專利名稱：人源化抗-LT-β-R抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及特異性針對淋巴毒素β受體(LT-β-R)的人源化抗體。
背景技術(shù)：
淋巴毒素β受體(本文稱為LT-β-R)是腫瘤壞死因子家族的一員，已知其在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、以及包括濾泡樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的免疫系統(tǒng)多種細(xì)胞和多種基質(zhì)細(xì)胞的功能維持方面發(fā)揮作用(Matsumoto等，Immunol.Rev.156137(1997)。LT-β-R的已知配體包括LTα1/β2以及另一種稱為LIGHT的配體(Mauri等Immunity 821(1998))。有文獻(xiàn)表明，LT-β-R的活化包括一些癌細(xì)胞系的體內(nèi)凋亡性死亡(PCT/US96/01386)。用激動(dòng)型LT-β-R激活劑，如特異性人源化抗LT-β-R抗體進(jìn)行的治療，將因此可用于治療或減緩受試者(如，人)中瘤形成(neoplasia)的進(jìn)展、嚴(yán)重程度或影響。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了人源化抗淋巴毒素β受體(LT-β-R)的抗體以及應(yīng)用這些抗體治療或緩解受試者(如，人)中瘤形成的進(jìn)展、嚴(yán)重程度或影響的方法。
具體地，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合LT-β-R(如人LT-β-R)的人源化抗體。這種抗體包含由SEQ ID NO1中氨基酸殘基24-34，50-56和89-97所限定的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，和/或由SEQ ID NO2中氨基酸殘基31-35，50-66和99-109限定的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，并且在其輕鏈中包含下列的至少1種(例如，1，2，3，4，或5種)殘基K3，W41，I46，Q69和Y71；或在其重鏈中包含下列至少1種(例如1，2，3，4，或5種)殘基F37，T40，A49，M89和V93(按照Kabat編號原則進(jìn)行編號)。
本發(fā)明的人源化抗體可包含由SEQ ID NO8的氨基酸殘基1-107所限定的輕鏈可變區(qū)序列和/或由SEQ ID NO16的氨基酸殘基1-120所限定的重鏈可變區(qū)序列。所述人源化抗體還可包含與由細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)或細(xì)胞系E77.4(ATCC專利保藏物3765)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和/或輕鏈多肽序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體充分保留了親本抗體的結(jié)合特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體以一定的功能性親和力與LT-β-R結(jié)合，所述親和力是，例如，約1pM-約10pM，或者，約10pM-約20pM，或者，約20pM-約30pM，或者，約30pM-約40pM，或者，約40pM-約50pM，或者，約50pM-約60pM，或者，約60pM-約70pM，或者，約70pM-約80pM，以及，或者，約80pM-約90pM，所述功能性親和力按照實(shí)施例8所述用FACS進(jìn)行測定。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體與免疫毒素(例如，蓖麻毒蛋白A鏈和假單胞菌毒素)相連。本發(fā)明的人源化抗體還可與化療藥物(例如，阿霉素(Adriamycin)，5FU，長春花堿，放線菌素D，依托泊苷(Etoposide)，順鉑(Cisplatin)，氨甲蝶呤和阿霉素(Doxorubicin))或與放射性同位素相連。本發(fā)明還涉及一種聯(lián)合療法，其中例如，本發(fā)明的與免疫毒素相連的人源化抗體和本發(fā)明的與化療藥物相連的人源化抗體聯(lián)合使用。本發(fā)明還涉及一種適于對哺乳動(dòng)物(即人)給藥的組合物，所述哺乳動(dòng)物具有過度表達(dá)LTβR的腫瘤，所述組合物包含a)人源化抗LTβR抗體，單獨(dú)或與免疫毒素或與化療藥物相連，和b)細(xì)胞毒因子，每種均以通過對哺乳動(dòng)物給藥而有效減小腫瘤體積的量存在。細(xì)胞毒因子可以包含例如，TNF-α，TNF-β，IL-1，INF-γ，IL-2?；蛘撸?xì)胞毒因子可以是一種化療藥物。該化療藥物可以包含例如，阿霉素，5FU，長春花堿，放線菌素D，依托泊苷，順鉑，氨甲蝶呤和阿霉素。
本發(fā)明的抗體可以是，例如，任何同種型和亞型的完整抗體(即具有兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈)(例如IgM，IgD，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgE，IgA1和IgA2)；或者，它可以是完整抗體的抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab’)2，和Fv)。
本發(fā)明涉及的還有，一種組合物，該組合物包含可藥用載體；一種分離的核酸，該核酸包含編碼SEQ ID NO8的序列；一種分離的核酸，該核酸包含編碼SEQ IDNO16的序列；一種分離的核酸，該核酸包含編碼抗體輕鏈的序列，該抗體由細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)或細(xì)胞系E77.4(ATCC專利保藏物3765)產(chǎn)生；一種分離的核酸，該核酸包含編碼抗體重鏈的序列，該抗體由細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)或細(xì)胞系E77.4(ATCC專利保藏物3765)產(chǎn)生；一種分離的核酸，該核酸包含編碼SEQ ID NO8的1-107殘基的序列；和一種分離的核酸，該核酸包含編碼SEQ ID NO16的1-120殘基的序列。
本發(fā)明中涉及的還有，產(chǎn)生人源化抗LTβR抗體的細(xì)胞系的細(xì)胞，所述細(xì)胞系包括，例如，細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)和細(xì)胞系E77.4 (ATCC專利保藏物3765)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞系產(chǎn)生約250mg/L-約300mg/L所述抗體，或者，所述細(xì)胞系產(chǎn)生約300mg/L-約350mg/L所述抗體，或者，所述細(xì)胞系產(chǎn)生約350mg/L-約400mg/L所述抗體，或者，所述細(xì)胞系產(chǎn)生約400mg/L-約450mg/L所述抗體，或者，所述細(xì)胞系產(chǎn)生約450mg/L-約500mg/L所述抗體，或者，所述細(xì)胞系產(chǎn)生約500mg/L-約550 mg/L所述抗體，或者，所述細(xì)胞系產(chǎn)生約550mg/L-約600mg/L所述抗體。所述細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體的濃度可以是補(bǔ)料分批培養(yǎng)10天后所測定的收獲物的滴度。
本發(fā)明還提供了一種治療或緩解受試者(例如，人)中瘤形成的進(jìn)展、嚴(yán)重程度或影響的方法，該方法包括以有效量的本發(fā)明抗體對受試者給藥。組合物的有效量可以以一或多劑量給藥。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療或緩解受試者(例如，人)中瘤形成的進(jìn)展、嚴(yán)重程度或影響的方法，該方法包括以有效量的本發(fā)明抗體和細(xì)胞毒素因子對受試者給藥。細(xì)胞毒素因子可包括例如，TNF-α，TNF-β，IL-1，INF-γ，IL-2?；蛘?，細(xì)胞毒素因子可以是化療藥物?；熕幬锟砂ɡ?，阿霉素，5FU，長春花堿，放線菌素D，依托泊苷，順鉑，氨甲蝶呤和阿霉素。


圖1顯示對于WiDr細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。mCBE11(鼠)(鉆石形)，huCBE11#2(人源化抗LT-β-R抗體，含第二種輕鏈(VL#2)和第二種重鏈(VH#2))(圓形)，huCBE11#4(人源化抗LT-β-R抗體，含第三種輕鏈(VL#3)和第四種重鏈(VH#4))(星形)。
圖2顯示IL-8對A375細(xì)胞的激動(dòng)作用(agonism)。mCBE11(鉆石形)，huCBE11#2(人源化抗LT-β-R抗體，含第二種輕鏈(VL#2)和第二種重鏈(VH#2))(圓形)，huCBE11#4(人源化抗LT-β-R抗體，含第三種輕鏈(VL#3)和第四種重鏈(VH#4))(星形)。
圖3顯示腫瘤體積相對于給藥天數(shù)。mCBE11(三角形)，huCBE11#4(人源化抗LT-β-R抗體，含第三種輕鏈(VL#3)和第四種重鏈(VH#4))(圓形)，未經(jīng)治療(方形)。
圖4顯示動(dòng)物存活百分比相對于腫瘤注射后天數(shù)。mCBE11(三角形)，huCBE11#4(人源化抗LT-β-R抗體，含第三種輕鏈和第四種重鏈)(圓形)，未經(jīng)處理(方形)。
圖5顯示腫瘤體積相對于注射后天數(shù)。HuCBE11#4(人源化抗LT-β-R抗體，含第三種輕鏈(VL#3)和第四種重鏈(VH#4))(圓形)和與未經(jīng)處理的對照(方形)。
圖6顯示腫瘤的預(yù)生長體積相對于處理后的天數(shù)。對照(方形)；huCBE11#4(人源化抗LT-β-R抗體，含第三種輕鏈(VL#3)和第四種重鏈(VH#4))于不同劑量500ug(圓形)，100ug(三角形)，和20ug(鉆石形)；mCBE11(十字形)。
圖7顯示帶有預(yù)生長腫瘤的動(dòng)物的存活百分比相對于處理后的天數(shù)。對照(方形)；huCBE11#4(人源化抗LT-β-R抗體，含第三種輕鏈(VL#3)和第四種重鏈(VH#4))于不同劑量500ug(圓形)，100ug(三角形)，和20ug(鉆石形)；mCBE11(十字形)。
圖8顯示平均熒光強(qiáng)度相對于huCBE11#4濃度的對數(shù)(1og)。
發(fā)明詳述序列識別號在說明書中提到的核苷酸和氨基酸序列給出下列序列識別號SEQ ID NO1-mCBE11重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
SEQ ID NO2-mCBE11輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
SEQ ID NO3-人源化CBE11輕鏈可變區(qū)(version 1-VL#1)核酸序列。
SEQ ID NO4-人源化CBE11輕鏈可變區(qū)(version 1-VL#1)氨基酸序列。
SEQ ID NO5-人源化CBE11輕鏈可變區(qū)(version 2-VL#2)核酸序列。
SEQ ID NO6-人源化CBE11輕鏈可變區(qū)(version 2-VL#2)氨基酸序列。
SEQ ID NO7-人源化CBE11輕鏈可變區(qū)(version 3-VL#3)核酸序列。
SEQ ID NO8-人源化CBE11輕鏈可變區(qū)(version 3-VL#3)氨基酸序列。
SEQ ID NO9-人源化CBE11重鏈可變區(qū)(version 1-VH#1)核酸序列。
SEQ ID NO10-人源化CBE11輕鏈可變區(qū)(version 1-VH#1)氨基酸序列。
SEQ ID NO11-人源化CBE11重鏈可變區(qū)(version 2-VH#2)核酸序列。
SEQ ID NO12-人源化CBE11重鏈可變區(qū)(version 2-VH#2)氨基酸序列。
SEQ ID NO13-人源化CBE11重鏈可變區(qū)(version 3-VH#3)核酸序列。
SEQ ID NO14-人源化CBE11重鏈可變區(qū)(version 3-VH#3)氨基酸序列。
SEQ ID NO15-人源化CBE11重鏈可變區(qū)(version 4-VH#4)核酸序列。
SEQ ID NO16-人源化CBE11重鏈可變區(qū)(version 4-VH#4)氨基酸序列。
SEQ ID NO17-FR1引物，用于引入Bsu36I位點(diǎn)。
SEQ ID NO18-FR2引物，用于引入NciI和HpaII位點(diǎn)。
SEQ ID NO19-FR3引物，用于引入Bsu36I和PstI位點(diǎn)。
SEQ ID NO20-FR2引物，用于引入SmaI位點(diǎn)。
SEQ ID NO21-FR3引物，用于引入PvuI位點(diǎn)。
SEQ ID NO22-FR2引物，用于引入SmaI和HhaI位點(diǎn)。
SEQ ID NO23-FR3引物，用于引入PvuII和FspI位點(diǎn)。
SEQ ID NO24-FR1引物，用于引入Hinfl和NsiI位點(diǎn)。
SEQ ID NO25-FR2引物，用于引入HaeII和HhaI位點(diǎn)。
SEQ ID NO26-FR3引物，用于引入Bsu36I，DdeI和PstI位點(diǎn)。
SEQ ID NO27-FR1引物，用于引入EcoRV位點(diǎn)。
SEQ ID NO28-FR3引物，用于引入RsaI位點(diǎn)。
SEQ ID NO29-FR1引物，用于引入EcoRV位點(diǎn)。
SEQ ID NO30-FR2引物，用于引入HindIII位點(diǎn)。
SEQ ID NO31-FR3引物，用于引入RsaI位點(diǎn)。
SEQ ID NO32-完整huCBE11輕鏈(version3)，包含恒定區(qū)。
SEQ ID NO33-完整huCBE11重鏈(version4)，包含恒定區(qū)。
定義本文中術(shù)語人源化抗體是指衍生自非人抗體(通常衍生自鼠)的抗體，其保留或充分保留了親本抗體的抗原結(jié)合特性，但在人體內(nèi)具有更小的致免疫性。
本文中術(shù)語互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是指多個(gè)氨基酸序列，它們共同限定了天然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)的結(jié)合親和力和特異性，如Kabat等描繪(1991)。
本文中術(shù)語框架區(qū)(FR)，是指位于CDR之間的氨基酸序列?？贵w的這些部分起到使CDR保持適當(dāng)方位(從而使CDR可以結(jié)合抗原)的作用。
本文中術(shù)語恒定區(qū)(CR)，是指抗體分子中賦予效應(yīng)功能的部分。在本發(fā)明中，鼠的恒定區(qū)被人的恒定區(qū)取代。本發(fā)明中嵌合抗體或人源化抗體的恒定區(qū)衍生于人的免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可選自5種同種型之一α，δ，ε，γ或μ。另外，不同亞類的重鏈(例如重鏈的IgG亞類)負(fù)責(zé)不同的效應(yīng)功能并因此，通過挑選所需重鏈恒定區(qū)，可以產(chǎn)生具有所需效應(yīng)功能的抗體。優(yōu)選的恒定區(qū)是γ1(IgG1)，γ3(IgG3)和γ4(IgG4)。更優(yōu)選的是γ1(IgG1)同種型的Fc區(qū)。輕鏈恒定區(qū)可以具有κ或λ型，優(yōu)選具有κ型。
本文中術(shù)語嵌合抗體是指包含源自于兩種不同抗體(通常為不同種類)的序列的抗體。最通常地，嵌合抗體包含人和鼠的抗體片段，一般包含人的恒定區(qū)和鼠的可變區(qū)。
本文中術(shù)語致免疫性是指靶向蛋白或治療性半分子給藥至受體時(shí)激發(fā)免疫應(yīng)答(體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞免疫應(yīng)答)的能力。本發(fā)明涉及人源化抗體的致免疫性。
致免疫性降低的人源化抗體是指相對于親本抗體(例如，鼠抗體)致免疫性降低的人源化抗體。
充分保留了親本抗體的結(jié)合特性的人源化抗體是指，保留了特異性結(jié)合抗原的能力的人源化抗體，所述抗原是由產(chǎn)生這類人源化抗體的親本抗體所識別的。優(yōu)選這種人源化抗體顯示與親本抗體相同或基本相同的抗原結(jié)合親和力和親合力。理想地，該抗體的親和力不低于親本抗體親和力的10％，更優(yōu)選不低于約30％，最優(yōu)選不低于50％。分析抗原結(jié)合親和力的方法在本領(lǐng)域眾所周知，包括半量最大結(jié)合試驗(yàn)，競爭試驗(yàn)，和Scatchard分析。在本申請中描述了適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合試驗(yàn)。
本發(fā)明涉及結(jié)合人LT-β-R的人源化單克隆抗體和它們作為治療藥物的用途。本發(fā)明還涉及了編碼所述人源化抗體的核酸序列，和它們在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)。更具體的，本發(fā)明涉及源自與人LT-β-R特異性結(jié)合的鼠CBE11的人源化抗體。
鼠CBE11(mCBE11)是從用人LT-β-R-Ig融合蛋白免疫的小鼠中分離的鼠IgG1、κ抗體(Browning等，J.Immunol.15433(1995))。mCBE11能在體外和體內(nèi)激活LT-β-R(PCT/US96/01386)，對它的分離和抗腫瘤特性已有報(bào)道(Browning等J.Exp.Med.183867(1996)。產(chǎn)生mCBE11的雜交細(xì)胞系已經(jīng)由本發(fā)明的申請人根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為HB 11793(PCT/US96/01386)。申請人還顯示，LT-β受體與不同的激動(dòng)型抗LT-β-R抗體的交聯(lián)可激活LT-β受體(即它能模擬天然配體的效果)(PCT/US96/01386)。受體的激活在表達(dá)LT-β受體的各種體內(nèi)腫瘤模型中抑制腫瘤的生長。LT-β受體在多種癌細(xì)胞上表達(dá)，包括例如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NSCLC)，結(jié)直腸癌細(xì)胞(CRC)，乳腺癌細(xì)胞，以及前列腺，胃(gastric)，皮膚，胃部(stomach)，食道和膀胱癌細(xì)胞?？杀患?dòng)型LT-β-R抗體抑制的腫瘤的非限定性實(shí)例包括以下實(shí)體瘤HT29結(jié)腸腺癌，HT3宮頸癌，A375黑素瘤，MDA-231乳腺癌和原發(fā)性結(jié)腸癌。因此，激動(dòng)型LT-β-R抗體具有使得它可用于治療疾病的特性，所述治療是指需要激活LT-β-R和/或調(diào)節(jié)LT-β-R/LT-β-R配體相互作用的那些治療，包括例如治療或緩解受試者(例如，人)瘤形成的惡化，嚴(yán)重性或影響。
本發(fā)明描述了mCBE11單克隆抗體的人源化，包括充分保留該mCBE11單克隆抗體的結(jié)合特性所必需的建模分析以及回復(fù)突變。
小鼠可變區(qū)的建模分析CDR包含最有可能結(jié)合抗原的殘基，且必須保留在再成形抗體中。CDR由Kabat等的序列定義，參見Sequence of Proteins of Immunological Interest，5thEdition，The United States Department of Health和Human Services，TheUnited States Government Printing Offce，1991。CDR分為多個(gè)規(guī)范的類別(Chothia et al，1989 Nature，342，877-883)，在這些類別中，關(guān)鍵殘基很大程上決定了CDR環(huán)的結(jié)構(gòu)性構(gòu)象。這些殘基幾乎總是保留在再成形抗體中。mCBE11的輕鏈可變區(qū)的多肽序列如下所示，CDR以下劃線表示，殘基位置編號根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)指定1 DIKMTQSPSSMYASLGERVT ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP41 WKSPKILIYYATRLADGVPS RFSGSGSGQDYSLTISSLES81 DDTATYYCLQHGESPWTFGG GTKLEIK(SEQ ID NO1)mCBE11的重鏈可變區(qū)的多肽序列如下所示，CDR以下劃線表示，殘基位置編號根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)指定1 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWFRQT41 PEKRLEWVATISDGGSYTYYPDSVKGRFTI SRDNAKNNLY81 LQMSSLKSEDTAMYYCVREENGNFYYFDYW GQGTTVTVSS(SEQ ID NO2)mCBE11的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)使用FASTA程序，與小鼠和人各亞組的共有序列作比較(Johnson，G.，Wu，T.T.Kabat Database和itsapplicationsfuture directions Nucleic Acid Research，29，205-206，2001；Wu和Kabat，J.Exp.Med.132211-250(1970))。mCBE11輕鏈可變區(qū)是小鼠亞組V的一個(gè)成員，在110個(gè)氨基酸的重疊部分中具有74％的同一性，mCBE11重鏈可變區(qū)是小鼠亞組IIId的一個(gè)成員，在132個(gè)氨基酸的重疊部分中具有79％的同一性。輕鏈可變區(qū)與人亞組I相對應(yīng)，在113個(gè)氨基酸的重疊部分具有66％的同一性。重鏈可變區(qū)與人亞組III相對應(yīng)，在131個(gè)氨基酸的重疊部分具有71％的同一性。
本發(fā)明的CDR分為多個(gè)規(guī)范的類別。L1環(huán)劃歸類2(11個(gè)殘基的環(huán))，L2劃歸類1(7個(gè)殘基)和L3劃歸類1(9個(gè)殘基)。H1環(huán)劃歸類1(5個(gè)殘基)，H2環(huán)劃歸類3(17個(gè)殘基)。H3環(huán)不屬于規(guī)范的類別。
輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)交接處的殘基已被定義(Chothia et al，1985 J.Mol.Biol.，186，651-663)。它們通常保留在再成形抗體中。在mCBE11中這些殘基中的數(shù)個(gè)通常位于交接處，即VL中的S34，I46，L89，H91和VH中的Y35，F(xiàn)37，V93，E95。
非常規(guī)框架殘基通過分析1999年9月版的Kabat數(shù)據(jù)庫[NCBI，NIH]中小鼠和人的所有可變鏈序列來確定。據(jù)信，mCBE11-特異性差異如果接近結(jié)合位點(diǎn)則可能指示那些能增強(qiáng)結(jié)合活性的體細(xì)胞突變。更遠(yuǎn)離結(jié)合位點(diǎn)的非常規(guī)小鼠殘基，還有非常規(guī)的人的殘基，如果在再成形抗體中產(chǎn)生致免疫性表位，則被除去。在mCBE11中發(fā)現(xiàn)的非常規(guī)框架殘基是輕鏈的K3，M11，Y12，W41，Q69，S72，D81，T83和重鏈的F37，T40，E42，A49，N77。這其中大多數(shù)殘基未能保留在人源化CBE11抗體中，一部分非常規(guī)框架殘基得以保留，包括，如重鏈的F37和A49。
對可變區(qū)結(jié)構(gòu)建模將本發(fā)明的輕鏈和重鏈在非-豐余(non-redundant)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比排列，以便確定用于構(gòu)建mCBE11輕鏈和重鏈的三維模型的結(jié)構(gòu)框架。利用BLAST發(fā)現(xiàn)，輕鏈與鼠單克隆抗體5g9(1AHW)有93％的序列同一性，重鏈與鼠IGGA2 Fab片段(Fab 17/9)(1IFH)有81％的序列同一性。利用分子建模軟件包Sybyl(Tripos Inc.)，分別用5g9的輕鏈和IGGA2 Fab片段的重鏈構(gòu)建輕鏈和重鏈的三維結(jié)構(gòu)。所建模型的結(jié)構(gòu)完整性在控制臺(console)進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)比較合理。
對再成形的可變區(qū)的設(shè)計(jì)用同源性匹配選擇“接受”mCBE11 CDR的人受體框架區(qū)。用軟件程序BLAST在Kabat數(shù)據(jù)庫和非豐余數(shù)據(jù)庫，NCBI，ENTRZ(The NationalInstitutes of Health)中進(jìn)行搜索。對人的受體框架區(qū)的選擇是基于mCBE11框架區(qū)與人的框架區(qū)(除了來源于以前人源化的抗體的框架區(qū)以外)之間的序列同一性。
最終選擇的人的框架區(qū)中，輕鏈可變區(qū)部分(VL)來自抗人腫瘤壞死因子α的抗體TNF-A1′CL(kabat ID 004770)(Griffths等，1993 EMBO J.12725-734)(人κ亞組I)，重鏈可變區(qū)部分(VH)來自特異性不明的抗體FLA-IgG′CL(kabat id 040003)(Malisan等，1996 Blood 87717-724)(人亞組III)。人VL和VH的框架區(qū)與鼠的序列相比有15和11個(gè)殘基的差異。
入框架區(qū)的回復(fù)突變單克隆抗體人源化過程中最無法預(yù)測的步驟是，對親本抗體(本例中為鼠源抗體)中需要予以保留以便充分保留親本抗體的結(jié)合特性、同時(shí)又使所得抗體的潛在致免疫性最小化的關(guān)鍵性框架殘基的鑒定。尤其重要的是保留靠近結(jié)合位點(diǎn)的規(guī)范殘基、界面包裝殘基和非常規(guī)鼠殘基。還要考慮‘Vernier區(qū)＇中的殘基(形成一個(gè)能留置CDR的平臺)(Foote & Winter，1992 J.Mol.Biol.224，487-499)和那些靠近CDR H3的殘基。向親本抗體回復(fù)的突變(即，從人的框架殘基向鼠的殘基的突變)在后文中都稱為回復(fù)突變。
制備三種再成形的可變輕鏈(hu-CBE11 VL)和四種再成形的可變重鏈(hu-CBE11 VH)。第一種包含回復(fù)得最多的突變，第三種包含回復(fù)得最少的突變(即，最為“人源化”)，只有第四種hu-CBE11 VH例外。本發(fā)明涉及源自mCBE11的人源化抗體，它以任意組合方式具有選自下列(即，VL#1，VL#2或VL#3)的可變輕鏈和選自下列(即，VH#1，VH#2，VH#2，或VH#4)的可變重鏈。
(A)輕鏈3Q(谷氨酰胺)-＞K(賴氨酸)它保留在第一種形式中，因?yàn)榇饲暗脑俪尚螌?shí)驗(yàn)(例如Kolbinger等，1993 Prot.Eng.，6，971-980)顯示它可能對于抗原結(jié)合或CDR構(gòu)象很重要。
41G(甘氨酸)-＞W(wǎng)(色氨酸)它保留在第一種和第二種形式中。
46L(亮氨酸)-＞I(異亮氨酸)它保留在第一和第二種形式中，因?yàn)樗仁墙缑鏆埢?，又位于vernier區(qū)中。而且它還是在鼠序列中出現(xiàn)9次，和在人的序列中出現(xiàn)1次的非常規(guī)殘基。它看來會(huì)影響可變鏈的包裝并且可能與CDR接觸。
69T(蘇氨酸)-＞Q(谷氨酰胺)該殘基位于vernier之中并可能影響CDR構(gòu)象。從較短的T變?yōu)檩^長的Q還可能意味著它能與抗原接觸。Q在小鼠中非常規(guī)地出現(xiàn)了58次，在人類中僅出現(xiàn)2次。它保留在第一種形式中。
71F(苯丙氨酸)-＞Y(酪氨酸)該殘基為一個(gè)規(guī)范位點(diǎn)，它保留在所有形式中。它在人的序列中僅出現(xiàn)25次，這相對來講不太常規(guī)。
(B)重鏈37V(纈氨酸)-＞F(苯丙氨酸)它保留在第一、二和第四種形式中。該位置的F不是常規(guī)的，它在小鼠中僅出現(xiàn)15次，在人類中出現(xiàn)18次。它還是一種界面殘基。
40A(丙氨酸)-＞T(蘇氨酸) 它保留在第一種形式中。此前有5次人源化實(shí)驗(yàn)對該位置進(jìn)行了突變，但都不是從A變?yōu)門。一例是將BrE-3表面(veneering)的A變?yōu)镾(Couto等，1994 Hybridoma，13，215-219)，導(dǎo)致結(jié)合親和力增強(qiáng)，但原因不明。在該例中，重鏈也是人的亞組III。
49S(絲氨酸)-＞A(丙氨酸) 該殘基位于CDR之下、vernier區(qū)中，并且它保留在所有形式中。
89V(纈氨酸)-＞M(甲硫氨酸)它在第一種形式得以保留。有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)對該位置進(jìn)行了回復(fù)突變。
93A(丙氨酸)-＞V(纈氨酸)該位置既是界面殘基又位于vernier區(qū)之中。它被保留在第一和第二種形式中。
所制備的可變輕鏈和可變重鏈的每種不同形式，它們的氨基酸和核酸序列如下再成形的可變輕鏈再成形的CBE11可變輕鏈-第1種輕鏈(VL#1)(質(zhì)粒pAND066)1 GATATTAAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60D I K M T Q S P S S L S A S V G D R V Taa361 ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120I T C K A G Q D I K S Y L S W Y Q Q K P121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180W K A P K I L I Y Y A T R L A D G V P Saa41 aa46181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240R F S G S G S G Q D Y T L T I S S L Q Paa69 aa71241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300E D F A T Y Y C L Q H G E S P W T F G G301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA321G T K L E I KSEQ ID NO3-表示上述再成形V#1的核酸序列。
SEQ ID NO4-表示上述再成形VL#1的氨基酸序列。
再成形的CBE11可變輕鏈-第2種輕鏈(VI#2)(質(zhì)粒pAND070)1 GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT60D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T61 ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA120I T C K A G Q D I K S Y L S W Y Q Q K P121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA180W K A P K I L I Y Y A T R L A D G V P Saa41 aa46181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT240R F S G S G S G T D Y T L T I S S L Q Paa71241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA300E D F A T Y Y C L Q H G E S P W T F G G301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321G T K L E I K
SEQ ID NO5-表示上述再成形VL#2的核酸序列。
SEQ ID NO6-表示上述再成形VL#2的氨基酸序列。
再成形的CBE11可變輕鏈-第3種輕鏈(VL#3)(質(zhì)粒pAND074)1 GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T61 ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120I T C K A G Q D I K S Y L S W Y Q Q K P121 GGGAAAGCGCCTAAGCCTCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCA 180G K A P K L L I Y Y A T R L A D G V P S181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240R F S G S G S G T D Y T L T I S S L Q Paa71241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300E D F A T Y Y C L Q H G E S P W T F G G301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321G T K L E I KSEQ ID NO7-表示上述再成形VL#3的核酸序列。
SEQ ID NO8-表示上述再成形VL#3的氨基酸序列。
再成形的可變重鏈再成形的CBE11可變重鏈-第1種重鏈(VH#1)(質(zhì)粒pAND067)1 GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60E V Q L V E S G G G L V K P G G S L R L61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGACT 120S C A A S G F T F S D Y Y M Y W F R Q Taa37aa40121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180P G K G L E W V A T I S D G G S Y T Y Yaa49181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240P D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300L Q M S S L R A E D T A M Y Y C V R E Eaa89aa93301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360N G N F Y Y F D Y W G Q G T T V T V S SSEQ ID NO9-表示上述再成形VH#1的核酸序列。
SEQ ID NO10-表示上述再成形VH#1的氨基酸序列。
再成形的CBE11可變重鏈-第2種重鏈(VH#2)(質(zhì)粒pAND071)1 GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60E V Q L V E S G G G L V K P G G S L R L61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC 120S C A A S G F T F S D Y Y M Y W F R Q A
aa37121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180P G K G L E W V A T I S D G G S Y T Y Yaa49181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240P D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300L Q M S S L R A E D T A V Y Y C V R E Eaa93301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360N G N F Y Y F D Y W G Q G T T V T V S SSEQ ID NO11-表示上述再成形VH#2的核酸序列。
SEQ ID NO12-表示上述再成形VH#2的氨基酸序列。
再成形的CBE11可變重鏈-第3種重鏈(VH#3)(質(zhì)粒pAND075)1GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60E V Q L V E S G G G L V K P G G S L R L61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTGCGCCAGGCC 120S C A A S G F T F S D Y Y M Y W V R Q A121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180P G K G L E W V A T I S D G G S Y T Y Yaa49181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240P D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAAGAGAGGAG 300L Q M S S L R A E D T A V Y Y C A R E E301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360N G N F Y Y F D Y W G Q G T T V T V S SSEQ ID NO13-表示上述再成形VH#3的核酸序列。
SEQ ID NO14-表示上述再成形VH#3的氨基酸序列。
再成形的CBE11可變重鏈-第4種重鏈(VH#4)(質(zhì)粒pAND090)1GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60E V Q L V E S G G G L V K P G G S L R L61 TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC 120S C A A S G F T F S D Y Y M Y W F R Q Aaa37121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180P G K G L E W V A T I S D G G S Y T Y Yaa49181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240P D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAAGAGAGGAG 300L Q M S S L R A E D T A V Y Y C A R E E301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360N G N F Y Y F D Y W G Q G T T V T V S SSEQ ID NO15-表示上述再成形VH#4的核酸序列。
SEQ ID NO16-表示上述再成形VH#4的氨基酸序列。
制備由不同類型的輕鏈和重鏈組成的抗體并用于進(jìn)一步的研究。例如，制備由再成形的huCBE11第3種可變輕鏈(VL#3)和再成形的huCBE11第4種可變重鏈(VH#4)組成的抗體，命名為huCBE11#4或hCBE11。將產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞系E46.4和E77.4保藏在A.T.C.C.(ATCC專利保藏物編號分別為PTA-3357和3765)。
本發(fā)明還涉及再成形VH和VL序列的等價(jià)體和變體，即那些包含一或多個(gè)不實(shí)質(zhì)影響LT-β-R結(jié)合的保守氨基酸取代者。含有這些人源化可變重鏈和輕鏈的序列的人源化LT-β-R抗體可通過實(shí)施例中描述的重組方法獲得。
應(yīng)用本發(fā)明的人源化抗LT-β-R抗體可用于治療那些當(dāng)LT-β-R激活時(shí)具有療效的疾病，如用于治療、預(yù)防或減少瘤形成的進(jìn)展、嚴(yán)重性或影響。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案涉及治療哺乳動(dòng)物(即，人類)中與不良細(xì)胞增生有關(guān)的疾病的方法，包括給與該哺乳動(dòng)物治療有效量的含本發(fā)明人源化LT-β-R抗體的組合物。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及治療哺乳動(dòng)物(即，人類)中過表達(dá)LT-β-R的實(shí)體瘤(即，癌癥)的方法，包括給與該哺乳動(dòng)物有效量的、與LT-β-R結(jié)合從而減小腫瘤體積的人源化LT-β-R抗體。細(xì)胞增生受LT-β-R調(diào)節(jié)的那些癌癥的實(shí)例可通過測量表達(dá)在腫瘤組織文庫中的LT-β-R和/或LT-β-R配體(即，LTα1β2或LIGHT)信息的體外水平來進(jìn)行篩選。高表達(dá)LT-β-R和/或LT-β-R配體(即，LTα1β2或LIGHT)信息的腫瘤組織文庫將是候選者。本發(fā)明涉及的腫瘤類型包括實(shí)體瘤，它包括但不限于，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，結(jié)直腸癌(CRC)，乳腺癌，以及前列腺、胃(gastric)、皮膚、胃部(stomach)、食道和膀胱等部位的癌癥。
本發(fā)明用于治療與不良細(xì)胞增生有關(guān)的疾病(尤其腫瘤)的人源化抗體優(yōu)選抑制腫瘤細(xì)胞的生長，其判定標(biāo)準(zhǔn)可以是例如，腫瘤體積減小約10％，20％，30％或40％以上，最優(yōu)選減小約50％以上。人源化抗體通過篩選獲得(例見實(shí)施例3)。例如，本發(fā)明所用人源化抗體可根據(jù)腫瘤體積相對于未處理的癌癥細(xì)胞的減小來選擇(例如，減小約10％，20％，30％，40％或50％以上)。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明人源化抗體和可藥用賦形劑的藥用組合物。適當(dāng)?shù)妮d體，例如，以及它們的配制劑參見Remington’PharmaceuticalSciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.，編者Oslo等。通常在配制劑中使用適當(dāng)量的可藥用鹽來造成等滲。載體的實(shí)例有緩沖劑如鹽水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH優(yōu)選約5-8，更優(yōu)選約7.4-7.8。其它載體包括持續(xù)釋放制劑，如由固體疏水性聚合物組成的半透性基質(zhì)，為成形的顆粒，例如脂質(zhì)體、膜或微粒體。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，根據(jù)給藥途徑和所給的藥用組合物的濃度不同，還有更優(yōu)選的載體。
給藥可通過注射(如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))或通過諸如灌注等確保有效運(yùn)送至血流的其它方法來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的人源化抗體可以以有效劑量給與以便治療具體的臨床疾病。針對具體的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以根據(jù)，例如患者的體重和狀態(tài)、治療所要達(dá)到的程度以及患者對治療的耐受程度，來確定優(yōu)選的藥物配制劑和進(jìn)行有效治療所需的劑量方案。例如，有效劑量可以是約0.05-100mg/kg體重/日。更優(yōu)選約0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg，或25mg/kg體重/日?；蛘撸s0.05-100mg，更優(yōu)選約0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg，或25mg/kg體重/周?；蛘撸s0.05-100mg，更優(yōu)選約0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg，或25mg/kg體重/2周?；蛘呒s0.05-100mg，更優(yōu)選約0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg，或25mg/kg體重/3周?；蛘呒s0.05-100mg，更優(yōu)選約0.05mg，0.1mg，0.2mg，0.3mg，0.4mg，0.5mg，0.6mg，0.7mg，0.8mg，0.9mg，1mg，2mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，15mg，20mg，或25mg/kg體重/4周。
除非特別說明，本發(fā)明的實(shí)施可應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)的細(xì)胞生物學(xué)，細(xì)胞培養(yǎng)，分子生物學(xué)，微生物學(xué)，重組DNA，蛋白質(zhì)化學(xué)以及免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這類技術(shù)都有文獻(xiàn)記載。例如，可參見Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd edition.(Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，eds.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；DNA Cloning，Volumes I和II(D.N.Glover，ed)，1985；Oligonucleotide Synthesis，(M.J.Gait，ed.)，1984；U.S.Patent No.4，683，195(Mullis等，)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins，eds.)，1984；Transcription和Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins，eds.)，1984；Culture of Animal Cells(R.I.Freshney，ed).Alan R.Liss，Inc.，1987；Immobilized Cells和Enzymes，IRL Press，1986；A Practical Guide toMolecular Cloning(B.Perbal)，1984；Metbods in Enzymology，Volumes 154和155(Wu等，eds)，Academic Press，New York；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos，eds.)，1987，Cold Spring HarborLaboratory；Immunochemical Methods in Cell和Molecular Biology(Mayer和Walker，eds.)，Academic Press，London，1987；Handbook of ExperimentImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.)，1986；Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986.
以下實(shí)施例旨在舉例說明本發(fā)明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建并表達(dá)chCBE11用編碼鼠CBE11重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA來構(gòu)建鼠-人嵌合體(chCBE11)的表達(dá)載體，其中muCBE11可變區(qū)與人的IgG1和κ恒定區(qū)相連。為了構(gòu)建重鏈嵌合體，將來自CBE11重鏈亞克隆pEAG970的0.36kbPstI-BstEII片段，亞克隆至來自5a8(它是此前由Biogen所鑒定的CD4-特異性mAb的分子克隆形式)重鏈質(zhì)粒pLCB7經(jīng)磷酸酶處理的2.82kbPstI-BstEII載體片段中，從而在muCBE11重鏈可變區(qū)添加鼠重鏈信號序列和剪接供體位點(diǎn)。所得質(zhì)粒為pEAG979，其中的重鏈成熟N-末端與經(jīng)Edman降解得到的純化的標(biāo)準(zhǔn)CBE11的重鏈N-末端序列有兩個(gè)殘基的差異，因?yàn)樗赑CR過程中是通過引物來確定的。為了校正重鏈N-末端，利用Amersham Pharmacia Biotech USE誘變試劑盒，按照廠家建議對pEAG979進(jìn)行唯一位點(diǎn)消除(USE)誘變。突變的質(zhì)粒通過篩選所導(dǎo)入的AvaII，PstI，和RsaI改變來鑒定。所得質(zhì)粒為pEAG981，其中的重鏈序列通過DNA測序來證實(shí)。將來自pEAG981的0.44kb NotI-HindIII重鏈可變區(qū)片段和來自pEAG964的1.21kb HindIII-NotI片段(含人IgG1恒定區(qū))，亞克隆至pCEP4(Invitrogen)EBV表達(dá)載體所衍生的質(zhì)粒pCH269的NotI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pEAG983。
為了構(gòu)建輕鏈嵌合體，將來自pMDR985的0.11kb NotI-EcoRV片段和來自CBE11輕鏈可變區(qū)質(zhì)粒pEAG967的0.37kb EcoRV-BamHI片段，亞克隆至Stratagene公司提供的pBluescriptIISK+克隆載體經(jīng)磷酸酶處理的2.94kb NotI-BamHI載體片段，以便添加鼠輕鏈信號序列和5’NotI位點(diǎn)，所得質(zhì)粒為pEAG978。利用Amersham Pharmacia Biotech USE誘變試劑盒，按照廠家建議對該質(zhì)粒進(jìn)行USE誘變，所用的誘變引物編碼V3K取代，該引物與標(biāo)準(zhǔn)CBE11輕鏈的N-末端匹配，并可在輕鏈可變區(qū)的3’末端引入一個(gè)BglII位點(diǎn)。突變的質(zhì)粒通過篩選所引入的BglII，EcoRV，和MseI位點(diǎn)改變來鑒定。所得質(zhì)粒為pEAG980，其中的輕鏈序列通過DNA測序來證實(shí)。將來自pEAG980的0.41kb NotI-BglII輕鏈可變區(qū)片段和來自pEAG963的0.68kbBclI-NotI片段(含有人κ輕鏈恒定區(qū))，亞克隆至pCEP4(Invitrogen)EBV表達(dá)載體所衍生的質(zhì)粒pCH269的NotI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pEAG982。
用表達(dá)載體(chCBE11重鏈載體pEAG983和chCBE11輕鏈載體pEAG982)共轉(zhuǎn)染293-EBNA細(xì)胞，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的抗體分泌和抗體特異性(用被空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及被ch5c8轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照，ch5c8是此前由Biogen所鑒定的CD154-特異性mAb的分子克隆形式)。全細(xì)胞裂解物以及經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)基用蛋白A進(jìn)行免疫沉淀，對沉淀物的Western印跡分析(用抗人重鏈和輕鏈的抗體來顯示)表明，被chCBE11-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠合成并有效分泌重鏈和輕鏈，其水平與被ch5c8-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相似。用培養(yǎng)過轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基對表達(dá)LT-β-R的HT-29細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后的FACS表明，chCBE11抗體被結(jié)合并產(chǎn)生類似于muCBE11的染色模式，而培養(yǎng)假轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基，以及培養(yǎng)被ch5c8轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基都沒能對HT-29細(xì)胞上的LT-β-R實(shí)現(xiàn)染色。將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的嵌合CBE11純化，用表達(dá)LT-β-R的A375黑素瘤細(xì)胞證實(shí)其誘導(dǎo)IL-8的分泌，還證實(shí)它能在裸鼠中抑制WiDRr腺癌細(xì)胞的生長。
實(shí)施例2構(gòu)建并表達(dá)huCBE11
如上述設(shè)計(jì)再成形的可變區(qū)，以制備人源化CBE11(huCBE11)。根據(jù)同源性匹配來選擇人的受體框架輕鏈選人κ亞組I mAb TNF-A1(Griiffths等，1993)，重鏈選人亞組III mAb FLA-IgG(Malisan等，1996)。每種可變輕鏈共設(shè)計(jì)了三種形式，再成形的可變重鏈設(shè)計(jì)了四種形式。一般第1種形式包含向鼠供體序列回復(fù)得最多的突變，而最后一種形式包含回復(fù)得最少的突變(即，最為“人源化”)。
用Amersham Pharmacia Biotech USE誘變試劑盒按照廠家建議經(jīng)唯一位點(diǎn)消除法(USE)制備huCBE11可變區(qū)，其利用了chCBE11可變區(qū)質(zhì)粒作為起始模板。引起框架(FR)變化的誘變引物如下。使用人的受體框架的cDNA序列(輕鏈為Kabat數(shù)據(jù)庫#004770，重鏈為Kabat#040003)，其中引入了靜默突變以便產(chǎn)生有利于鑒定突變質(zhì)粒的限制性位點(diǎn)變化。突變的質(zhì)粒通過檢查所引入的限制性位點(diǎn)變化來鑒定。所得質(zhì)粒中的可變區(qū)cDNA序列通過DNA測序證實(shí)。
VH#1以pEAG981為模板，并使用以下引物FR1引物5’GCC TGGAGG GTC CCT GAG GCT CTC CTG TGC AGC CTC 3’(SEQ ID NO17)，它引入了一個(gè)Bsu36I位點(diǎn)；FR2引物5’GTT TCG CCA GAC TCC GGG AAAGGG GCT GGA GTG GGT CGC AAC 3’(SEQ ID NO18)，它引入了NciI和HpaII位點(diǎn)；FR3引物5’CAG AGA CAA TGC CAA GAA CAG CCT CTA CCTGCA GAT GAG CAG CCT GAG GGC TGA GGA CAC AGC CAT G 3’(SEQID NO19)，它引入了Bsu36I和PstI位點(diǎn)、并除去了一個(gè)RsaI位點(diǎn)。所得VH#1質(zhì)粒為pAND067。
VH#2以pAND067為模板，并使用以下引物FR2引物5’CAT GTA TTGGTT TCG CCA GGC CCC GGG AAA GGG GCT GG 3’(SEQ ID NO20)，它引入了一個(gè)SmaI位點(diǎn)；FR3引物5’GGG CTG AGG ACA CAG CTG TGT ATTACT GTG TAA GAG 3’(SEQ ID NO21)，它引入了一個(gè)PVuII位點(diǎn)。所得VH#2質(zhì)粒為pAND071。
VH#3以質(zhì)粒pAND067為模板，并使用以下引物FR2引物5’GTG ACTATT ACA TGT ATT GGG TGC GCC AGG CCC CGG GAA AGG GGC TGGAG 3’(SEQ ID NO22)，它引入了SmaI和HhaI位點(diǎn)；FR3引物5’GAG GGCTGA GGA CAC AGC TGT GTA TTA CTG CGC AAG AGA GGA GAA TGGTAA C 3’(SEQ ID NO23)，它引入了PvuII和FspI位點(diǎn)。所得VH#3質(zhì)粒為pAND075。
huCBE11重鏈的表達(dá)載體如下制備將來自pAND067，pAND071，或pAND075的0.44kb NotI-HindIII重鏈可變區(qū)片段，和來自pEAG964的1.21kb HindIII-NotI片段(含人IgG1恒定區(qū))，亞克隆至pCEP4 EBV表達(dá)載體所衍生的質(zhì)粒pCH269中的NotI位點(diǎn)，從而得到重鏈表達(dá)載體pAND069(VH#1)，pAND073(VH#2)，和pAND077(VH#3)。
VL#1以質(zhì)粒pEAG980為模板，并使用以下引物FR1引物5’CTT GCAAGT GAT AGT GAC CCT GTC TCC CAC CGA TGC AGA CAA GGA TGATGG AGA CTG GGT CAT C 3’(SEQ ID NO24)，它除去了HinfI和NsiI位點(diǎn)；FR2引物5’CAT AAT AGA TCA GGA TCT TAG GCG CTT TCC ATG GTTTCT GCT G 3’(SEQ ID NO25)，它引入了HaeII和HhaI位點(diǎn)；FR3引物5’GTA GAC AGT AAT AAG TTG CGA AAT CCT CAG GCT GCA GGC TGCTGA TGG TTA GAG TAT AAT CTT GCC CAG ATC 3’(SEQ ID NO26)，它引入了Bsu36I，DdeI，和PstI位點(diǎn)。所得VL#1質(zhì)粒為pAND066。
VL#2以質(zhì)粒pAND066為模板，并使用以下引物FR1引物5’GAT GGAGAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G 3’(SEQ IDNO27)，它引入了一個(gè)EcoRV位點(diǎn)；FR3引物5’GAT GGT TAG AGT ATAATC TGT ACC AGA TCC ACT GCC ACT G 3’(SEQ ID NO28)，它引入了一個(gè)RsaI位點(diǎn)。所得VL#2質(zhì)粒為pAND070。
VL#3以質(zhì)粒pAND066為模板，并使用以下引物FR1引物5’GAT GGAGAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G 3’(SEQ IDNO29)，它引入了一個(gè)EcoRV位點(diǎn)；FR2引物5’CAA CCT TGT TGC ATAATA GAT CAG AAG CTT AGG CGC TTT CCC TGG TTT CTG CTG GTA CC3’(SEQ ID NO30)，它引入了一個(gè)HindIII位點(diǎn)，它還除去了NcoI和StyI位點(diǎn)；FR3引物5’GAT GGT TAG AGT ATA ATC TGT ACC AGA TCC ACTGCC ACT G 3’(SEQ ID NO31)，它引入了一個(gè)RsaI位點(diǎn)。所得VL#3質(zhì)粒為pAND074。
huCBE11輕鏈的表達(dá)載體如下制備將來自pAND066，pAND070，或pAND074的0.41kb NotI-BglII輕鏈可變區(qū)片段，和來自pEAG963的0.68kbBclI-NotI片段(含人κ輕鏈恒定區(qū))，亞克隆至pCEP4 EBV表達(dá)載體所衍生的質(zhì)粒pCH269中的NotI位點(diǎn)，從而得到輕鏈表達(dá)載體pAND068(VL#1)，pAND072(VL#2)，和pAND076(VL#3)。
將表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至293-EBNA細(xì)胞中，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的抗體分泌和抗體特異性(用被空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照)。全細(xì)胞裂解物以及經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)基用蛋白A進(jìn)行免疫沉淀，對沉淀物的Western印跡分析(用抗人重鏈和輕鏈的抗體來顯示)表明，被huCBE11-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠合成并有效分泌重鏈和輕鏈，其水平與被chCBE11-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相似。用培養(yǎng)過轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基對表達(dá)LT-β-R的HT-29細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后的FACS表明，相對于chCBE11而言，huCBE11#3mAb的結(jié)合不及huCBE11#1和huCBE11#2這兩種mAb，見下表1，其中huCBE11#1(VL#1+VH#1)；huCBE#2(VL#2+VH#2)和huCBE11#3(VL#3+VH#3)。混合和匹配共轉(zhuǎn)染提示結(jié)合減弱可能是VH#3所致，它有兩個(gè)框架殘基不同于VH#2FR2 F37V和FR3V93A。為了檢測這些變化各自造成的影響，構(gòu)建了新的重鏈表達(dá)載體。質(zhì)粒pAND089是VH#2的F37V變體，它如下制備將來自pAND075的311bp NotI-PstI片段，來自pAND071的126bp PstI-HindIII片段和來自pEAG964的1.21kb HindIII-NotI片段，亞克隆至pCEP4 EBV表達(dá)載體所衍生的質(zhì)粒pCH269的NotI位點(diǎn)。質(zhì)粒pAND090是VH#2的V93A變體，它如下制備將來自pAND071的311bp NotI-PstI片段，來自pAND075的126bp PstI-HindIII片段和來自pEAG964的1.21kb HindIII-NotI片段，亞克隆至pCEP4 EBV表達(dá)載體所衍生的質(zhì)粒pCH269的NotI位點(diǎn)。將這些H2/H3嵌合重鏈與VL#2或VL#3一起共轉(zhuǎn)染293-EBNA細(xì)胞。FACS分析表明，V93AH2變體當(dāng)與VL#3配合時(shí)恢復(fù)了LT-β-R結(jié)合(見表1)。pAND076和pAND090配對被稱為huCBE11#4(見表1)。
用不同形式的chCBE11和huCBE11(#1-4)對293-EBNA細(xì)胞進(jìn)行的共轉(zhuǎn)染按比例遞增，收獲經(jīng)過培養(yǎng)的培養(yǎng)基。將抗體在蛋白A-Sepharose上純化。分析純化后mAb的活性。
表1.chCBE11和huCBE11對HT-29細(xì)胞的FACS染色輕鏈重鏈相對MFIChCBE11pEAG982 pEAG983 1.00HuCBE11#1 pAND068 pAND069 1.00HuCBE11#2 pAND072 pAND073 1.00HuCBE11#3 pAND076 pAND077 0.62L2/H3 pAND072 pAND077 0.42L3/H2 pAND076 pAND073 1.00L2/F37VH2 pAND072 pAND089 0.65L2/V93AH2 pAND072 pAND090 0.75L3/F37VH2 pAND076 pAND089 0.80HuCBE11#4 pAND076 pAND090 1.00用培養(yǎng)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基通過在冰上靜置30min而對HT-29細(xì)胞進(jìn)行染色，將細(xì)胞用FACS緩沖液(PBS，含5％FBS和0.05％疊氮鈉)洗兩次，用偶聯(lián)了PE抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)在冰上的FACS緩沖液中染色30min，細(xì)胞用FACS緩沖液洗兩次，然后重懸于FACS緩沖液中以備進(jìn)一步分析。相對MFI是指chCBE11觀測值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以后的平均MFI。所顯示的數(shù)據(jù)代表兩輪獨(dú)立的轉(zhuǎn)染的平均值。
實(shí)施例3IL-8對A375細(xì)胞的激動(dòng)作用(Agonism)分析純化mAb的活性。在A375人黑素瘤細(xì)胞上進(jìn)行的IL-8釋放試驗(yàn)的結(jié)果見圖1，它測量了抗LT-β-R抗體與表達(dá)在A375人黑素瘤細(xì)胞表面的LT-β-R結(jié)合所致的IL-8釋放的量。將105/ml的A375細(xì)胞加入96孔板，板中含有可溶性抗體、或捕獲在包被了山羊抗人IgG Fc(JacksonImmunoResearch Laboratories)的孔中的抗體。將培養(yǎng)平板保溫過夜。收獲培養(yǎng)后的培養(yǎng)基，通過ELISA分析IL-8。
實(shí)施例4對WiDr細(xì)胞的細(xì)胞毒活性用WiDr結(jié)腸癌細(xì)胞以及可溶性抗LT-β-R抗體在包被了抗人IgG Fc的孔中進(jìn)行細(xì)胞毒試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，抗LT-β-R抗體在癌細(xì)胞中增強(qiáng)了細(xì)胞毒活性，見圖2。在有80單位/ml huIFN-γ存在的條件下，將6×104/ml的WiDr細(xì)胞加入96孔板，板中含有可溶性抗體、或捕獲在包被了山羊抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的孔中的抗體。將培養(yǎng)板保溫5天。加入MTT，維持4小時(shí)，所得沉淀通過與10％ SDS的10mM HCl溶液保溫過夜而溶解，在微滴板讀取儀上讀取O.D.值。
實(shí)施例5制備由再成形的huCBE11第3種可變輕鏈(VL#3)和再成形的huCBE11第4種可變重鏈(VH#4)組成的抗體，命名為huCBE11#4或hCBE11。將產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞系保藏在A.T.C.C.(ATCC專利保藏物編號為PTA-3357)。輕鏈和重鏈各自的全長多肽序列如下(包括恒定區(qū))成熟huCBE11第3種輕鏈的序列(SEQ ID NO32)1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP GKAPKLLIYY51ATRLADGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCLQHGESPWTFGG101 GTKLEIK [RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG201 LSSPVTKSFN RGEC]CDR用下劃線標(biāo)示，回復(fù)突變F71Y以粗體標(biāo)示，恒定區(qū)用括號標(biāo)示。
成熟huCBE11第4種重鏈的序列(SEQ ID NO33)V37F S49A1 EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFSDYYMYWFRQA PGKGLEWVAT51ISDGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMSSLRAED TAVYYCAREE101NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS[ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT201 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP251 KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN301 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ351 VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV401 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG]CDR用下劃線標(biāo)示，回復(fù)突變V37F和S49A以粗體標(biāo)示，恒定區(qū)用括號標(biāo)示。
6周齡裸鼠腹腔注射100ug抗LFA3抗體(1E6)，100ug抗LTBR抗體(huCBE11#4)或不接受注射(對照)。然后給它們皮下注射1×106WIDR結(jié)腸腺癌細(xì)胞。經(jīng)huCBE11#4-處理的小鼠每周再用100ug抗體處理，mCBE11小鼠僅在第14天進(jìn)行再處理。每周測量腫瘤大小并計(jì)算腫瘤球體積(圖3)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到2.0cm3(直徑16mm)時(shí)，處死小鼠，將它們的死亡標(biāo)注在存活曲線中(圖4)。
實(shí)施例66周齡裸鼠腹腔注射100ug抗LTBR抗體(huCBE11#4)或不接受注射(對照)。然后給它們皮下注射1×106WIDR結(jié)腸腺癌細(xì)胞。經(jīng)huCBE11#4-處理的小鼠每周再用100ug huCBE11#4處理。每周測量腫瘤大小并計(jì)算腫瘤球體積。所示腫瘤體積代表10只對照小鼠和8只huCBE11#4-處理鼠的均值(圖5)。
每周用huCBE11#4處理顯著抑制了經(jīng)皮下方式植入裸鼠的WIDR腫瘤的生長速率。經(jīng)抗體連續(xù)處理21天的小鼠，在停止處理后的2周繼續(xù)表現(xiàn)出腫瘤生長速率的減小。
實(shí)施例7huCBE11#4 使已經(jīng)長成的WIDR腫瘤的生長減緩并使攜有WIDR腫瘤的裸鼠的存活延長106WIDR細(xì)胞已在裸鼠皮下生長10天。給小鼠皮下注射PBS或huCBE11#4(每周)或mCBE11(隔周)。測量腫瘤的寬度和長度，以此計(jì)算腫瘤重量。將腫瘤超過2000mg的小鼠處死，處死當(dāng)時(shí)的腫瘤重量被納入統(tǒng)計(jì)學(xué)平均值的計(jì)算中。錯(cuò)誤柱代表標(biāo)準(zhǔn)誤。用以下公式計(jì)算腫瘤重量(寬×寬×長)/2＝腫瘤重量的mg數(shù)。結(jié)果見圖6，可看出huCBE11#4能在體內(nèi)減緩已生成的腫瘤的生長。
此外，如上述使腫瘤生長并進(jìn)行處理，測量小鼠的存活百分比。結(jié)果見圖7，可看出huCBE11#4能使體內(nèi)已有腫瘤生成的小鼠延長存活期。
實(shí)施例8測量抗體親和力將HT-29細(xì)胞在添加了L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和10％胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞用PBS洗一次，通過與添加了20mM EDTA的PBS室溫保溫5分鐘而從平板中取出。將細(xì)胞以1000rpm(110×g)離心5分鐘，然后以1×107細(xì)胞/mL重懸在PBS中。
將HuCBE11#4抗LTβR抗體和作為陰性對照的人源化抗CD40L用PBS稀釋，按照1∶4稀釋12個(gè)梯度，使終濃度范圍為2.37pM-10μM。將100μL細(xì)胞懸液和100μL抗體稀釋液一起添加至96孔微滴板的V形底的孔中。使抗體和細(xì)胞在4℃保溫2小時(shí)。將平板在4℃以1000rpm(110×g)離心10分鐘。棄去上清，細(xì)胞沉淀用冷PBS洗6次。
山羊-抗人IgG-藻紅蛋白偶聯(lián)物(Jackson Immunoresearch)用PBS進(jìn)行1∶100稀釋，每孔加200μL。使細(xì)胞與此種第二抗體在4℃保溫1小時(shí)，如上述離心，用冷PBS洗一次。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至聚苯乙烯試管中。在FACSCalibur儀(Beckton Dickinson)上測量熒光強(qiáng)度。
在Delta圖中，將抗CD40L非特異性結(jié)合對照的染色的平均熒光強(qiáng)度值對抗體濃度作圖。所述值成一條直線，將每一抗體濃度的非特異性結(jié)合理論值從huCBE11#4稀釋系列的每一數(shù)值中減去。
然后，將這些特異性熒光強(qiáng)度值對huCBE11#4濃度的對數(shù)值作圖。所得曲線為鐘型，對稱狀，它反映了高濃度時(shí)抗體結(jié)合的自我抑制。該曲線的左半部分可用一種4參數(shù)等式找出所述抗體的功能性親和力。從所得曲線可知60pM huCBE11#4與HT-29結(jié)合的EC50值。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明了，在不背離本發(fā)明精神或超出本發(fā)明范圍的前提下，可以對本發(fā)明的多肽、組合物和方法進(jìn)行各種修改和變動(dòng)。因此，本發(fā)明包括了落在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的對本發(fā)明進(jìn)行的修改和變動(dòng)以及它們的等效形式。
序 列 表<110>比奧根公司(BIOGEN，INC.)艾倫·加伯(GARBER，Ellen)保羅·萊恩(LYNE，Paul)喬斯·W·塞爾丹哈(SALDHANA，Jose W.)<120>人源化抗-LT-β-R抗體<130>A100 PCT<150>60/240,285<151>2000-10-13<150>60/275,289<151>2001-03-13<150>60/299,987<151>2001-06-21<160>33<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>107<212>PRT<213>鼠<400>1Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Ile Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser65 70 75 80Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2
<211>120<212>PRT<213>鼠<400>2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Val Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>3<211>321<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>3gatattaaga tgacccagtc tccatcatcc ttgtctgcat cggtgggaga cagggtcact60atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120tggaaagcgc ctaagatcct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct 240gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300ggcaccaagc tggagatcaa a 321<210>4<211>107<212>PRT<213>人(Homo Sapien)<400>4Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>5<211>321<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>5gatatccaga tgacccagtc tccatcatcc ttgtctgcat cggtgggaga cagggtcact 60atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca120tggaaagcgc ctaagatcct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca180agattcagtg gcagtggatc tggtacagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct240gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga300ggcaccaagc tggagatcaa a 321<210>6<211>107<212>PRT<213>人(Homo Sapien)<400>6Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ala Pro Lys Ile Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>7<211>321<212>DNA<213>人(Homo Sapien)
<400>7gatatccaga tgacccagtc tccatcatcc ttgtctgcat cggtgggaga cagggtcact 60atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca120gggaaagcgc ctaagcctct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca180agattcagtg gcagtggatc tggtacagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct240gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga300ggcaccaagc tggagatcaa a 321<210>8<211>107<212>PRT<213>人(Homo Sapien)<400>8Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>9<211>360<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>9gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaggctc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccagact120ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat180ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cagcctctac240ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagccatgt attactgtgt aagagaggag300aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360<210>10<211>120<212>PRT<213>人(Homo Sapien)
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Val Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>13<211>360<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>13gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaggctc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccaggcc120ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat180ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cagcctctac240ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagctgtgt attactgtgt aagagaggag300aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360<210>14<211>120<212>PRT<213>人(Homo Sapien)<400>14Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>15<211>360<212>DNA
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cttgcaagtg atagtgaccc tgtctcccac cgatgcagac aaggatgatg gagactgggt60catc 64<210>25<211>43<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>25cataatagat caggatctta ggcgctttcc atggtttctg ctg 43<210>26<211>72<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>26gtagacagta ataagttgcg aaatcctcag gctgcaggct gctgatggtt agagtataat60cttgcccaga tc 72<210>27<211>40<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>27gatggagact gggtcatctg gatatcacct ctggcacctg40<210>28<211>40<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>28gatggttaga gtataatctg taccagatcc actgccactg 40<210>29<211>40<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>29gatggagact gggtcatctg gatatcacct ctggcacctg 40<210>30<211>59<212>DNA<21 3>人(Homo Sapien)
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461046154620Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu4625463046354640Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr464546504655Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val466046654670Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val467546804685Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser469046954700Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu4705471047154720Asn Gly Lys G1u Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala472547304735Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro474047454750Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln475547604765Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala477047754780Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr4785479047954800Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu480548104815Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser482048254830Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser483548404845Leu Ser Pro Gly4850
權(quán)利要求
1.人源化抗淋巴毒素β受體(LT-β-R)的抗體，其輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)由SEQID NO1中氨基酸殘基24-34，50-56和89-97限定，其重鏈互補(bǔ)決定區(qū)由SEQ ID NO2中氨基酸殘基31-35，50-66和99-109限定，并且該抗體在其輕鏈中包含下列的至少1種殘基K3，W41，I46，Q69和Y71；或在其重鏈中包含下列的至少1種殘基F37，T40，A49，M89和V93(按照Kabat編號原則進(jìn)行編號)。
2.人源化抗淋巴毒素β受體(LT-β-R)的抗體，其輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)由SEQID NO1中氨基酸殘基24-34，50-56和89-97限定，其重鏈互補(bǔ)決定區(qū)由SEQ ID NO2中氨基酸殘基31-35，50-66和99-109限定，并且該抗體在其輕鏈中包含Y71殘基(按照Kabat編號原則進(jìn)行編號)。
3.人源化抗淋巴毒素β受體(LT-β-R)的抗體，其輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)由SEQID NO1中氨基酸殘基24-34，50-56和89-97限定，其重鏈互補(bǔ)決定區(qū)由SEQ ID NO2中氨基酸殘基31-35，50-66和99-109限定，并且該抗體在其重鏈中包含F(xiàn)37和A49殘基(按照Kabat編號原則進(jìn)行編號)。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO8中氨基酸殘基1至107限定的輕鏈可變區(qū)序列。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO16中氨基酸殘基1至120限定的重鏈可變區(qū)序列。
6.權(quán)利要求4的抗體，其中該抗體還包含由SEQ ID NO16中氨基酸殘基1至120限定的重鏈可變區(qū)序列。
7.一種抗體，它包含與由細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)或細(xì)胞系E77.4(ATCC專利保藏物3765)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體，其中該抗體充分保留了親本抗體的結(jié)合特性。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體，其中該抗體還與免疫毒素相連。
10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體，其中該抗體還與化療藥物相連。
11.一種組合物，它包含權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體和可藥用載體。
12.一種治療或緩解人的瘤形成的進(jìn)展、嚴(yán)重程度或影響的方法，該方法包含給藥權(quán)利要求11的組合物。
13.一種分離的核酸，它包含抗體輕鏈的編碼序列，該抗體由細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)或細(xì)胞系E77.4(ATCC專利保藏物3765)產(chǎn)生。
14.一種分離的核酸，它包含抗體重鏈的編碼序列，該抗體由細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)或細(xì)胞系E77.4(ATCC專利保藏物3765)產(chǎn)生。
15.一種分離的核酸，它包含編碼SEQ ID NO8中殘基1至107的序列。
16.一種分離的核酸，它包含編碼SEQ ID NO16中殘基1至120的序列。
17.細(xì)胞系E46.4(ATCC專利保藏物PTA-3357)或細(xì)胞系E77.4(ATCC專利保藏物3765)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗LT－β－R的人源化抗體以及它們的應(yīng)用方法。
文檔編號C07K19/00GK1547590SQ01820591
公開日2004年11月17日 申請日期2001年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月13日
發(fā)明者埃倫·加伯, 保羅·萊恩, 喬斯·W·塞爾丹哈, W 塞爾丹哈, 埃倫 加伯, 萊恩 申請人:比奧根公司