專利名稱：連續(xù)或分批加料方法中l(wèi)-苯丙氨酸甲酯和n-芐氧基羰基-l-天冬氨酸的酶促偶合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在反應(yīng)混合物中、通過N-芐氧基羰基-L-天冬氨酸(Z-Asp)和L-苯丙氨酸甲酯(L-PM)的高轉(zhuǎn)化酶促偶合制備N-芐氧基羰基-α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯(Z-APM)的方法，所述反應(yīng)混合物包括含水介質(zhì)、作為酶的中性蛋白酶和堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，其中形成沉淀物。
N-保護(hù)的α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯、尤其比如Z-APM是“強(qiáng)甜味劑”天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(以下稱之為APM)的重要前體，所述強(qiáng)甜味劑是一種具有約比蔗糖甜200倍的甜化能力，并且具有優(yōu)異的味道性能，而且沒有例如其它強(qiáng)甜味劑比如糖精和環(huán)己磺酸鹽的苦回味的產(chǎn)品。強(qiáng)甜味劑天冬氨酰苯丙氨酸甲酯可應(yīng)用于寬范圍的產(chǎn)品比如可用于軟飲料、糖果、“日常甜味劑”、藥品等。
該申請(qǐng)中所提及的Z-還應(yīng)理解為是指非極性質(zhì)的與Z-有關(guān)的任何保護(hù)基團(tuán)，比如例如是苯環(huán)被一個(gè)或多個(gè)烷基、烷氧基、?；螓u素取代的芐氧基羰基化合物。
在制備天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的已知方法中，酶促制備方法非常重要的原因主要是因?yàn)橐粤Ⅲw選擇性和區(qū)域選擇性方式發(fā)生酶促偶合。所討論的酶促偶合反應(yīng)是控制平衡的反應(yīng)。在現(xiàn)有的該酶促偶合反應(yīng)技術(shù)中，當(dāng)形成沉積物使平衡向合成側(cè)移動(dòng)時(shí)通常會(huì)實(shí)現(xiàn)高程度的轉(zhuǎn)化。
例如在US4165311A中解釋了平衡控制，通過N-保護(hù)的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、尤其是Z-APM的沉淀加成化合物的形成，可控制偶合反應(yīng)平衡向右側(cè)移動(dòng)，其中反應(yīng)混合物中存在D-或L-苯丙氨酸甲酯。天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前體的該加成化合物也可分別表示為Z-APM·D-PM或Z-APM·L-PM。
但是，該方法有許多缺點(diǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)中，為了形成加成化合物，理想的是進(jìn)行Z-Asp和L-PM的偶合反應(yīng)時(shí)L-PM的摩爾量至少是Z-Asp摩爾量的兩倍，或者是D-PM至少以等量存在。反應(yīng)后必須除去過量的成分，導(dǎo)致了額外的處理并且成本易變化。另一個(gè)缺點(diǎn)是，為了得到最終理想APM而進(jìn)行的對(duì)沉淀的加成化合物的處理和進(jìn)一步加工是費(fèi)力的。
EP-A-664338避免使用大量過量的L-PM或至少等量的D-PM，在該文獻(xiàn)所描述的酶促偶合反應(yīng)中，從開始即使用了為化學(xué)計(jì)量或幾乎為化學(xué)計(jì)量的Z-Asp和L-PM·HCl，并且其中也形成了大體上由Z-APM組成的沉積物。所述反應(yīng)在攪拌或搖動(dòng)條件下進(jìn)行，在作為酶的中性蛋白酶作用下進(jìn)行，反應(yīng)的初始pH值是4.5-6.0，并且在存在濃度約為3-25wt％的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的批處理反應(yīng)器或半連續(xù)條件下進(jìn)行。如果工藝在半連續(xù)條件下進(jìn)行，則僅可以連續(xù)地分離形成的沉積物，并且事實(shí)上以化學(xué)計(jì)量比以及與分離的沉積物之摩爾量相等的總量來(lái)供應(yīng)更多的原材料。
EP-A-664338所描述的工藝的缺點(diǎn)是盡管使用了化學(xué)計(jì)量或幾乎為化學(xué)計(jì)量的Z-Asp和L-PM·HCl，當(dāng)反應(yīng)在相對(duì)較高的pH、即例如5.8或更高的pH條件下進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)最初形成了其量?jī)H次于Z-APM的大量加成化合物Z-APM·L-PM，盡管該量小于施加大過量L-PM時(shí)的工藝所產(chǎn)生的量。反應(yīng)混合物中的Z-APM·L-PM形成了(共)沉淀物。由于形成加成化合物Z-APM·L-PM需要兩摩爾的L-PM與每摩爾的Z-Asp反應(yīng)，因此L-PM遠(yuǎn)比Z-Asp消耗的多，以致于在反應(yīng)過程中，溶液中Z-Asp∶L-PM的摩爾比可能明顯高于1∶1。已發(fā)現(xiàn)該高比率的Z-AspL-PM對(duì)Z-Asp的最大轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速率有負(fù)面影響。
當(dāng)反應(yīng)在較低的pH、例如約為5的pH下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，確實(shí)一定程度上避免了Z-APM·L-PM的形成，但是，在大多數(shù)情況下這并非是一個(gè)有吸引力的選擇，因?yàn)樵谌绱说偷膒H下由于低酶活性和高酶減活也會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度相對(duì)低。因此，很難在這樣的條件即a)Z-APM作為(幾乎是)唯一的沉淀物立即形成和b)得到合理的反應(yīng)速度下進(jìn)行。
本發(fā)明的目的是提供一種具有商業(yè)吸引力的Z-Asp和L-PM的酶促偶合方法，該方法可以以高的Z-Asp和L-PM轉(zhuǎn)化率直接得到Z-APM沉淀物，并且其具有高酶活性和低的酶減活，從而得到了有利的反應(yīng)速度。
令人驚訝的是，根據(jù)本發(fā)明，通過在連續(xù)或分批加料工藝中、在5.0-6.5的pH下、以1∶1-2∶1的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比并且其中Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比高于平均加料摩爾比的條件下進(jìn)行Z-Asp和L-PM的酶促偶合，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
特別令人驚訝的是，與EP-A-664338所述的批處理工藝的發(fā)現(xiàn)相反，Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比低至例如1.1∶1-1.6∶1之間時(shí)，立即形成了基本上全部由Z-APM組成的沉淀物，并且?guī)缀跬耆苊饬薢-APM·L-PM加成化合物(共)沉淀的形成，即使偶合反應(yīng)在相對(duì)高的pH例如高于5.8但低于6.5的pH下進(jìn)行亦如此。在如此高pH下進(jìn)行偶合反應(yīng)的可能性為得到高反應(yīng)速度和高原料轉(zhuǎn)化率提供了獨(dú)特的條件，而且直接形成Z-APM沉淀物也免去了如果形成Z-APM·L-PM時(shí)所必需的其它工藝步驟。
另外，應(yīng)指出的是，以本發(fā)明連續(xù)或分批加料工藝而進(jìn)行的反應(yīng)導(dǎo)致驚人低的酶減活。
JP-A-97248197描述了用于Z-Asp和L-PM偶合的批處理工藝，該工藝?yán)昧诉^量的Z-Asp、即Z-Asp∶L-PM摩爾比為2∶1-8∶1，優(yōu)選約4∶1。根據(jù)上述專利申請(qǐng)的描述，在Z-Asp過量的條件下進(jìn)行反應(yīng)可提供直接形成Z-APM的優(yōu)勢(shì)，而且反應(yīng)后需要回收的L-PM少并且在反應(yīng)過程中由于水解而損失的L-PM少。
盡管該實(shí)施方式確實(shí)導(dǎo)致了少的L-PM消耗，但是此時(shí)需要回收大量的過量Z-Asp，由此導(dǎo)致為了得到高Z-Asp生產(chǎn)量而進(jìn)行的其它附加反應(yīng)步驟。與此相反的是，本發(fā)明利用了低于2∶1的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比，并且由此顯著減少了待回收的過量Z-Asp的量。
本申請(qǐng)上下文所用的術(shù)語(yǔ)“Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比”是指在酶促偶合反應(yīng)過程中加入的Z-Asp的總量(摩爾)與酶促偶合反應(yīng)過程中加入的L-PM總量(摩爾)之間的比率。
術(shù)語(yǔ)“Z-Asp和L-PM的加料摩爾比”是指在某一時(shí)間或反應(yīng)過程中的某一段時(shí)間內(nèi)加入的Z-Asp量(摩爾)與L-PM量(摩爾)之間的比率。尤其是在反應(yīng)初始階段，加料摩爾比變化范圍可以很寬，但是在連續(xù)(或分批加料)工藝的連續(xù)加料階段通常其范圍處于所述平均加料摩爾比范圍內(nèi)，只要在工藝結(jié)束時(shí)，平均加料摩爾比亦在1∶1-2∶1之間。
術(shù)語(yǔ)“Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比”是指在某一時(shí)間或反應(yīng)過程中的某一段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)混合物中存在的“游離”Z-Asp量(摩爾)與“游離”L-PM量(摩爾)之比。
本申請(qǐng)中所用的連續(xù)工藝的定義是至少一種反應(yīng)物被連續(xù)地加入反應(yīng)器并且反應(yīng)混合物被連續(xù)地排出反應(yīng)器的工藝。本申請(qǐng)所用的連續(xù)工藝也可包括酶促偶合反應(yīng)不連續(xù)進(jìn)行的時(shí)間段，例如利用不排出反應(yīng)混合物的批處理或分批加料過程。利用批處理和/或分批加料過程作為連續(xù)工藝的一部分特別有利于啟動(dòng)工藝初始階段的反應(yīng)，并且有利于在反應(yīng)結(jié)束時(shí)完成轉(zhuǎn)化。申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)使系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的多種裝置和設(shè)備特性形式均可用于實(shí)施本發(fā)明的連續(xù)工藝。該反應(yīng)可在由不會(huì)對(duì)酶促偶合反應(yīng)產(chǎn)生不利影響的各種材料比如玻璃、不銹鋼等制成的反應(yīng)器中進(jìn)行。設(shè)備的尺寸可在大范圍內(nèi)變化。因此反應(yīng)可以以任何所需要的規(guī)模進(jìn)行。為了得到均勻的反應(yīng)混合物，在整個(gè)反應(yīng)混合物中Z-Asp和L-PM的實(shí)際濃度大致保持一致，優(yōu)選使用至少一個(gè)可實(shí)現(xiàn)充分混合的反應(yīng)器。充分混合的反應(yīng)器的例子是ContinuouslyStirredTankReactor(連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器)(CSTR)和反應(yīng)混合物在其中進(jìn)行循環(huán)的塔。基于經(jīng)濟(jì)原因特別使用一個(gè)或兩個(gè)充分混合的反應(yīng)器。使用三個(gè)或多個(gè)充分混合的反應(yīng)器可提供甚至更高的Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率，但是另一方面會(huì)導(dǎo)致高的投資成本并且使操作更費(fèi)力。最優(yōu)選使用兩個(gè)串聯(lián)的充分混合的反應(yīng)器，其優(yōu)于一個(gè)充分混合的反應(yīng)器之處在于使用較低的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比可得到相同的總持續(xù)時(shí)間和轉(zhuǎn)化率。當(dāng)利用至少一個(gè)充分混合的反應(yīng)器進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選工藝的進(jìn)行方式是在整個(gè)充分混合的反應(yīng)器中，產(chǎn)物濃度基本上一致并且約等于被排出的反應(yīng)混合物的產(chǎn)物濃度。例如為了完成轉(zhuǎn)化，可在(串聯(lián)的)充分混合的反應(yīng)器之后使用具有塞流行為的反應(yīng)器比如柱狀反應(yīng)器。如果使用兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)器，則反應(yīng)器可具有不同的反應(yīng)器體積。
本申請(qǐng)中所用的分批加料工藝的定義是至少一種反應(yīng)物被加入分批反應(yīng)器并且其中反應(yīng)混合物不被連續(xù)排出的工藝。優(yōu)選在反應(yīng)開始之前將至少一種反應(yīng)物加入反應(yīng)器，以便在反應(yīng)的初始階段產(chǎn)生大量過量的該反應(yīng)物。如果使用不止一個(gè)分批加料反應(yīng)器，此時(shí)它們被平行地操作。與連續(xù)工藝相反的是，在分批加料工藝中，反應(yīng)混合物的量(體積)隨著時(shí)間的增加而增加直至反應(yīng)停止。申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)使系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的多種裝置和設(shè)備特性形式均可用于實(shí)施本發(fā)明的分批加料工藝。該反應(yīng)可在由不會(huì)對(duì)酶促偶合反應(yīng)產(chǎn)生不利影響的各種材料比如玻璃、不銹鋼等制成的反應(yīng)器中進(jìn)行。設(shè)備的尺寸可在大范圍內(nèi)變化。因此反應(yīng)可以在任何所需要的規(guī)模下進(jìn)行。優(yōu)選分批加料反應(yīng)的進(jìn)行利用了高度反混工藝，更優(yōu)選在至少一個(gè)攪拌的分批反應(yīng)器中進(jìn)行。
在本申請(qǐng)范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“連續(xù)加料階段”是指及時(shí)地向反應(yīng)混合物中加入至少一種反應(yīng)物的階段，它可指連續(xù)和分批加料工藝。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比高于平均加料摩爾比。但是需要順便提及的是，特別是在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，在相對(duì)短的時(shí)間段內(nèi)可出現(xiàn)Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比低于加料平均摩爾比，而不會(huì)明顯影響反應(yīng)速度和/或產(chǎn)品質(zhì)量。優(yōu)選反應(yīng)過程的早期、即達(dá)到連續(xù)加料階段之前，Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比至少例如比平均加料摩爾比高10％，優(yōu)選至少高25％，最優(yōu)選至少高40％。
反應(yīng)組分的加料速度可在寬范圍內(nèi)變化。基于經(jīng)濟(jì)原因應(yīng)避免非常低的加料速度，因?yàn)榈图恿纤俣葧?huì)導(dǎo)致低產(chǎn)量。另一方面，也當(dāng)然應(yīng)該避免過高的加料速度、即超出反應(yīng)器容量的加料速度。也應(yīng)避免高的加料速度，因?yàn)橛捎跀嚢枘芰Σ蛔銜?huì)導(dǎo)致潛在的不均勻效果(被稱為熱點(diǎn))。
反應(yīng)器中所用的攪拌速度并不是很關(guān)鍵，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易使其最佳化。應(yīng)該避免太高的攪拌速度，因?yàn)樘貏e是在相當(dāng)高的漿液濃度下，該高攪拌速度可能會(huì)導(dǎo)致酶減活。另一方面，也應(yīng)該避免太低的攪拌速度，因?yàn)槿绱说偷臄嚢杷俣葧?huì)導(dǎo)致反應(yīng)混合物的不均勻性例如pH熱點(diǎn)，從而也導(dǎo)致了酶減活。
連續(xù)反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間或批加料反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間并不是很關(guān)鍵并且其可在寬范圍內(nèi)變化。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可使其最佳化。當(dāng)連續(xù)反應(yīng)中利用不止一個(gè)充分混合的反應(yīng)器時(shí)，對(duì)于每個(gè)獨(dú)立的充分混合的反應(yīng)器而言，可調(diào)整使其持續(xù)時(shí)間不同。
根據(jù)本發(fā)明，利用1∶1-2∶1的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。平均加料摩爾比低于1∶1可能會(huì)促進(jìn)形成過量的具有上述缺點(diǎn)的Z-APM·L-PM加合物。當(dāng)平均加料摩爾比高于2∶1時(shí)，在偶合反應(yīng)之后從反應(yīng)混合物回收的過量Z-Asp會(huì)不利地更高。在1∶1-2∶1的范圍內(nèi)時(shí)，過量的Z-Asp在轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率方面會(huì)導(dǎo)致最好的結(jié)果，而且當(dāng)在1∶1的情況下，一種或兩種未反應(yīng)原料的任何所需循環(huán)是最少的。優(yōu)選反應(yīng)在1.1∶1-1.6∶1之間的平均加料摩爾比下進(jìn)行反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，利用一個(gè)CSTR進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)，首先在批處理或批加料工藝中，以顯著高于2∶1的Z-Asp和L-PM的初始實(shí)際摩爾比使Z-Asp和L-PM反應(yīng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間直至達(dá)到連續(xù)進(jìn)料階段，從而形成Z-APM。當(dāng)已達(dá)到適當(dāng)水平的轉(zhuǎn)化并且工藝可穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化為連續(xù)工藝時(shí)、即當(dāng)Z-Asp和L-PM首先達(dá)到向Z-APM的轉(zhuǎn)化率約為55％或更大并且優(yōu)選游離Z-Asp和游離L-PM的實(shí)際摩爾比仍高于2∶1時(shí)，以1∶1-2∶1的平均加料摩爾比將Z-Asp和L-PM連續(xù)加入CSTR，并且持續(xù)該加料直至Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比低于2∶1，優(yōu)選低于6∶1為止。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，利用多于一個(gè)CSTR(串聯(lián))進(jìn)行相似的反應(yīng)。串聯(lián)使用的每一個(gè)CSTR中Z-Asp和L-PM的加料摩爾比不一定要相同。當(dāng)二個(gè)CSTR串聯(lián)使用時(shí)，優(yōu)選以相對(duì)高的[Z-Asp]/[L-PM]比將Z-Asp和L-PM加入第一反應(yīng)器。優(yōu)選將LPM與反應(yīng)器1的反應(yīng)混合物一起加入第二反應(yīng)器中，反應(yīng)器2的Z-Asp和L-PM的加料摩爾比應(yīng)使整個(gè)工藝的Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比低于2∶1，優(yōu)選低于6∶1。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，利用一個(gè)分批反應(yīng)器以批加料反應(yīng)形式進(jìn)行反應(yīng)。將Z-Asp和L-PM加入分批反應(yīng)器中，以使平均加料摩爾比為1∶1-2∶1并且至少在工藝的初始階段Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比高于2∶1，優(yōu)選至少直至已首次達(dá)到至少55％的轉(zhuǎn)化率為止。不同反應(yīng)物的加入方法可不同，并且可在反應(yīng)初始和/或反應(yīng)過程中同時(shí)加入部分材料，或在反應(yīng)過程中加入小部分材料，或逐步加入材料。優(yōu)選在反應(yīng)初期加入大量Z-Asp并且接著在反應(yīng)過程中分批加入L-PM。
反應(yīng)過程中pH是5.0-6.5?？啥虝r(shí)超出所述pH范圍而不會(huì)對(duì)結(jié)果有不良影響。但優(yōu)選使偶合過程中的pH維持在低于6.5的水平。更優(yōu)選pH維持在低于6.2并且最優(yōu)選低于6.0。pH低于5.0時(shí)，由于低酶活性，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量降低。優(yōu)選使用高于5.2的pH，更優(yōu)選pH高于5.5。在使用不止一個(gè)充分混合的反應(yīng)器的連續(xù)工藝時(shí)，在下一個(gè)反應(yīng)器中可使用不同的pH值。順便提及的是，應(yīng)指出pH的下限也可在有限程度上降低，這取決于所使用的酶。因此，例如當(dāng)使用低pH下比野生型酶性能佳的突變異種酶時(shí)，可實(shí)現(xiàn)更低的pH范圍下限例如3-5。
在偶合反應(yīng)過程中，可利用pKa在-10-+8之間、優(yōu)選pKa在-2-+7.5之間的酸來(lái)調(diào)整反應(yīng)混合物的pH。優(yōu)選在利用的反應(yīng)條件下，酸的使用僅導(dǎo)致極少或不導(dǎo)致酶的減活。該酸的合適實(shí)例是鹽酸和醋酸。最優(yōu)選使用醋酸。如果需要也可加入堿來(lái)調(diào)節(jié)pH。
在根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，可將有機(jī)酸緩沖劑及其共軛堿加入反應(yīng)混合物。合適的緩沖劑的實(shí)例是醋酸/醋酸鹽，丙酸/丙酸鹽、丁酸/丁酸鹽、檸檬酸/檸檬酸鹽、馬來(lái)酸/馬來(lái)酸鹽和鄰苯二甲酸/鄰苯二甲酸鹽。利用這些緩沖劑的優(yōu)點(diǎn)是pH變化較小，同時(shí)在反應(yīng)過程中仍可利用強(qiáng)酸和/或堿調(diào)節(jié)pH，這在沒有緩沖劑時(shí)很容易導(dǎo)致酶的減活。優(yōu)選使用醋酸/醋酸鹽緩沖劑，在反應(yīng)過程中可利用醋酸或鹽酸來(lái)調(diào)節(jié)pH。當(dāng)使用該緩沖劑時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡可能避免由于存在緩沖劑而增加Z-Asp的溶解度，因?yàn)檩^高的溶解度導(dǎo)致回收的Z-Asp沉淀物少。
在根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可通過將含原料的進(jìn)料溶液、例如含Z-Asp、L-PM·HCI和/或酶的進(jìn)料溶液之pH調(diào)整至所需要的值來(lái)調(diào)整反應(yīng)混合物的pH。
在本發(fā)明的工藝中利用了含水介質(zhì)。本申請(qǐng)文件中的術(shù)語(yǔ)“含水介質(zhì)”是指任何均勻的單相極性含水體系，它可含有少量(最高約30％)的有機(jī)溶劑比如甲醇、乙腈、醋酸、甲基異丁基酮(MIBK)和甲苯。
根據(jù)本發(fā)明，含水介質(zhì)含有一些堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，基于反應(yīng)混合物總重量的重量％計(jì)算時(shí)，優(yōu)選其量為3-25％。根據(jù)本發(fā)明的方法可利用各種堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽。適宜的實(shí)例是鉀、鈉、鋰和銨的鹵化物或硫酸鹽或其混合物。此時(shí)術(shù)語(yǔ)“銨”也是指被一個(gè)或多個(gè)C1-3烷基取代的銨；該取代的銨鹽的實(shí)例是氯化三乙銨、氯化三鉀銨、氯化二乙銨、氯化二甲銨等。涉及根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選是3-25wt％的重量百分比范圍時(shí)，相應(yīng)鹽的溶解度部分決定了潛在的應(yīng)用。堿金屬和銨鹽一般具有最好的溶解性并且優(yōu)選使用它們。特別優(yōu)選使用氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、氯化銨和/或硫酸銨。最優(yōu)選使用氯化鈉。
反應(yīng)體系中鹽含量越高，則轉(zhuǎn)化進(jìn)行的越快，同時(shí)不會(huì)對(duì)產(chǎn)率產(chǎn)生明顯的影響。但是在高含量時(shí)，很快就會(huì)增加體系的黏度，和/或一種或多種原料和/或鹽本身會(huì)超過溶解度極限，從而使得到的沉淀物被該原料或鹽不必要地污染了，由此導(dǎo)致反應(yīng)的轉(zhuǎn)化程度降低。超過25％重量時(shí)，體系的黏度實(shí)際上使反應(yīng)不可能進(jìn)行。反應(yīng)體系中鹽含量越低，則所需要的總反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，從而尤其是增加了L-PM的水解。在例如低于3wt％的低鹽濃度下，也對(duì)偶合產(chǎn)物的溶解度有不利影響。附帶提及的是，如果應(yīng)過早地沉積加成產(chǎn)物(Z-APM·L-PM)，這不會(huì)影響本發(fā)明的反應(yīng)，因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中在提及的具體條件下，平衡的移動(dòng)會(huì)導(dǎo)致該產(chǎn)物的所有部分或一部分轉(zhuǎn)化成Z-APM沉淀。優(yōu)選地，鹽含量是10-18重量％，因?yàn)樵诖朔秶鷥?nèi)可發(fā)現(xiàn)如下組合的最有利條件a)體系的黏度；b)原料的溶解度和最終產(chǎn)品的沉淀形成；c)反應(yīng)時(shí)間和d)Z-APM沉淀物的純度。
酶促偶合反應(yīng)通常在10-60℃的溫度下進(jìn)行。溫度越低，則偶合反應(yīng)和副反應(yīng)比如L-PM和Z-APM的水解反應(yīng)速度越低。溫度越高，則酶的減活發(fā)生的越快。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定所使用的酶應(yīng)選擇什么樣的溫度，以實(shí)現(xiàn)Z-APM轉(zhuǎn)化率和酶穩(wěn)定性方面的最佳效果。
利用中性蛋白酶來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的酶促偶合反應(yīng)。此時(shí)術(shù)語(yǔ)中性蛋白酶是指任何已知的中性蛋白水解的酶以及具有相當(dāng)?shù)幕蛏踔猎黾拥幕钚缘钠渫蛔儺惙N，所述蛋白水解的酶可用于由Z-Asp和L-PM來(lái)合成Z-APM。中性蛋白酶的實(shí)例包括金屬蛋白酶比如由Bacillus thermoproteolyticus產(chǎn)生的嗜熱菌蛋白酶以及特別是通過各種桿菌類，比如Bacillus stearothermophilus(嗜熱脂肪芽孢桿菌)，Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)，Bacillus cereus(蠟狀芽孢桿菌)，膠原酶等制造的其它蛋白酶。一般地，這些酶在約6-8的pH下顯示出最佳的蛋白酶活性，但是已發(fā)現(xiàn)當(dāng)在本發(fā)明的條件下利用這些酶時(shí)，在5.0to6.5、特別是5.2to6.2、尤其是5.5to6.0的初始pH也可達(dá)到好的效果，而且不需要利用過多量的酶。應(yīng)指出的是，存在少量的Ca2+離子一般對(duì)酶的穩(wěn)定性和活性具有有益的效果。
本發(fā)明的連續(xù)或批加料方法中，通常不改變或幾乎不改變酶的活性，這使得反應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的同時(shí)反復(fù)應(yīng)用酶。因此，特別是當(dāng)利用溶解的酶時(shí)，建議將由所獲得的沉淀物分離后得到的酶再用作酶促偶合反應(yīng)的酶。
偶合反應(yīng)所用的酶量并不是非常關(guān)鍵，但是所利用酶的量通常應(yīng)當(dāng)可在可接受的有限的時(shí)間段內(nèi)得到高轉(zhuǎn)化率。一般地，占反應(yīng)混合物總量為0.08-1.5重量％、優(yōu)選0.15-0.75重量％的酶量(此時(shí)理解為具有所討論的酶活性的蛋白質(zhì)，即所謂的活性蛋白質(zhì))是適宜的。如果酶量是基于所用的(干)酶制劑總量、即活性蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)以及其它輔助劑比如鹽的總量給出時(shí)，此時(shí)所提及的百分?jǐn)?shù)一般相當(dāng)于約0.5-10％或優(yōu)選的1-5％。酶通常被用作酶制劑，并且市售得到的也是酶制劑。通常該酶制劑中活性蛋白質(zhì)的量約為制劑重量的15％。
根據(jù)本發(fā)明的方法中，酶可以以任何適宜于該目的的形式、即以溶解的或固定的形式被使用。如果利用固定的酶催化劑，優(yōu)選固定的酶催化劑的顆粒尺寸和/或密度明顯不同于Z-APM沉淀物的顆粒尺寸和密度，從而便于分離沉淀物的同時(shí)使酶保持于反應(yīng)介質(zhì)中。優(yōu)選使用將酶制劑溶解于反應(yīng)介質(zhì)中得到的溶解酶，因?yàn)檫@在分離所得Z-APM沉淀物并且進(jìn)一步處理它以及在生物催化劑本身的重復(fù)利用方面有優(yōu)勢(shì)。如前所述，也可以利用所討論的酶的突變異種?？筛鶕?jù)所使用的酶活性來(lái)改變以上限定的酶量百分?jǐn)?shù)，當(dāng)然利用突變異種酶時(shí)亦如此。
盡管本申請(qǐng)中提及了L-苯丙氨酸甲酯(L-PM)，但是應(yīng)理解為也涉及由其得到的酸式鹽比如鹽酸鹽(L-PM·HCI)。盡管本申請(qǐng)中提及了N-芐氧基羰基-L-天冬氨酸(Z-Asp)，但是應(yīng)理解為也涉及由其得到的鹽比如二鈉鹽(Z-Asp·二Na)。很明顯，當(dāng)利用其酸式鹽替代L-PM和/或利用其鹽替代Z-Asp時(shí)，必須在有限程度內(nèi)調(diào)節(jié)所用的化學(xué)試劑的量，以得到所需要的pH。
Z-Asp和L-PM原料的濃度可在寬范圍內(nèi)變化，并且它們?nèi)Q于這些材料在反應(yīng)混合物中的溶解度。但是，只要尚未達(dá)到連續(xù)進(jìn)料階段，存在少量未溶解的原材料不會(huì)影響反應(yīng)進(jìn)程。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，回收未轉(zhuǎn)化的Z-Asp。在離開偶合反應(yīng)器之后并且任選地在例如利用超濾除去酶之后，可隨后對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行低pH下的萃取處理，也就是在低于例如4的pH下、利用不與水混溶的有機(jī)溶劑例如酯、酮、任選被取代的脂族或芳族烴、優(yōu)選甲苯或MIBK作為萃取液，將反應(yīng)混合物中的至少一部分Z-Asp萃入有機(jī)溶劑中成為游離二酸。之后，可利用足量的堿將Z-Asp由有機(jī)相中反萃為其鹽。接著可將含有Z-Asp鹽的水溶液循環(huán)至反應(yīng)工藝中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使萃取和反萃工藝最佳化。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在酶促偶合反應(yīng)中可將少量有機(jī)溶劑加入反應(yīng)混合物。已驚人地發(fā)現(xiàn)，存在該有機(jī)溶劑可明顯降低酶的減活速度。適用于該目的的有機(jī)溶劑是與水不互溶的溶劑例如甲苯、MIBK及其混合物。優(yōu)選所使用的有機(jī)溶劑與回收Z(yǔ)-Asp所用的有機(jī)溶劑相同。甲苯最優(yōu)選，因?yàn)樵跉浣庾饔弥衅浔粡腪基團(tuán)釋放，從而它不是工藝體系中前所未有的化合物。
將參考以下的實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，但并非是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)驗(yàn)程序在所有情況下均使用市售可得的野生型嗜熱菌蛋白酶(得自Amano)作為酶。以下實(shí)施例中，每種情況下均基于所利用的酶制劑量來(lái)計(jì)算具體的酶濃度和最初的酶活性。
利用凝膠過濾的高性能液體色譜(凝膠過濾的HPLC)來(lái)確定實(shí)施例1-4所述的Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率程度，該HPLC利用254nm下的UV-分光光度計(jì)檢測(cè)，它使用的柱填充了TSK-Ge1G2000SW和作為洗提液的0.15M醋酸鹽緩沖的乙腈/水70/30(v/v)，其pH為5.6并且溫度是25℃。
利用反相HPLC來(lái)分析酶的量，該反相HPLC利用280nm下的UV-分光光度計(jì)檢測(cè)，它使用的柱填充了TSK-Ge1Pheny1-5PWRP。用于洗提液的梯度為A0.15M醋酸鈣緩沖的pH＝6的乙腈/水5/95(v/v)和B0.15M醋酸鈣緩沖的pH＝6的乙腈/水60/40(v/v)。梯度0-4分鐘A/B＝90/10恒定；4-10分鐘6分鐘內(nèi)線性變化A/B＝90/10-40/60。
以不會(huì)對(duì)反應(yīng)結(jié)果有明顯影響的方式從反應(yīng)混合物中取出樣品。在對(duì)比例A中，樣品立即被甲醇吸收，以停止酶促反應(yīng)，并且在分析之前在低溫下保存(通過自動(dòng)注入洗提液的連續(xù)流)。在實(shí)施例1-4的情況下，樣品被用于HPLC的洗提液稀釋。
在所有實(shí)施例中對(duì)初始反應(yīng)混合物的描述包括它們的濃度[Z-Asp]、[L-PM]、[Ca2+]、[NaCl]和[酶]。除非有其它的注釋，則按照以下方式制備混合物-將固體Z-Asp和NaCl溶解于NaOH水溶液中(“Z-Asp.Na溶液”，NaOH∶Z-Asp＝1.7mol/mol)。
-將固體L-PM.HCl溶解于少量水中(pH約為3.5的“L-PM.HCl溶液”)-在攪拌條件下緩慢地將Z-Asp.Na加入L-PM.HCl溶液，并且利用NaOH水溶液將pH大致調(diào)整至所需要的值-向該混合物中加入酶和CaCl2的水溶液-最后，利用NaOH水溶液將pH調(diào)整至最終(初始)值。
對(duì)比實(shí)施例A批反應(yīng)制備的溶液含有[Z-Asp]＝0.74mol/kg[L-PM]＝0.65mol/kg[酶]＝3.8wt％[NaCl]＝13.0wt％pH＝5.3。
在40℃下攪拌(75rpm)該溶液，并且利用16wt％的HCl水溶液將pH調(diào)整至5.3，而且在整個(gè)偶合反應(yīng)中保持該值。在約5小時(shí)的過程中，L-PM的轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時(shí)間的曲線以12.0％/h(作為一級(jí)系數(shù))的量線性增加，這相當(dāng)于5小時(shí)后L-PM的轉(zhuǎn)化率是40％。在形成沉淀物以后，間隔取樣幾次并且分析之。在所有的分析樣品中，固體似乎主要是Z-APM·L-PM。在5h-7h之間的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，轉(zhuǎn)化率的增加曲線彎曲下降，并且從7h(相當(dāng)于L-PM的轉(zhuǎn)化率是約45％)-30h(相當(dāng)于L-PM的轉(zhuǎn)化率是84％)轉(zhuǎn)化率與時(shí)間的曲線重新以1.8％/h的一級(jí)系數(shù)線性增加。從30h-44h轉(zhuǎn)化率增加減緩，但44h后又提供了96％的L-PM轉(zhuǎn)化率。
對(duì)比實(shí)施例A表明在反應(yīng)的初始階段形成了Z-APM·L-PM。由于為了形成Z-APM·L-PM而消耗了相對(duì)大量的L-PM，在5h之后留下了相對(duì)低濃度的“游離”L-PM，從而導(dǎo)致反應(yīng)變緩。在約7小時(shí)以后，留下了非常少量的“游離”L-PM，并且由Z-APM·L-PM釋放L-PM的速度決定了酶促反應(yīng)速度。在Z-Asp∶L-PM比率高達(dá)2∶1的情況下進(jìn)行反應(yīng)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了類似的情形。
實(shí)施例1在一個(gè)CSTR中的連續(xù)反應(yīng)，pH＝5.2
在該實(shí)施例中，利用了一個(gè)體積為5升的CSTR。開始的反應(yīng)是批處理反應(yīng)，之后進(jìn)行批加料反應(yīng)(加入了L-PM溶液)，并且最后通過既加入Z-Asp/酶溶液又加入L-PM溶液成為了連續(xù)反應(yīng)。
批處理方式的反應(yīng)(從0-17h)制備了具有以下成分的溶液，其中在最后的步驟中加入酶[Z-Asp]＝0.53mol/kg[L-PM]＝0.27mol/kg[酶]＝4.2wt％[NaCl]＝13wt％[Ca2+]＝8mmol/kg將混合物(總重量4.0kg)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器并且隨后在40℃下攪拌17h(攪拌速度為280rpm)。在該期間中，利用20wt％的HCl水溶液小心地將pH調(diào)節(jié)至5.2。取出一些樣品、過濾并且用小量水洗滌。在所有情況下固體中的Z-APM∶Z-APM·L-PM＞99∶1。
批加料反應(yīng)(從17-22h)在40℃下利用20wt％的HCl溶液將pH連續(xù)調(diào)節(jié)為5.2的條件下，以69g/h的加料速度將含以下物質(zhì)的溶液加入以上得到的混合物中[L-PM]＝2.0mol/kg[Ca2+]＝30mmol/kg。
在t＝22h、即緊接著批加料反應(yīng)之后，Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別已達(dá)到66％和90％。
連續(xù)反應(yīng)(從22-42h)將以下溶液連續(xù)加入以上得到的混合物中·一種溶液，它包括[Z-Asp]＝0.61mol/kg[酶]＝5wt％[NaCl]＝10wt％以193.4g/h的加料速度加入，和·一種溶液，它包括＝2.0mol/kg[Ca2+]＝30mmol/kg以44.6g/h的加料速度加入。
在40℃下攪拌該反應(yīng)混合物并且利用20wt％的HCl溶液將pH調(diào)節(jié)為5.2。保持時(shí)間是19h并且加料摩爾比Z-Asp/L-PM是1.33mol/mol。從22h-42h，Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化程度穩(wěn)定(分別為65％和90％)，并且酶的余量為常數(shù)(80％)。間隔取樣幾次并且過濾之；固體中[Z-APM]∶[Z-APM·L-PM]的比率＞98∶2。Z-APM的穩(wěn)定產(chǎn)量是34g/h(此時(shí)基于L-PM的產(chǎn)率是89％)。
實(shí)施例2高pH＝5.8下的批加料反應(yīng)，[NaCl]13wt％制備了起始溶液，它含有以下成分[Z-Asp]＝0.734mol/kg[L-PM]＝0.125mol/kg[NaCl]＝12wt％[酶]＝3.4wt％[Ca2+]＝7.8mmol/kg總重量2.50kgpH＝5.8在40℃下攪拌該反應(yīng)混合物49h，并且利用20wt％的HCl水溶液將pH連續(xù)調(diào)節(jié)為5.8。在該過程中加入L-PM的加料液([L-PM]＝2.0mol/kg)，加料速度是12.46g/h。Z-Asp和L-PM之間的平均加料摩爾比是1.17mol/mol。
在49h以后，當(dāng)加入了所有的L-PM·HCI加料液時(shí)，Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別為81.2％和96.1％)。余下的酶為約49％。該漿液用于實(shí)施例3(反應(yīng)器2)的連續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過分析由偶合漿液中取出的經(jīng)過濾和水洗滌的樣品可知，沉淀物似乎(幾乎)僅為Z-APM。
實(shí)施例3在2個(gè)CSTR中的連續(xù)反應(yīng)，pH＝5.8在該實(shí)施例中，利用了兩個(gè)體積為5升的CSTR。
在反應(yīng)器1中的批加料反應(yīng)制備混合物，它含有以下成分[Z-Asp]＝0.75mol/kg[L-PM]＝0.125mol/kg[NaCl]＝11wt％[酶]＝3.5wt％[Ca2+]＝10mmol/kg總重量3.49kg在40℃下攪拌該混合物24h。在該過程中加入L-PM·HCl加料液([PM]＝2.0mol/kg)，加料速度是29.79g/h。利用20wt％的HCl水溶液將pH控制在5.8。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別是69％和95％，并且余酶為94％。該漿液的體積是3.5升，這相當(dāng)于4.2kg。
反應(yīng)器1中的連續(xù)反應(yīng)向該漿液中同時(shí)加入以下兩種溶液·以163.4g/h的加料速度加入Z-Asp/酶溶液(其pH被調(diào)節(jié)至6.5)，該溶液含有[Z-Asp]＝0.80mol/kg，[酶]＝3.5wt％和[Ca2+]＝10mmol/kg·以46.6g/h的加料速度加入L-PM·Hcl溶液，它含有[L-PM]＝2.0mol/kg。
向漿液中同時(shí)加入這些溶液的起始時(shí)刻被稱為t＝0。在40℃下攪拌該混合物并且利用20wt％的HCl水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。保持時(shí)間是20h。產(chǎn)品流速是219g/h，收集之直至達(dá)到t＝24h。監(jiān)控反應(yīng)；發(fā)現(xiàn)連續(xù)反應(yīng)非常穩(wěn)定。Z-Asp/L-PM的轉(zhuǎn)化率分別恒定為68％和95％。
反應(yīng)器1和2中的連續(xù)反應(yīng)當(dāng)t＝24h，將該實(shí)施例2得到的一部分漿液(2.6kg)加入反應(yīng)器2中，用作使反應(yīng)器2開始的初始漿液。關(guān)閉反應(yīng)器的底部，因此此時(shí)沒有排出任何物質(zhì)。
反應(yīng)器1從t＝24時(shí)起，反應(yīng)器1就保持在穩(wěn)定態(tài)，不同的是，沒有收集從反應(yīng)器1排出的漿液，而是將其加入反應(yīng)器2。反應(yīng)器和所有溶液始終保持在40℃并且利用20wt％的HCl水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。加入反應(yīng)器1的原料量如下[Z-Asp]＝0.63mol/kg和[L-PM]＝0.45mol/kg，反應(yīng)器1的平均加料摩爾比是1.4∶1。酶濃度是2.7wt％。反應(yīng)混合物的總重是4.2kg。
反應(yīng)器1中的滯留時(shí)間是20h。
反應(yīng)器2除了反應(yīng)器中已存在的物質(zhì)和從反應(yīng)器1排出的連續(xù)流(參見以上的描述)外，還以7.7g/h的加料速度加入了含有[L-PM]＝2.0mol/kg的L-PM·HCI溶液。當(dāng)反應(yīng)器2中的漿液總重量達(dá)到4.35kg(相當(dāng)于3.6升的體積)時(shí)，開始從反應(yīng)器2中連續(xù)排出漿液。溫度始終保持在40℃并且利用20wt％的HCl水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。加入反應(yīng)器2的原料量如下[Z-Asp]＝0.60mol/kg和[L-PM]＝0.50mol/kg，反應(yīng)器2的平均加料摩爾比是1.2∶1。酶濃度是2.6wt％。反應(yīng)器2中的滯留時(shí)間是20h。
在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中(運(yùn)行至t＝100h)所有組分的濃度都非常穩(wěn)定。Z-Asp/L-PM的轉(zhuǎn)化率是常數(shù)(分別是82％和98％)并且反應(yīng)器中留存的酶是55％-60％。
該實(shí)施例表明pH＝5.8時(shí)在2個(gè)CSTR中進(jìn)行的1∶1連續(xù)偶合切實(shí)可行。但是，為了留存最大量的活性酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地使反應(yīng)條件最佳化，例如參見實(shí)施例4。
實(shí)施例4在2個(gè)CSTR中的連續(xù)反應(yīng)，pH＝5.8在該實(shí)施例中，利用了兩個(gè)體積為5升的CSTR。
在反應(yīng)器1中的批加料反應(yīng)制備混合物，它含有以下成分[Z-Asp]＝0.75mol/kg[L-PM]＝0.13mol/kg[NaCl]＝13.0wt％[酶]＝3.5wt％[Ca2+]＝10mmol/kg總重量3.5kg在40℃下攪拌(180rpm)該混合物48h。在該過程中加入L-PM·HCl加料液([L-PM]＝2.0mol/kg)，加料速度是15.0g/h。利用50wt％的AcOH溶液將pH控制在5.8。加入反應(yīng)器1的原料量如下[Z-Asp]＝0.623mol/kg和[L-PM]＝0.443mol/kg，加料摩爾比是1.4∶1。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率分別是70％和95％，并且余酶為91％。為了將該混合物轉(zhuǎn)化為用于反應(yīng)器1中連續(xù)偶合反應(yīng)的初始混合物，重新使酶量保持在100％。
反應(yīng)器1中的連續(xù)反應(yīng)向上述漿液中同時(shí)加入以下三種溶液。向漿液中同時(shí)加入這些溶液的起始時(shí)刻被稱為t＝0h。
1.以163.4g/h的加料速度加入Z-Asp/酶溶液，該溶液含有[Z-Asp]＝0.80mol/kg，[NaCl]＝14.5wt％[酶]＝3.5wt％[Ca2+]＝10mmol/kgpH＝6.0。
2.以46.6g/h的加料速度加入L-PM·Hcl溶液，它含有[L-PM]＝2.0mol/kg。
3.用于調(diào)節(jié)pH的少量50wt％醋酸水溶液。
加料摩爾比Z-Asp/L-PM是1.4mol/mol。在t＝0時(shí)還開始以210g/h的加料速度將反應(yīng)器1的排出物加入反應(yīng)器2(仍是空的)。反應(yīng)器體積是3.5升(4.2kg)。滯留時(shí)間是20h。在40℃下攪拌(速度是180rpm)混合物并且利用50wt％的醋酸水溶液將pH調(diào)節(jié)為5.8。
通過取樣并且分析[Z-Asp]、[L-PM]、[Z-APM]、[L-Phe]等來(lái)監(jiān)控反應(yīng)；發(fā)現(xiàn)連續(xù)操作非常穩(wěn)定達(dá)100h。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率幾乎分別恒定為66.5％和95.2％，并且余酶恒定為88.5％。
反應(yīng)器2中的連續(xù)反應(yīng)從t＝0開始，將反應(yīng)器1的漿液排入第2反應(yīng)器。在t＝22.5小時(shí)時(shí)，開始連續(xù)排出第2反應(yīng)器中的漿液。從t＝22h開始，將以下溶液加入反應(yīng)器21以7.7g/h的加料速度加入L-PM溶液([L-PM]＝2mol/kg)，2以24.3g/h的加料速度加入甲苯3.少量的50wt％醋酸水溶液以調(diào)節(jié)pH。
加料摩爾比[Z-Asp]/[L-PM]是1.2mol/mol。在40℃下攪拌(速度是180rpm)混合物并且利用50wt％醋酸水溶液將pH調(diào)節(jié)至5.8。滯留時(shí)間約為20h。通過取樣并且分析[Z-Asp]、[L-PM]、[Z-APM]、[L-Phe]等來(lái)監(jiān)控反應(yīng)；發(fā)現(xiàn)連續(xù)操作非常穩(wěn)定達(dá)100h。Z-Asp和L-PM的轉(zhuǎn)化率幾乎分別恒定為78.5％和97.7％，并且余酶一直恒定在88.0％。
權(quán)利要求
1.通過N-芐氧基羰基-L-天冬氨酸(Z-Asp)和L-苯丙氨酸甲酯(L-PM)在反應(yīng)混合物中的高轉(zhuǎn)化率酶促偶合制備N-芐氧基羰基-α-L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯(Z-APM)的方法，所述反應(yīng)混合物包括含水介質(zhì)、作為酶的中性蛋白酶和堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，其中形成沉淀物，所述方法的特征在于Z-Asp和L-PM的酶促偶合在連續(xù)或分批加料工藝中進(jìn)行，pH為5.0-6.5，Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比為1∶1-2∶1，并且其中Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比高于平均加料摩爾比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于酶促偶合在利用至少一個(gè)充分混合的反應(yīng)器的連續(xù)工藝中進(jìn)行。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于串聯(lián)使用兩個(gè)充分混合的反應(yīng)器。
4.權(quán)利要求1-3的任一方法，其特征在于Z-Asp和L-PM的平均加料摩爾比在1.1∶1-1.6∶1之間。
5.權(quán)利要求1-4的任一方法，其特征在于pH的范圍是5.5-6.0。
6.權(quán)利要求1-5的任一方法，其特征在于在偶合反應(yīng)過程中，利用酸、優(yōu)選醋酸來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH值。
7.權(quán)利要求1-6的任一方法，其特征在于反應(yīng)混合物含有緩沖液。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于緩沖液選自醋酸/醋酸鹽，丙酸/丙酸鹽、丁酸/丁酸鹽、檸檬酸/檸檬酸鹽、馬來(lái)酸/馬來(lái)酸鹽、鄰苯二甲酸/鄰苯二甲酸鹽緩沖液。
9.權(quán)利要求1-8的任一方法，其特征在于基于總反應(yīng)混合物的重量％計(jì)算時(shí)，堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的含量為3-25％。
10.權(quán)利要求1-9的任一方法，其特征在于酶促偶合反應(yīng)在10-60℃的溫度下進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1-10的任一方法，其特征在于在占反應(yīng)混合物總量為0.08-1.5重量％的酶(活性蛋白質(zhì))存在下進(jìn)行酶促偶合。
12.權(quán)利要求1-11的任一方法，其特征在于在偶合反應(yīng)過程中，將與水不混溶的有機(jī)溶劑加入反應(yīng)混合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于與水不混溶的有機(jī)溶劑是甲苯或甲基異丁基酮(MIBK)。
14.權(quán)利要求1-13的任一方法，其特征在于在達(dá)到連續(xù)加料階段之前，Z-Asp和L-PM的實(shí)際摩爾比至少比平均加料摩爾比高40％。
15.權(quán)利要求1-13的任一方法，其特征在于在偶合反應(yīng)之后，將反應(yīng)混合物過濾，以產(chǎn)生固體Z-APM和母液，在pH＜4的條件下利用有機(jī)溶劑對(duì)母液進(jìn)行萃取處理，其中至少部分Z-Asp被從母液萃入有機(jī)溶劑，接著以Z-Asp鹽的形式將Z-Asp反萃出有機(jī)溶劑而進(jìn)入pH＞4.5的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過N－芐氧基羰基－L－天冬氨酸(Z－Asp)和L－苯丙氨酸甲酯(L－PM)在反應(yīng)混合物中的高轉(zhuǎn)化率酶促偶合制備N－芐氧基羰基－α－L－天冬氨基－L－苯丙氨酸甲酯(Z－APM)的方法，該反應(yīng)混合物包括含水介質(zhì)、作為酶的中性蛋白酶和堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽，其中形成沉淀物，該方法的特征在于通過在連續(xù)或分批加料工藝中、在5.0－6.5的pH下，以1∶1－2∶1的Z－Asp和L－PM的平均加料摩爾比并且其中Z－Asp和L－PM的實(shí)際摩爾比高于平均加料摩爾比的條件下進(jìn)行Z－Asp和L－PM的酶促偶合。優(yōu)選基于反應(yīng)混合物總重量計(jì)算時(shí)，堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的存在量為3－25％。
文檔編號(hào)C07K5/072GK1514881SQ02811440
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月7日
發(fā)明者A·托庫(kù)達(dá), N·雅馬莫托, S·納卡穆拉, P·J·L·M·奎德弗里格, A 托庫(kù)達(dá), L M 奎德弗里格, 呂, 砟 申請(qǐng)人:荷蘭加甜劑公司