專利名稱：可用于治療良性前列腺肥大的芳基取代哌嗪的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一系列芳基取代哌嗪，含有它們的藥物組合物，以及用于制備它們的中間體。本發(fā)明化合物能選擇性地抑制對涉及良性前列腺肥大有關的α-1a腎上腺素能受體的結合。另外，本發(fā)明化合物能在體內(nèi)模型中降低尿道內(nèi)壓。因此，本發(fā)明化合物能用于治療良性前列腺肥大。
背景技術：
良性前列腺肥大(BPH)，即前列腺的良性增大，是男子中最常見的良性瘤。約有50％年齡在65歲以上的男子患有不同程度的BPH，并且在這些男子中有三分之一具有與膀胱出口梗阻一致的臨床癥狀(Hieble和Caine，1986)。在美國，在50歲以上的男子中，由于良性和惡性前列腺病而導致進行的外科手術比其它任何器官疾病都要多。
BPH有兩部分，即靜態(tài)部分和動態(tài)部分。靜態(tài)部分是由于前列腺增大所致，其中前列腺增大可導致尿道壓迫和使尿液從膀胱中的流出被梗阻。動態(tài)部分是由于膀胱頸和前列腺自身的平滑肌緊張性增加(防礙了膀胱的排空)所致，并且由α-1腎上腺素能受體(α1-ARs)調(diào)控。對BPH有效的治療是將這兩部分治療到不同程度，并且治療的選擇很多。
手術治療是針對BPH的靜態(tài)部分，包括經(jīng)尿道前列腺切除術(TURP)和經(jīng)尿道前列腺切開術(TUIP)，開口式前列腺切除術，囊擴張術，高溫，斯滕特固定模，和激光切除。對于BPH患者，TURP是優(yōu)選的療法，1990年在美國大約進行了320000例TURP，估計花費了22億美元(Weis等人，1993)。雖然對大多數(shù)患有癥狀性BPH的男子都進行了有效治療，但是約20-25％的患者沒有得到滿意的長期結果(Lepor和Rigaud，1990)。并發(fā)癥包括逆行射精(約70-75％患者)，陽萎(5-10％)，手術后泌尿道感染(5-10％)，以及一定程度的尿失禁(2-4％)(Mebust等人，1989)。此外，在手術進行了10年或10年以上的男子中，再次進行手術的比例大約為15-20％(Wennberg等人，1987)。
除了手術治療以外，也有針對BPH的靜態(tài)部分的藥物治療。非那甾胺(芬甾酮，Merck)是一種用于治療癥狀性BPH的藥物。該藥物是5α-還原酶的競爭性抑制劑，其中5α-還原酶導致睪酮在前列腺中轉化成二氫睪酮(Gormley等人，1992)。二氫睪酮可能是使前列腺生長的主要分裂素，能抑制5α-還原酶的活性劑可使前列腺減小，并能改善尿液通過尿道前列腺部的流動。雖然非那甾胺是有效的5α-還原酶抑制劑，并能使二氫睪酮在血漿和組織中濃度降低，但是其對于癥狀性BPH的治療效果僅僅是一般(Oesterling，1995)。非那甾胺的療效需6-12個月才變得明顯，并且對于許多男性患者，臨床癥狀的改善很小(Barry，1997)。
通過降低前列腺內(nèi)平滑肌緊張性而起作用的腎上腺素能受體阻滯劑(α1-AR阻滯劑)已經(jīng)被用來治療BPH的動態(tài)部分。已經(jīng)研制了多種用于治療由BPH導致的癥狀性膀胱出口梗阻的α1-AR阻滯劑(特拉唑嗪，哌唑嗪，和多沙唑嗪)，其中特拉唑嗪(高特靈，Abbott)研究的最廣泛。雖然α1-AR阻滯劑具有很好的可忍受性，但是約有10-15％的患者用藥后出現(xiàn)了臨床副作用(Lepor，1995)。所有這類阻滯劑的不良作用都很類似，其中體位性低血壓是最常見的副作用(Lepor等人，1992)。與5α-還原酶相比，α1-AR阻滯劑的活性開始的更快(Steers，1995)。然而，通過癥狀改善打分和最大尿流速所測定的其臨床效果很一般(Oesterling，1995)。
α1-AR拮抗劑在治療BPH中的應用與其降低前列腺平滑肌的緊張性，導致梗阻癥狀解除的能力有關。腎上腺素能受體遍布全身各處，并且在血壓、鼻充血、衰竭功能以及其它過程的控制中起主要作用(Harrison等人，1991)。然而，有多種克隆的α1-AR受體亞型α1a-AR，α1b-AR和α1d-AR(Bruno等人，1991；Forray等人，1994；Hiraswa等人，1993；Ramarao等人，1992；Schwinn等人，1995；Weinberg等人，1994)。已有多家實驗室通過功能性、放射配體結合試驗，和分子生物學技術測定了人前列腺內(nèi)α1-AR的特征(Forray等人，1994；Hatano等人，1994；Marshall等人，1992；Marshall等人，1995；Yamada等人，1994)。這些研究提供了支持下述觀點的證據(jù)即人前列腺平滑肌內(nèi)的α1-AR主要是α1a-AR亞型，并且α1a-AR亞型調(diào)節(jié)該組織的收縮。這些發(fā)現(xiàn)啟發(fā)我們，開發(fā)亞型選擇性的α1a-AR拮抗劑可找到對于BPH的治療有更強選擇性的治療有效劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及式I化合物及其可藥用鹽
其中A是(CH2)n，其中n是1-6；R1是C1-6烷基；苯基；取代的苯基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；苯基C1-5烷基；或取代的苯基C1-5烷基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；R2是氫，C1-6烷基，C1-5鏈烯基，C1-5鏈炔基，苯基C1-5烷基，或取代的苯基C1 -5烷基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；E是 其中m是1-5；R3是氫，C1-6烷基，或氧，其中如果R3是氧，則虛線代表鍵，如果R3是C1-6烷基，則虛線不存在；R4是氧；氫；C1-5烷基；甲?；?；羧基；C1-5烷基羰基；C1-5烷氧基羰基；苯基C1-5烷氧基；取代的苯基C1-5烷氧基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；酰氨基；和取代的酰氨基，其中氮取代基獨立地選自一個或多個氫，C1-5烷基，C1-5烷氧基和羥基，其中如果R4是氧，則虛線代表鍵，如果R4是其它任一取代基，則虛線不存在；R5是氫，C1-5烷基，或與R6一起形成環(huán)己烷、環(huán)戊烷或環(huán)丙烷環(huán)；R6是氫，C1-5烷基，或與R5一起形成環(huán)乙烷、環(huán)戊烷或環(huán)丙烷環(huán)。
這些化合物可用作腎上腺素能受體調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明化合物能選擇性地與α1a-AR受體結合，調(diào)節(jié)所述受體的活性，并越過主動脈組織對前列腺組織具有選擇性。因此，它們對包括但不限于BPH的α1a-AR受體介導的疾病具有有效的治療作用。
另外，本發(fā)明還涉及含有式I化合物的藥物組合物，以及用式I化合物治療由α1a-AR受體介導的疾病的方法。
除了式I化合物以外，本發(fā)明還涉及式II化合物中間體。如下所述的這些中間體可用于制備式I化合物 其中A是(CH2)n，其中n是1-6；R1是C2-6烷基；苯基；取代的苯基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；苯基C1-5烷基；或取代的苯基C1-5烷基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；R7是氫，BOC或CBZ。
本發(fā)明還涉及式III化合物。如下所述的這些化合物用作制備式I化合物的中間體
其中m是1-5。
本發(fā)明所用術語是本領域技術人員已知的常用術語?！癏BSS”指漢克氏平衡鹽液?！蔼毩⒌亍北硎?，當有一個以上取代基時，這些取代基可以是不同的。術語“烷基”指直鏈、環(huán)狀和支鏈烷基，術語“烷氧基”指O-烷基，其中烷基是如上述已知的α1a-AR受體拮抗劑的烷基。“LDA”指二異丙基氨基化鋰，“BOP”指苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)膦六氟磷酸鹽?！癇OC”指叔丁氧基羰基，“PyBroP”指溴三吡咯烷基膦六氟磷酸鹽，“CBZ”指芐氧基羰基，“Ts”指甲苯磺?；??！癉CC”指1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺，“DMAP”指4-N’N-二甲基氨基吡啶，“EDCI”指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽，“HOBT”指1-羥基苯并三唑水合物。符號“Ph”指苯基，“PHT”指苯二酰亞氨基。術語“有效劑量”指一定量的能結合α1a-腎上腺素能受體和/或拮抗α1a-腎上腺素能受體的式I化合物。此外，術語“有效劑量”也指一定量的能減輕與α1a-腎上腺素能受體有關的疾病癥狀的式I化合物。
本發(fā)明化合物可通過下述路線制備，其中一些反應路線制得一個以上的本發(fā)明實施方案。在這些情況下，反應路線的選擇在合成化學家的能力范圍內(nèi)。
其中R1是苯基、R2是氫、R3是氧、A是(CH2)3且m是4的式I化合物可如圖式1所示制得。在此圖式中，式I分子是在會聚合成法中制得的，其中該分子的兩半連接并最終偶合在一起。
制備其中一半的原料是1a型單N-取代的哌嗪。用弱堿如K2CO3和烷化劑如丙烯腈在惰性溶劑如MeOH中于室溫下將1a處理2-24小時，得到了腈1b?？捎肦ainy鎳作為催化劑將該中間體氫化，以生成丙胺中間體1c。用1c型化合物作為原料將式I分子的另一半連接。用強堿如NaH在惰性溶劑中于0℃將ε-己內(nèi)酰胺處理30分鐘。將生成的陰離子用烷化劑如溴乙酸叔丁酯在惰性溶劑如乙腈中于室溫下處理2小時-2天，以生成酯1e。在室溫下用酸如三氟乙酸將1e水解2-16小時，生成了酸1f。用肽偶合劑如BOP和合適的胺如DMAP在室溫下將胺1c和酸1f處理1-16小時，生成了式I化合物1g?？捎闷渌己蟿┐鍮OP。這種偶合劑包括但不限于PyBrop、EDCI、HOBt等。可代替DMAP的合適的物質(zhì)包括但不限于N-甲基嗎啉、咪唑、DABCO等。
路線1可用于制備除1g以外的化合物。為了制備其中m為1-5的化合物，在路線1中可用具有適當大小環(huán)的內(nèi)酰胺如2-氮雜環(huán)辛酮來代替ε-己內(nèi)酰胺。
路線1 為了制備其中R1不是苯氧基的化合物，用已知的苯基哌嗪衍生物如N-(2-叔丁氧基苯基)哌嗪代替1a。為了制備其中A是(CH2)n且n為1-6的化合物，可用烷化劑如4-氯丁腈代替丙烯腈?；蛘?，可通過路線2所示的另一反應路線制備中間體1c。
用弱堿和已知的苯二甲酰亞氨基衍生物如N-(4-溴丁基)鄰苯二甲酰亞胺處理哌嗪衍生物1a，以生成中間體2a。用肼如N-甲基肼在合適的溶劑如MeOH或EtOH中于回流狀態(tài)下處理2a，生成了1c型中間體?；蛘?，用弱堿和N-BOC保護的胺如N-叔丁氧基羰基-4-溴丁胺處理哌嗪1a，以生成相應的BOC保護的胺?？捎盟崛鏣FA將保護的胺脫保護，以生成1c型中間體。
路線2 為了制備其中R2不是氫的化合物，可采用路線3。用強堿如NaH，然后用烷化劑如芐基溴在約0-35℃將1g型化合物處理1-5小時，生成了3a型化合物。
路線3 其中R4是氧、C1-5烷基、甲酰基、羧基、C1-5烷基羰基、C1-5烷氧基羰基、苯基C1-5烷氧基、取代的苯基C1-5烷氧基、酰氨基、和取代的酰氨基的化合物可通過路線4合成。例如，為了制備其中R4是乙氧基羰基、m為2、且R3是羰基的化合物，用強堿如NaH在惰性溶劑中于0℃將2-吡咯烷酮-5-羧酸乙酯處理約30分鐘。用烷化劑如溴乙酸叔丁酯在惰性溶劑如乙腈中于室溫下將得到的陰離子處理2小時-2天，以生成酯4a。用三氟乙酸在室溫下將4a進行酸性水解2-16小時，生成了酸4b。用肽偶合劑如PryBOP將酸4b和中間體胺1c偶合，生成了式I化合物4c?？捎枚喾N試劑處理4c化合物的乙酯，以生成衍生物如酰胺、羧酸、醛等，其中所用試劑和反應條件在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。
路線4 雖然本發(fā)明要求保護的化合物能用作α1-AR的調(diào)節(jié)劑，但是其中一些化合物是優(yōu)選的或特別優(yōu)選的。優(yōu)選的本發(fā)明化合物包括
和 其中特別優(yōu)選的“R1”是C1-5烷基。
特別優(yōu)選的“R2”是氫、C1-5鏈烯基和C1-5鏈炔基。
特別優(yōu)選的“E”是 和 特別優(yōu)選的“m”是3。
特別優(yōu)選的R3是氧。
特別優(yōu)選的R4是氫。
特別優(yōu)選的“A”是(CH2)n，其中n為2-4。
特別優(yōu)選的式II化合物包括，其中A是2或3、R1是C2-6烷基、且R7是氫的化合物。
特別優(yōu)選的式III化合物包括其中m是3的化合物。
式I化合物可用在藥物組合物中來治療患有與調(diào)節(jié)α1-腎上腺素能受體活性有關的疾病的病人。優(yōu)選的給藥途徑是口服給藥，雖然本發(fā)明化合物也可以通過包括但不限于靜脈內(nèi)注射在內(nèi)的其它方法給藥。日口服劑量約為0.01-100mg/kg。優(yōu)選的日口服劑量約為0.05-1.0mg/kg。注射劑量可以為，抑制劑以0.001-100mg/kg/分鐘的速度與藥物載體一起給藥幾分鐘-幾天。
可用常規(guī)藥物賦形劑和混合技術制備藥物組合物?？诜┬涂梢允囚齽⑻菨{劑、膠囊、片劑等。其中典型的固體載體是惰性物質(zhì)，例如乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、甘露糖醇等；典型的液體口服賦形劑包括乙醇、甘油、水等。所有賦形劑可按照需要與崩解劑、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑等用制劑領域技術人員已知的常規(guī)技術混合。可用包括但不限于水或其它無菌載體在內(nèi)的可藥用載體或稀釋劑制備非腸道給藥劑型。
式I化合物一般以游離堿的形式分離和使用，然而也可以其可藥用鹽的形式分離和使用。可藥用鹽的實例包括但不限于氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、鹽酸鹽、高氯酸鹽、硫酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽、2-萘磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽，環(huán)己烷氨基磺酸鹽和己糖酸鹽。
具體實施例方式
下面用實施例闡明本發(fā)明。這些實施例不限制本發(fā)明。它們只表示實施本發(fā)明的方法。本領域技術人員可以找到對他們來說是顯而易見的實施本發(fā)明的其它方法。然而，這些方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
制備實施例實施例1 1-(2-苯二甲酰亞氨基乙基)-4-(2-異丙氧基苯基)哌嗪化合物1將N-(2-溴乙基)鄰苯二甲酰亞胺(7.6g，30mmol)和K2CO3(6.2g，45mmol)加到N-1-(2-異丙氧基苯基)哌嗪(6.6g，30mmol)的乙腈(100ml)溶液中，把所得混合物加熱回流2天。將混合物真空濃縮，并通過硅膠柱色譜法、以EtOAc/己烷(30∶70)作為洗脫劑純化，得到了固態(tài)的標題化合物MS m/z 394(MH+)。
實施例2 1-(2-氨基乙基)-4-(2-2-異丙氧基苯基)哌嗪化合物2將化合物1(7.5g，19mmol)的EOH(70ml)溶液在室溫下攪拌10分鐘。加入甲基肼(20ml)，將混合物加熱回流2.5小時。將混合物冷卻至室溫，通過過濾除去所得固體沉淀。將沉淀真空濃縮，得到了固態(tài)的標題化合物MS m/z 264(MH+)，該化合物無需純化即可使用。
實施例3 1-叔丁氧基羰基甲基-2-哌啶酮化合物3在0℃、攪拌狀態(tài)下，將95％的氫化鈉(1.67g，66mmol)加到δ-戊內(nèi)酰胺(5.95g，60mmol)的甲苯(100ml)溶液中，把所得懸浮液攪拌1小時。滴加溴乙酸叔丁酯(8.86ml，60mmol)，將反應混合物升至室溫并攪拌10小時。加入飽和NH4Cl水溶液，將得到的有機層依次用鹽水和水連續(xù)洗滌。合并有機層，干燥(Na2SO4)并真空濃縮，得到了化合物3，為油狀物。
實施例4 1-羧甲基-2-哌啶酮化合物4在通入N2、攪拌條件下，將三氟乙酸(15ml)加到化合物2(12.93g，61mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中。把混合物攪拌4小時，真空濃縮，得到了固態(tài)的標題化合物MS m/z 158(MH+)。
實施例5 化合物5
將化合物2(3.61g，23mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液加到化合物4(5.0g，19mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中。加入PyBroP(10.72g，23mmol)、DMAP(3.85g，31mmol)和N-甲基嗎啉(2.53ml，23mmol)，將混合物在室溫、通入N2下攪拌10小時。將所得混合物依次用一份碳酸氫鈉水溶液、鹽水和水洗滌。合并有機層，干燥(Na2SO4)并真空濃縮。將剩余物通過硅膠MPLC、以EtOAc/MeOH/三乙胺(90∶5∶5)作為洗脫液純化，得到了標題化合物，為油狀物MS m/z 403(MH+)。用等摩爾量的檸檬酸在乙酸乙酯中處理分離到的化合物，得到了標題化合物的檸檬酸鹽，為固體。
實施例6 化合物6在0℃、攪拌條件下，將氫化鈉(95％tech.10.6mg，0.44mmol)加到化合物5(140.5mg，0.35mmol)的THF(5ml)溶液中，把所得懸浮液攪拌30分鐘。滴加碘甲烷(0.37mmol)，將混合物在室溫下攪拌過夜。將剩余物真空濃縮，然后溶在乙酸乙酯中，并依次用氯化氨水溶液、鹽水和水連續(xù)洗滌。合并有機層，干燥(Na2SO4)并真空濃縮，得到了標題化合物，為固體MS m/z 417(MH+)。
生物學實施例通過下述體外試驗來證實本發(fā)明化合物的生物活性和選擇性。第一項試驗是測定式I化合物與膜結合受體α1a-AR、α1b-AR和α1d-AR結合的能力。
實施例14上述三種克隆的人α1-AR亞型的DNA序列已經(jīng)被公開。此外，克隆的cDNAs既在COS細胞中不穩(wěn)定地表達過，也在多種哺乳動物細胞系(Hela，LM(tk-)，CHO，rat-1成纖維細胞)中穩(wěn)定地表達過，并且已經(jīng)顯示保持有放射配體結合活性和結合磷酸肌醇水解的能力。我們使用公開的DNA序列信息來設計用于RT-PCR擴增上述每一種亞型的引物，來獲得克隆的cDNAs。人聚A+RNA可商購獲得，并包括已經(jīng)在文獻中引用的海馬和前列腺樣本來源。使用放射配體結合試驗進行初步篩選，該試驗使用通過在細胞中表達克隆的各種受體cDNAs而得到的膜制備物。對三種亞型都具有結合活性的(非選擇性的)放射標記配體是市售配體([125I]-HEAT，[3H]-哌唑嗪)。
通過標準逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法用聚A+RNA克隆每一種α1受體亞型。使用下述聚A+RNA來源來克隆α1受體亞型α1a-AR，人海馬和前列腺，α1b-AR，人海馬，α1d-AR，人海馬。將所得cDNAs克隆到pcDNA3哺乳動物表達載體(Invitrogen Corp.，San Diego CA)中。測定每一種DNA的序列，以證實和檢測在擴增過程中所引入的任何可能突變。對于每一種載體亞型，通過定點誘變來校正任何不同于所公開的共有序列的序列偏差。
使用采用氯喹休克的標準DEAE-葡聚糖操作將三種α1-AR亞型(a，b，d)轉染到COS細胞中。在此操作中，將每個組織培養(yǎng)皿(100mm)用3.5×106個細胞接種，并用10μg DNA轉染。轉染后約72小時，收集細胞，并制備COS膜。從25個培養(yǎng)皿(100mm)中刮出轉染的COS細胞，將細胞懸浮在15ml TE緩沖液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，PH7.4)中。用勻化器將懸浮液破裂。然后在4℃以1000×g的速度離心10分鐘。將上清液在4℃以34500×g的速度離心20分鐘。把離心小團在5ml TNE緩沖液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，PH7.4)中重懸。將所得的膜制備物制成等分試樣，并在-70℃貯藏。將膜用三硝基甲苯X-100增溶，然后測定蛋白濃度。
在受體結合試驗中測定每一種化合物與每一種α1-AR亞型結合的能力。使用是非選擇性α1-AR配體的[125I]-HEAT作為放射際記的配體。在96孔培養(yǎng)皿的每一孔中加入140μl TNE，25μl稀釋在TNE中的[125I]-HEAT(50000cpm；終濃度為50pM)10μl稀釋在DMSO中的測試化合物(終濃度為1pM-10μM)，25ml表達三種α1-AR亞型中其中一種的COS細胞制備物(0.05-0.2mg膜蛋白)。將培養(yǎng)皿在室溫培養(yǎng)1小時，把反應混合物通過Packard GF/CUnifilter濾板過濾。將濾板在真空烤箱中干燥1小時。把閃爍液(25ml)加到每一孔中，將濾板在Packard Topcount閃鑠計數(shù)器上計數(shù)。用Graphpad Prism軟件分析數(shù)據(jù)。
表A&B列出了所選的本發(fā)明化合物在所有受體亞型中的IC50值，其中IC50值是以納摩爾濃度表示的。
表A 化合物 R1A R2R4mα1a-AR α1b-AR α1d-AR5異丙基 CH2H H 38.7 461203726異丙基 CH2CH3H 353 763900 6507異丙基 CH2CH2CHCH2H 3103 172500 3728異丙基 CH2CH2(C)CH H 3237 170200 3589異丙基 CH2CH2Ph H 388 4226 34810 異丙基 CH2H CO2C2H5220 2631026011 異丙基 CH2H H418 3536 50512 CH3(CH2)2H H398 109000 30530″*″表示檸檬酸鹽表B 化合物RiAR2α1a-ARα1b-ARα1d-AR13i-prop CH2H 1041616 11實施例15通過下述篩選法來證實所選的式I化合物的拮抗活性。激動劑與α1-ARs結合會通過G-蛋白偶合機理而使PLC活化(Minneman和Esbenshade，1994)。PLC催化磷酯酰肌醇4，5-二磷酸酯(PIP2)水解，生成兩個二級信號分子，即肌醇1，4，5-三磷酸酯(IP3)和二?；视?DAG)，最終導致細胞內(nèi)存儲的鈣流動。在抑制放射配體與α1a-AR結合中表現(xiàn)出選擇性的初步篩選試驗結果被用來評價在穩(wěn)定地表達各種受體亞型的細胞系中拮抗胞質(zhì)鈣流動的能力。
表達各種受體亞型的穩(wěn)定細胞系的制備將pcDNA3載體中的α1腎上腺素能受體亞型(a，b，d)轉染到HEK 293s(人胚腎)細胞中，以形成穩(wěn)定的受體表達細胞系。轉染是用與2-3ug DNA混合的DMRIE-C(GibcoBRL)陽離子脂質(zhì)試劑和減少血清的OPTI-MEM1培養(yǎng)基(GibcoBRL)進行的。用脂質(zhì)-DNA復合物將100mm組織培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋，并在37℃、5％的CO2下培養(yǎng)5-6小時。然后加入含有血清的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，將每一培養(yǎng)皿按1∶5切割并加到含有250、300或350ug/ml G418(遺傳霉素)抗生素的選擇性培養(yǎng)基中。每隔4天用合適的選擇性培養(yǎng)基補充培養(yǎng)皿。約3周后，從300ug/ml G148選擇性培養(yǎng)基中挑取用于各種亞型的菌落。將菌落展開并冷凍。用整細胞受體結合試驗篩選用于α1腎上腺素能受體結合的各種亞型的12個細胞系。隨后通過鈣流動試驗來分析陽性培養(yǎng)物。
用胰蛋白酶將表達人α1a-AR的HEK 293s細胞升高，并用HBSS洗滌一次。用含有0.05％BSA的HBSS將細胞團狀物重懸至1-5×106個細胞/ml。將5mM的Fluo-3溶液(在2/3體積的DMSP和1/3體積的Pluronic酸中)加到細胞懸浮液中，使Fluo-3的終濃度為5μM。然后將細胞在輕微搖動的條件下于室溫、黑暗中培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后，將細胞用HBSS洗滌3次，然后懸浮在含有1.25mMCaCl2的HBSS中，使終濃度為0.7×106個細胞/ml。把細胞等分試樣(100μl)用移液管加到96孔微培養(yǎng)皿的每個孔中。在室溫下用去甲腎上腺素(10μM)誘導鈣流動。分析前2分鐘，用96孔移液器把拮抗劑加到細胞中。然后，加入激動劑，用FLIPR(Molecular Devices，USA)監(jiān)測熒光信號2-3分鐘?；衔?抑制胞質(zhì)內(nèi)鈣的流動，其IC50為99μM。
實施例16如下所述來證實本發(fā)明化合物越過主動脈組織對前列腺組織的拮抗活性和選擇性，以及它們的拮抗劑。在存在和不存在拮抗化合物其情況下測定大鼠前列腺組織和大鼠主動脈組織的收縮反應。作為拮抗作用選擇性的指標，比較測試化合物對血管平滑肌收縮性(α1a-AR和α1d-AR)的作用和對前列腺平滑肌(α1a-AR)的作用。將重275克的衍生自Long Evans的雄性大鼠通過拉頸處死，制備前列腺組織條和主動脈環(huán)。將前列腺組織以1克的張力置于10ml含有磷酸鹽緩沖鹽水、PH為7.4、溫度為32℃的浴器中，用壓力轉換器測定等長張力。將主動脈組織以2克的張力置于10ml含有磷酸鹽緩沖鹽水、PH為7.4、溫度為37℃的浴器中。測定測試化合物降低去甲腎上腺素誘導的收縮反應的能力，其中是以半數(shù)抑制濃度(IC50)表示測試化合物的能力?；衔?在主動脈組織中抑制收縮反應的IC50值是31.9μM，在前列腺組織中的IC50值是1.3μM。
實施例17在狗中測試所選的本發(fā)明化合物拮抗去氧腎上腺素(PE)誘導的尿道內(nèi)壓增加的能力。這些化合物的選擇性是通過與它們在狗中對PE誘導的平均動脈壓(MAP)的作用進行比較而證實的。
將雄性長耳短腿小獵犬麻醉并插入導管來測定前列腺尿道中的尿道內(nèi)壓(IUP)。用置于股動脈的導管測定平均動脈壓(MAP)。先將6個靜脈快速濃注劑量的(1到≤32mg/kg)去氧腎上腺素(PE)對狗給藥，以建立對照激動劑劑量-反應曲線。每次給藥后記錄IUP和MAP，直到IUP恢復到基準為止。然后將靜脈注射集團劑量的拮抗化合物對狗給藥，接下來將PE以如對照激動劑劑量-反應曲線所示的遞增劑量靜脈注射給藥，來與拮抗化合物競爭。每次PE給藥后，測定IUP和MAP。在以半對數(shù)遞增的3-300ug的劑量范圍內(nèi)測定拮抗化合物。拮抗劑給藥的時間間隔至少為5分鐘，對于每一測試化合物，每一劑量水平都進行3份試驗。附上的附

圖1和附圖2分別表示了化合物5和12分別使IUP和MAP降低的平均百分比。
其中附圖1表示化合物5在以10μg/kg的PE給藥的狗中對IUP和MAP的影響，而附圖2表示化合物12在以10μg/kg的PE給藥的狗中對IUP和MAP的影響。
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權利要求
1.式II化合物 其中A是(CH2)n，其中n是1-6；R1是支鏈C2-6烷基；苯基；取代的苯基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；苯基C1-5烷基；或取代的苯基C1-5烷基，其中苯基上的取代基獨立地選自一個或多個C1-5烷基，C1-5烷氧基和鹵素；R7是氫，BOC或CBZ。
2.根據(jù)權利要求1的化合物，其中n是2-4，且R1是支鏈C2-6烷基。
3.根據(jù)權利要求1的化合物，其中R7是氫或BOC。
4.一種化合物，該化合物選自1-(2-氨基乙基)-4-(2-2-異丙氧基苯基)哌嗪，1-(3-氨基丙基)-4(2-2-異丙氧基苯基)哌嗪，和1-(4-氨基丁基)-4-(2-2-異丙氧基苯基)哌嗪。
5.一種化合物，該化合物是1-(2-氨基乙基基)-4-(2-2-異丙氧基苯基)哌嗪。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(II)所示的芳基取代哌嗪，含有它們的藥物組合物，以及用于制備它們的中間體。本發(fā)明化合物能選擇性地抑制對與良性前列腺肥大有關的α－文檔編號C07D223/10GK1515563SQ20031010290
公開日2004年7月28日 申請日期1998年5月8日 優(yōu)先權日1997年5月12日
發(fā)明者L·喬利夫, W·默累, V·普利托, A·雷茨, 李曉冰, L·穆爾卡希, C·馬亞諾夫, F·維拉尼, L 喬利夫, ㄏ, 橋搗 申請人:奧索-麥克尼爾藥品公司