分離后的餾分都由具有相同聚合度的低聚物組分構(gòu)成。
上述獲得的純化后的二聚和三聚原花色素產(chǎn)品的純度分別是95和93(w/w)％。
(參考實(shí)施例1)從蘋果中制備原花色素成分根據(jù)在Rapid Communication of Mass Spectrometry，11，31-36(1997)中描述的方法，從蘋果制備多酚萃取液和原花色素餾分。主要品種為“Fuji”的生蘋果(3kg)作為原料。將水果壓碎同時(shí)向其中加入偏亞硫酸氫鉀，并榨汁獲得果汁。果汁進(jìn)行離心和過濾以使其澄清，這樣獲得1.8L清澈的果汁。接著，將果汁加入一個(gè)SepabeadsSP-850TM(Nippon Rensui)-填充柱(25mm內(nèi)徑×285mm)中，使果汁中的多酚成分吸附在其中。在果汁中存在的糖和有機(jī)酸通過用300ml蒸餾水洗滌除去后，多酚成分用200ml的80％乙醇水溶液洗脫。然后，收集的洗脫液在減壓條件下濃縮至65ml，這樣獲得多酚萃取液。將多酚萃取液(25ml)進(jìn)一步加入一個(gè)TSK-GEL toyopearl HW-40ECTM(TOSOH)-填充柱(25mm內(nèi)徑×285mm)中，然后用200ml蒸餾水洗滌柱子，這樣大多數(shù)雜質(zhì)、酚、羧酸被除去了。然后，把250ml的40％乙醇水溶液加入柱中，使其他低分子量多酚洗脫。隨后，將100ml的60％丙酮水溶液加入柱子中，這樣洗脫和回收大多數(shù)原花色素。這里，部分二聚到五聚的原花色素低聚物混合在用40％乙醇水溶液洗脫的洗脫液中。這樣，將洗脫液在減壓條件下濃縮脫去乙醇，濃縮液進(jìn)一步加入Sep-pak C18ENVTM柱中(Waters)，這樣僅僅重新純化和回收混合在濃縮液中的原花色素組分?；厥蘸蟮娜芤汉陀?0％丙酮水溶液洗脫的洗脫液進(jìn)行混合，在減壓條件下濃縮，并冷凍干燥，由此獲得原花色素餾分(清澈果汁1.8L→8g)。質(zhì)譜分析表明這個(gè)餾分由單體至15聚的原花色素類化合物構(gòu)成。根據(jù)需求，這個(gè)步驟可以以更大的規(guī)模進(jìn)行，以使制備的多酚萃取液或原花色素餾分的產(chǎn)量滿足每一個(gè)實(shí)施例的需要。
(參考實(shí)施例2)多酚分析在實(shí)施例中描述的不同樣品中的多酚組分的組成的分析，可通過反相液相色譜根據(jù)需求在下列條件下進(jìn)行。
色譜柱Inertsil ODS-3TM(4.6×15mm，GL Science)洗脫液A)0.1mol/l磷酸鹽緩沖劑(PH2)/甲醇(8/2)B)0.1mol/l磷酸鹽緩沖劑(PH2)/甲醇(5/5)梯度洗脫條件0→10min.(100％A)，10min→50min.(100％A→100％B)，50min→65min.(100％B)進(jìn)樣量10μl流量1ml/min檢測UV280nm(參考實(shí)施例3)原花色素低聚物聚合度分布的分析從在實(shí)施例1中用乙酸甲酯萃取獲得的萃取液或非萃取液中制得的粉末產(chǎn)品中的原花色素低聚物的聚合度分布用凝膠滲透色譜法進(jìn)行分析。分析條件如下色譜柱TSK-GEK toyopearl HW-40FTM(2.5×95cm，TOSOH)洗脫液丙酮/8mol/l脲(6/4)流量1.0ml/min分級3ml/3min./1餾分(最初的80ml倒掉)檢測加入酚試劑用比色法(在可見光區(qū)760nm處檢測)接著，將標(biāo)準(zhǔn)兒茶素類化合物(表兒茶素、PB2和PC1各2mg)、原花色素混合物(10mg)、用乙酸甲酯從原花色素混合物中萃取獲得的粉末產(chǎn)品(5.83mg)和用乙酸甲酯從同一混合物中未萃取出的粉末產(chǎn)品(4.17mg)分別溶解在0.5ml洗脫液中并進(jìn)行分析。圖7列出了分析結(jié)果。
如圖7所示，在上述分析條件下，樣品中的原花色素低聚物基于填料的分子篩效應(yīng)，按照聚合度從大到小的順序被洗脫出來。具體來說，三聚體、二聚體和單體組分在色譜圖上以單峰出現(xiàn)。如圖7中所示，用乙酸甲酯萃取液制得的粉末產(chǎn)品主要由單體、二聚和三聚的原花色素低聚物成分組成。另一方面，乙酸甲酯從同一混合物未萃取出的粉末產(chǎn)品主要由具有大分子量的原花色素聚合物成分構(gòu)成。
在這里引用的所有出版物、專利和專利申請書整體在此引入作為參考。
工業(yè)可行性根據(jù)本發(fā)明，二聚至五聚的原花色素低聚物，以及具有均一聚合度的二聚和三聚原花色素化合物從含有原花色素類化合物的原料或從原料中獲得的粗純化產(chǎn)品中有效地進(jìn)行高純度提純。由本發(fā)明制得的原花色素低聚物具有各種各樣的生物活性，包括抗腫瘤、消炎、抗老化、抗氧化、抗過敏、抗菌性和生發(fā)活性等，因此它們在包括食品、化妝品、和藥物等在內(nèi)的應(yīng)用方面有用途。
權(quán)利要求
1.一種具有均一聚合度的二聚至五聚原花色素低聚物的純化方法，它包括使用選自酯溶劑、酮溶劑、烴溶劑、醚溶劑和醇溶劑的單一溶劑或兩種或多種溶劑的混合溶劑作為流動(dòng)相，通過正相硅膠液相色譜法，從含有二聚至五聚原花色素低聚物的原料或從原料中得到的粗純化產(chǎn)品中，按照聚合度分離和純化原花色素低聚物。
2.權(quán)利要求1的純化方法，其中含有二聚至五聚原花色素低聚物的原料或從原料中得到的粗純化產(chǎn)品是從植物中得到的。
3.權(quán)利要求1的純化方法，其中用作流動(dòng)相的溶劑是選自酯溶劑、酮溶劑、烴溶劑、醚溶劑和醇溶劑的兩種或多種溶劑的混合溶劑。
4.權(quán)利要求1的純化方法，其中酯溶劑選自甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丙酯、丙酸異丙酯、丙酸丁酯、丙酸異丁酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、丁酸異丙酯、丁酸丁酯和丁酸異丁酯。
5.權(quán)利要求1的純化方法，其中酮溶劑選自丙酮、甲乙酮、甲丙酮、甲基異丙基酮、甲丁酮、甲基異丁基酮、甲基叔丁基酮、二乙基酮、二異丙基酮、甲基乙烯基酮、環(huán)丁酮、環(huán)戊酮和環(huán)己酮。
6.權(quán)利要求1的純化方法，其中烴溶劑選自戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十九烷、環(huán)己烷、二甲苯和甲苯。
7.權(quán)利要求1的純化方法，其中醚溶劑是四氫呋喃或1，2-二甲氧基乙烷。
8.權(quán)利要求1的純化方法，其中醇溶劑選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、仲丁醇和叔丁醇。
9.一種二聚至五聚原花色素低聚物的純化方法，它結(jié)合使用權(quán)利要求1的純化方法和一種二聚至五聚原花色素低聚物的純化方法，后者包括使用酶進(jìn)行預(yù)處理，這種酶用于水解包含原花色素低聚物的原料、從原料中得到的粗純化產(chǎn)品、或包含這些物質(zhì)之一的溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種二聚至五聚原花色素低聚物的純化方法，它包括使用乙酸甲酯作為液相，通過固－液萃取方法從含有原花色素低聚物的原料或從原料中得到的粗純化產(chǎn)品中萃取原花色素低聚物；一種二聚至五聚原花色素低聚物的純化方法，它包含使用酶進(jìn)行預(yù)處理，這種酶用于水解包含原花色素低聚物的原料、從原料中得到的粗純化產(chǎn)品或包含這些物質(zhì)之一的溶液；以及一種具有均一聚合度的二聚至五聚原花色素低聚物的純化方法，它包括使用選自酯溶劑、酮溶劑、烴溶劑、醚溶劑和醇溶劑的單一溶劑或兩種或多種溶劑的混合溶劑作為流動(dòng)相，通過正相硅膠液相色譜法，從含有原花色素低聚物的原料或從原料中得到的粗純化產(chǎn)品中，按照聚合度分離和純化原花色素低聚物。
文檔編號C07D311/62GK1495178SQ200310104759
公開日2004年5月12日 申請日期2000年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月23日
發(fā)明者本多伸吉, 高橋知也, 神村彩子, 松岡貴子, 神田智正, 柳田顯郎, 稗田一男, 也, 子, 正, 男, 郎 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社, 日加威士己株式會社