表面改性的重金屬納米粒子、組合物及其用途
【專利摘要】提供了表面改性的重金屬納米粒子，該表面改性的重金屬納米粒子包含重金屬芯和包覆層，該包覆層包含共軛到聚乙二醇的至少一種配體，其中至少一種配體選自N-乙酰半胱氨酸、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何組合。還提供了包含表面改性的重金屬納米粒子的組合物及其在治療和診斷各種病狀中的用途。
【專利說明】表面改性的重金屬納米粒子、組合物及其用途
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及表面改性的金屬納米粒子以及它們在治療和診斷各種健康相關的病狀中的用途的領域。
[0002]發(fā)明背景
[0003]納米粒子是納米標度尺寸的小物體，納米粒子在其運輸和特性方面表現為整個單元。納米粒子可以展示與在細小顆?；蛄畈牧现杏^察到的那些特性顯著不同的尺寸相關的特性。以前已經報道了用于制備金納米粒子的方法(例如，J.Turkevich等人，Discuss.Faraday.Soc.1951，11，55-75 ；J.Kimling 等人，J.Phys.Chem.B2006,110，15700-15707 ；G.Frens, Col1id&Polymer Sciencel972, 250, 736-741 ；G.Frens, Nature (London), Phys.Sc1.1973, 241,20-22 ；M.Brust 等人，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1994, 7,801-802 ；Manna等人(2003) Chem.Mater.15 (I):20 - 28 ；S.D.Perrault ；ff.C.ff.Chan (2009) J.Am.Chem.Soc.131(47):17042 ;M.N.Martin 等人，Langmuir26 (10):7410)。經常通過還原具有10±60nm直徑的金鹵化物單分散的顆粒來制備膠體金，由Frens使用用于還原HAuCl4的朽1檬酸鈉來描述。
[0004]金水溶膠是典型的疏液膠體，其顆粒帶有大量的負表面電荷(表面電勢是?50mV)，且因此，它僅在非常低的離子強度的溶液中是穩(wěn)定的。在疏液系統(tǒng)中，在化學組成和界面結構方面，分散介質和分散相實質上是不同的，因此未補償在界面處的表面力。因此，這些系統(tǒng)是熱力學上不穩(wěn)定的且需要專門穩(wěn)定。
[0005]穩(wěn)定金納米粒子:金顆粒表面的強的負電荷提供了它們與高分子質量化合物的強吸附相互作用。已知硫原子和金原子形成配價鍵。烷烴硫醇連接體HS(CH2)nR(R=C00H、0H或S03H ;n=ll±22)正被用于實現將生物分子更強地連接到金顆粒上。這些連接體與金的相互作用提供了在顆粒表面形成單層的硫醇鹽。
[0006]近年來，已經發(fā)現合成聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(乙酸乙烯酯)、聚酰胺胺(樹枝狀大分子)、聚二噻富烯、殼聚糖以及類似物，應用于單分散的膠體金(CG)的合成。在這些聚合物的存在下形成的顆粒以較高的尺寸和形狀均一性為特征。不幸的是，已用于生產穩(wěn)定的金納米粒子的合成方法和穩(wěn)定劑不提供用于醫(yī)用的最佳金納米粒子，這需要在水分散體中高度穩(wěn)定且非常濃的金屬納米粒子。在如例如，美國專利第6，955，639號中已經提出了金屬納米粒子在醫(yī)學應用中的用途，該美國專利涉及用金屬納米粒子增強輻射效應的方法。
[0007]針對它們在治療和診斷各種健康相關的病狀中的用途，在本領域仍然還有對制備顯示增強的特性，如改進的穩(wěn)定性和溶解度、降低的毒性、改進的生物利用度、改進的藥代動力學的金屬納米粒子的需求。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明提供了新型的表面改性的重金屬納米粒子、包含該表面改性的重金屬納米粒子的組合物及其用途。與其他金屬納米粒子制劑相比，本發(fā)明的新型的表面改性的重金屬納米粒子展示了改進的特性。尤其，本發(fā)明提供了展示改進的和增強的特性的新型的聚乙二醇(PEG)-N-乙酰半胱氨酸(NAC)表面改性的金納米粒子。還提供了用于制備可以用于癌癥治療或癌癥診斷的表面改性的重金屬納米粒子的穩(wěn)定水分散體的方法。
[0010]在一些實施方案中，本發(fā)明基于驚人的且出乎意料的發(fā)現:通過諸如烷烴硫醇連接體HS (CH2)nR的含有硫醇的基團來修飾的金屬納米粒子在含有蛋白的溶液以及其他生理溶液中是不穩(wěn)定的，因為納米粒子形成了聚集體且失去了它們的納米粒子形式和結構。出乎意料地，本發(fā)明人發(fā)現用于金屬納米粒子的表面改性的新型PEG-NAC組合物，使這樣的納米粒子能夠在含有蛋白的溶液以及其他生理溶液諸如例如血液和血漿中分散和溶解。與單獨通過含有硫醇的基團(如NAC)的表面改性相比，使用NAC-PEG來表面改性提供了優(yōu)良的結果，單獨通過含有硫醇的基團(如NAC)的表面改性不允許納米粒子在含有蛋白的溶液以及其他生理介質中的分散和溶解。根據另外的實施方案，本發(fā)明的新型PEG-NAC表面改性的重金屬納米粒子展示了改進的/增強的特性，諸如，例如改進的水溶性(即是高度親水性的);改進的穩(wěn)定性(超過6個月的長時間內穩(wěn)定以及在生理條件下穩(wěn)定);降低的毒性；改進的生物利用度(需要較低劑量的表面改性的重金屬納米粒子以獲得生物效應)；改進的藥代動力學特性(如通過血液中較高的半衰期來例示)；是可生物降解的；生產容易且有成本效率(甚至以較大的工業(yè)規(guī)模);以及類似特性。在另外的實施方案中，所述新型的表面改性的重金屬納米粒子的改進特性允許制備包覆的重金屬納米粒子的高濃制劑且還允許以粉末形式生產它們。在另外的實施方案中，本發(fā)明的新型的表面改性的重金屬納米粒子允許各種藥物附著于其，其還可以被用作載體以將藥物或其他物質遞送到期望的位置。因此，與含有其他金屬的納米粒子相比，具有降低的毒性和增強的生物效應的本發(fā)明的新型的表面改性的重金屬納米粒子使得能夠使用較高量的重金屬。
[0011]因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含重金屬芯和包覆層的表面改性的重金屬納米粒子，該包覆層包含至少一種配體，其中所述至少一種配體結合到重金屬納米粒子芯的表面，且其中所述至少一種配體共軛到聚合物。
[0012]根據一些實施方案，提供了包含以下的表面改性的重金屬納米粒子:重金屬芯和包覆層，所述包覆層包含共軛到聚乙二醇(PEG)的至少一種配體，其中所述至少一種配體選自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何組合；且其中所述至少一種配體結合到重金屬納米粒子芯的表面。在一些實施方案中，配體是N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些實施方案中，所述至少一種配體共價結合到重金屬納米粒子芯的表面。
[0013]在一些實施方案中，重金屬選自金、金物質(gold species)、銀、鉬、鐵、銅、鎳、鈕、銥、鈦或鉛。在一些實施方案中，重金屬是金物質。在另外的實施方案中，金物質可以選自AuC13、AuF3> AuBr3> HAuCl4或MAuCl4,其中M代表堿金屬陽離子。
[0014]在另外的實施方案中，納米粒子具有從約0.5nm到約400nm的尺寸。
[0015]在一些實施方案中，表面改性的重金屬納米粒子呈實質上干粉的形式。
[0016]在一些實施方案中，還提供了表面改性的重金屬納米粒子的水分散體。顆?？梢员环稚⒃谒谢蚓彌_液中。在一些實施方案中，緩沖液可以是在約4.5到約8之間的pH值下。
[0017]在一些實施方案中，提供了包含以下的表面改性的金納米粒子:金物質金屬芯和包覆層，包覆層包含共軛到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體結合到金物質納米粒子芯的表面。
[0018]根據一些實施方案，提供了包含共軛到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的組合物，用于金屬納米粒子的表面改性。
[0019]根據一些實施方案，提供了用于制備表面改性的重金屬納米粒子的工藝，該工藝包括以下步驟:
[0020]將共軛到聚乙二醇(PEG)的至少一種配體添加到包含金屬納米粒子的混合物中，其中所述至少一種配體結合到所述重金屬納米粒子芯的表面，產生表面改性的重金屬納米粒子，其中所述配體選自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何組合。在一些實施方案中，所述配體是N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些實施方案中，通過以下來制備所述混合物:
[0021](a)將至少一種表面活性劑與至少一種有機溶劑混合在水溶液中以產生乳液 '及
[0022](b)將重金屬物質的溶液和至少一種還原劑添加到步驟(a)的乳液中，以產生還原的金屬納米粒子。
[0023]在一些實施方案中，所述重金屬是金物質，選自AuC13、AuF3> AuBr3> HAuCl4或MAuCl4，其中M代表堿金屬陽離子。在一些實施方案中，重金屬納米粒子具有從約0.5到約400nm的尺寸。
[0024]在一些實施方案中，工藝還包括干燥水相，產生呈干燥形式的表面改性的重金屬納米粒子。
[0025]在一些實施方案中，工藝包括將重金屬納米粒子分散在水中或緩沖液中。緩沖液可以在約4.5到約8之間的pH下。
[0026]在一些實施方案中，所述至少一種表面活性劑包括至少一種脂肪酸。在一些實施方案中，所述至少一種脂肪酸是油酸。
[0027]在一些實施方案中，所述有機溶劑是乙醇。在一些實施方案中，所述至少一種還原劑是抗壞血酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸鈉、硼氫化鈉或硼氫化鋰中的任一種。在一些實施方案中，所述還原劑是抗壞血酸。
[0028]在一些實施方案中，工藝還包括添加至少一種第二有機溶劑。在一些實施方案中，所述第二有機溶劑選自己烷、環(huán)己烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯和甲苯。在一些實施方案中，
[0029]在一些實施方案中，提供了包含表面改性的重金屬納米粒子的藥物組合物。所述藥物組合物還可以包含藥學上可接受的添加劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或賦形劑中的至少一種。在一些實施方案中，所述藥物組合物適合于口服施用、注射或輸注。在一些實施方案中，所述藥物組合物用于醫(yī)學治療或醫(yī)學診斷。在一些實施方案中，所述藥物組合物用于治療或診斷惡性病癥，其中所述惡性病癥是癌癥、肉瘤、胚細胞瘤或母細胞瘤中的任一種。在另外的實施方案中，所述治療或診斷是在體外或在體內。
[0030]在另外的實施方案中，提供了包含所述藥物組合物的可注射溶液，所述藥物組合物包含表面改性的重金屬納米粒子。在另外的實施方案中，提供了包含所述可注射溶液的無菌注射器。
[0031]在一些實施方案中，提供了包含表面改性的重金屬納米粒子的水分散體的試劑盒。在一些實施方案中，所述分散體包含水或在約4.5到約8之間的pH值下的緩沖液，或包含所述分散體的藥物組合物；用于向患者施用所述水分散體或藥物組合物的裝置；以及使用說明書。
[0032]在一些實施方案中，提供了包含以下的試劑盒:呈干燥形式的所述表面改性的重金屬納米粒子；用于分散所述表面改性的重金屬納米粒子的水溶液。在一些實施方案中，所述分散體包含水或在4.5和8之間的pH值下的緩沖液；用于向患者施用所述水分散體的裝置；以及使用說明書。
[0033]在另外的實施方案中，提供了治療或診斷惡性病癥的方法，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的所述表面改性的重金屬納米粒子或包含所述表面改性的重金屬納米粒子的藥物組合物的步驟。可以通過口服、輸注或注射施用途徑進行施用。
[0034]在另外的實施方案中，提供了用于金屬納米粒子的表面改性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)-聚乙二醇(PEG)共軛物，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)能夠結合到金屬納米粒子芯的表面。在一些實施方案中，所述金屬是金物質。
[0035]附圖簡述
[0036]為了理解本發(fā)明并了解如何可以在實踐中進行本發(fā)明，現在將僅僅通過非限制性實例的方式，參考附圖來描述實施方案，在附圖中:
[0037]圖1A-1B是透射電子顯微鏡(TEM)圖像，該圖像顯示如通過在IOOnm(圖1A)和50nm(圖1B)放大率下黑點的出現所指示的表面包覆的金納米粒子的水分散體的場(field)。圖像指示，納米粒子是分開的且具有小于或等于IOnm的尺寸。
[0038]圖2.顯示用作重金屬納米粒子的表面涂層的PEG-NAC分子(共軛物/化合物)的1H-NMR 光譜。
[0039]圖3A-D顯示多次靜脈內(IV)注射不同濃度的金納米粒子后小鼠組的平均體重變化(g)隨時間(注射后的天數)的圖。圖3A-1組小鼠的體重變化(每隔一天用100mg/kg金納米粒子治療，持續(xù)6天)。圖3B-1I組小鼠的體重變化(用100mg/kg金納米粒子iv治療5天,停2天并繼續(xù)5天(5/2/5))。圖3C-1II組小鼠的體重變化(用150mg/kg金納米粒子iv治療，5/2/5)。圖3D-1V組小鼠的體重變化(用200mg/kg金納米粒子iv治療，5/2/5)。在給藥后進行26天的預定終止前,用GNP治療的動物中沒有出現死亡率；
[0040]圖3E.多次1.V.給藥單獨的200mg/ml PEG-NAC-金納米粒子(Gl)或與照射組合的200mg/ml PEG-NAC-金納米粒子(G2)后，健康雌性裸鼠中體重變化百分比隨時間的圖。
[0041]圖4.容納PEG-NAC表面包覆的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基皿(左手皿)或容納NAC表面包覆的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基皿(右手皿)的象形圖。與在其中觀察到GNP-蛋白共軛物的形成的容納相同濃度的NAC表面包覆的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基相比，容納PEG-NAC表面包覆的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基皿顯得澄清。
[0042]圖5A.NAC-金納米粒子在人血液中的象形圖，顯示形成了蛋白-GNP共軛物。
[0043]圖5B.PEG-NAC-黃金納米粒子在人血液中的象形圖，顯示沒有形成蛋白-GNP共軛物。
[0044]圖6A.顯示NAC表面改性的金納米粒子在具有腫瘤的小鼠的血漿中或腫瘤中的藥代動力學的圖。該圖顯示金在用NAC表面改性的金納米粒子注射的小鼠的血漿中或腫瘤中的濃度(注射后的小時數)。
[0045]圖6B.顯示PEG-NAC表面改性的金納米粒子在具有腫瘤的小鼠的血漿中或腫瘤中的藥代動力學的圖。該圖顯示金在用PEG-NAC表面改性的金納米粒子注射的具有腫瘤的小鼠的血漿中或腫瘤中的濃度(注射后的小時數);
[0046]圖6C.顯示PEG-NAC表面改性的金納米粒子(腫瘤AuPEG-GNP)或NAC表面改性的金納米粒子(“常規(guī)GNP”)在腫瘤中每克腫瘤注射劑量百分比(％)隨時間(注射后的天數)的圖。
[0047]圖6D.顯示PEG-NAC表面改性的金納米粒子(AuPEG-GNP)或NAC表面改性的金納米粒子(“常規(guī)GNP”)在血漿中每克血漿注射劑量百分比(％)隨時間(注射后的天數)的圖。
[0048]詳述
[0049]本公開內容基于研究結果:意外地提供了表面改性的重金屬納米粒子的穩(wěn)定的且無毒的水分散體，該納米粒子以高濃度存在于水分散體中，水分散體可以向受試者全身施用，并可以展示改進的特性，如降低的毒性、改進的穩(wěn)定性、增強的生物利用度、改進的藥代動力學以及類似特性。
[0050]發(fā)明人已經開發(fā)了表面改性的金屬納米粒子的新型水分散體和允許制備這些水分散體的方法學。尤其，發(fā)明人已經開發(fā)了新型表面改性的金納米粒子，其中表面改性包含共軛到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體結合到金物質納米粒子芯的表面。出乎意料地，這樣的改性向納米粒子提供改進的和增強的特性。如本文中所例示的，改進的特性包括這樣的特性如，但不限于:改進的水溶性(即是高度親水性的)；改進的穩(wěn)定性(超過6個月的長時間內穩(wěn)定并在生理條件下穩(wěn)定);降低的毒性；改進的生物利用度(需要較低劑量的表面改性的重金屬納米粒子以獲得生物效應);改進的藥代動力學特性(如通過在血液中較高的半衰期來例示)；是可生物降解的；生產容易且有成本效率(甚至以較大的工業(yè)規(guī)模)；以及類似特性。
[0051]發(fā)明人已經發(fā)現，在添加包覆配體從而獲得表面改性的金納米粒子之前，通過在乳液環(huán)境中制備中間態(tài)化合物，即還原的金納米粒子來形成表面改性的金納米粒子的穩(wěn)定水分散體是可能的。經由上面提到的中間步驟制備金納米粒子的水分散體有助于獲得穩(wěn)定的金納米粒子，該金納米粒子可以被穩(wěn)定地分散在水溶液中，尤其以相當大的濃度。
[0052]本文中所公開的表面改性的金屬納米粒子以高濃度存在于本發(fā)明的水分散體中，并在7.3-7.4的生理pH下，或在活細胞、組織、器官中，以及在體內或在體外環(huán)境中是穩(wěn)定的。此外，納米粒子可以通過全身施用，用作治療工具或用于診斷目的。
[0053]例如，以高濃度被包含的表面改性的金屬納米粒子的水分散體，可以通過金納米粒子比圍繞它們的其他輕原子顯著吸收更多的治療輻射的能力以及它們以電子和低能光子形式發(fā)射二次輻射的能力，而可能顯著地改進惡性病癥的輻射療法，該二次輻射在破壞癌細胞方面是非常有效的。
[0054]通過如下面所描述的新型制備方法來生產表面改性的金納米粒子的水分散體。
[0055]本發(fā)明包括如將在下面所描述的幾個方面，且可以概括如下:表面改性的金屬納米粒子、表面改性的金屬納米粒子的水分散體、它們的制備方法、包含它們的藥物組合物及其在醫(yī)學治療或診斷中的用途。
[0056]因此，根據一個方面，提供了包含重金屬芯和包覆層的表面改性的重金屬納米粒子，該包覆層包含至少一種配體，其中至少一種配體通過共價鍵結合到重金屬納米粒子芯的表面。
[0057]術語“納米粒子”在本文用于表示直徑小于約400nm的任何微觀顆粒，其中每個納米粒子在運輸特性和物理性質以及化學性質方面表現為完整單元。
[0058]如本文中所用的，術語“約”是指指示值的±10%。
[0059]術語“重金屬”在本文用于表示展示金屬特性的元素的子集的成員，其可以包括過渡金屬、類金屬、鑭系元素或錒系元素。
[0060]在一些實施方案中，重金屬可以是，例如金、鉬、銀、鐵、銅、鎳、鈀、銥、鈦或任何其他重金屬中的任一種。根據一個實施方案，金屬是鐵。
[0061]根據一些實施方案，金屬是金。根據另外的實施方案，金是選自AuC13、AuF3、AuBr3、HAuC14或MAuC14的金物質，其中M代表堿金屬陽離子。
[0062]如本文中所用的，術語“表面改性的重金屬納米粒子”是指包含在它們的表面上的包覆層的金屬納米粒子，由此包覆層改性納米粒子表面，且其中包覆層包含至少一種配體。在一些實施方案中，配體還可以共軛到聚合物。
[0063]如本文中所用的，術語“PEG-NAC表面改性的重金屬納米粒子”涉及重金屬芯納米粒子和包覆層，包覆層包含共軛到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體，其中N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體結合(共價或非共價)到重金屬納米粒子芯的表面。在示例性實施方案中，重金屬是金物質。
[0064]如本文中所用的，術語“PEG-NAC化合物”、“PEG-NAC共軛物或“PEG-NAC分子”可以被互換使用，并涉及包含共軛到N-乙酰半胱氨酸(NAC)的聚乙二醇(PEG)的化合物。
[0065]如本文中所用的，術語“NAC表面改性的重金屬納米粒子”涉及重金屬芯納米粒子和包覆層，該包覆層包含不共軛到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體。N-乙酰半胱氨酸(NAC)配體結合(共價或非共價)到重金屬納米粒子芯的表面。在示例性實施方案中，重金屬是金物質。
[0066]如本文中所用的，術語“ GNP ”是指金納米粒子。
[0067]如本文中所用的，具有至少一種配體的納米粒子表面的包覆是例如包覆納米粒子的芯的外表面的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%。
[0068]如本文中所用的術語“配體”是可溶于水，并能夠結合(共價或非共價)金屬納米粒子芯的表面，且因此通過包覆表面來改性納米粒子的表面從而形成表面改性的金屬納米粒子的任何有機配體。
[0069]在一些實施方案中，配體是N-乙酰半胱氨酸、白蛋白或氨基酸(如例如，但不限于半胱氨酸、甲硫氨酸和谷胱甘肽)、氨基硫醇、硫代羧酸、氨和胺、二胺或其任何組合，或能夠結合金納米粒子的任何配體中的至少一種。
[0070]在一個實施方案中，配體可以是N-乙酰半胱氨酸。在一個實施方案中，配體可以是半胱氨酸。
[0071]根據本公開內容，配體可以具有至少一個游離巰基，該巰基可以例如經由配體的任一種硫基和金屬原子的相互作用而結合到金屬納米粒子。
[0072]根據一些實施方案，配體可以共軛到聚合物上。在一個實施方案中，該聚合物是聚乙二醇(PEG)。
[0073]根據一個實施方案,表面改性的金屬納米粒子具有約0.5nm到約400nm的尺寸。
[0074]在一些實施方案中，尺寸小于lOOnm，例如小于90nm，小于80nm，小于70nm，小于60nm,小于50nm,小于40nm,小于30nm,小于20nm,或小于10nm。在一些實施方案中，納米粒子具有小于IOnm的尺寸。
[0075]在一些實施方案中，表面改性的重金屬納米粒子可以呈實質上干粉形式。在適當條件下，例如在真空條件下，在約2°C到約8°C之間的溫度下，干粉可被長時間儲存，可能直到進一步使用。
[0076]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了分散在水中或在約4.5到約8之間的pH下的緩沖液中，例如，在約7.3到約7.4之間的pH的生理緩沖液中的表面改性的重金屬納米粒子的水分散體。
[0077]根據一些實施方案，可以通過將包含表面改性的重金屬納米粒子的干粉溶解在水中或在約4.5到約8之間的pH下，例如在約7.3到約7.4的生理pH下的緩沖溶液中來獲得表面改性的重金屬納米粒子的水分散體。
[0078]當在2V _8°C的適當的儲存條件下儲存時，本發(fā)明的表面改性的納米粒子分散體在化學上和物理學上穩(wěn)定儲存至少3個月，且甚至6個月的時間。
[0079]本公開內容的上下文中的“穩(wěn)定性”可以通過各種化學方法和/或物理方法來確定，且應被視為意指沒有觀察到聚集體或沉淀的顯著形成。在這些儲存條件下，沒有觀察到聚集體或沉淀的形成。在一些實施方案中，“穩(wěn)定性”是指保持粒子的納米尺寸。
[0080]一般來說，可以理解，穩(wěn)定取決于配體在分散介質中的溶解性、納米粒子將配體結合在它們表面上的能力以及通過配體的表面覆蓋度。
[0081]本發(fā)明的表面改性的金屬納米粒子的水分散體可以用于癌癥治療。如示例性實施方案中所示的，當將癌細胞在包含金納米粒子的水分散體的介質中溫育時，金納米粒子以一定的量被遞送入癌細胞中且沒有觀察到毒性副作用，該一定的量取決于在溫育培養(yǎng)基中的納米粒子濃度，和取決于溫育時間。
[0082]本公開內容提供了制備表面改性的重金屬納米粒子的方法，該方法包括以下步驟:
[0083](a)將至少一種表面活性劑與至少一種有機溶劑混合在水溶液中以產生乳液；
[0084](b)將重金屬物質的溶液和至少一種還原劑添加到步驟(a)的乳液中，以產生還原的金屬納米粒子；
[0085](C)將至少一種配體添加到步驟(b)的混合物中，其中至少一種配體結合重金屬納米粒子芯的表面，產生表面改性的重金屬納米粒子。
[0086]該方法還可以包括額外的步驟(d)，該步驟(d)包括分離包含重金屬納米粒子的無機相與有機相。
[0087]在一些實施方案中，步驟(a)的至少一種有機溶劑是水溶性的有機溶劑。在一些實施方案中，在步驟(a)將至少一種表面活性劑與至少一種第一水溶性的有機溶劑混合在水溶液中以產生乳液。
[0088]術語“表面改性的重金屬納米粒子”是指包覆有配體的重金屬納米粒子，其中配體結合到金屬納米粒子的表面，從而改性了所述表面，且其中“重金屬”可以是金、鉬、銀、鐵、銅、鎳、鈀、銥、鈦或任何其他重金屬中的任一種。在一個實施方案中，金屬是金。在一些實施方案中，配體還可以共軛到另一種物質，如聚合物。
[0089]根據工藝(a)的第一步驟，當在堿性堿溶液或水溶液中將至少一種表面活性劑和至少一種第一水溶性的有機溶劑混合后獲得乳液。[0090]在本發(fā)明的上下文中，術語“乳液”應理解為兩種或更多種不可混溶的(不可混合的)液體的混合物。乳液由分散且連續(xù)的相組成；這些相之間的邊界被稱為界面。由于分散相的小尺寸，微乳液往往顯得澄清。
[0091]在本發(fā)明的上下文中，術語“表面活性劑”可以是指降低液體的表面張力的化合物。
[0092]在一些實施方案中，表面活性劑可以包括脂肪酸，其中脂肪酸可以是，例如長鏈的飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸。
[0093]在一些實施方案中，脂肪酸可以選自例如油酸、亞油酸或芥酸、棕櫚油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、肉豆蘧烯酸。根據一些實施方案,脂肪酸是油酸。
[0094]根據一些實施方案，至少一種表面活性劑可以包括脂肪酸的混合物。根據一些其他實施方案，脂肪酸的混合物可以主要包括油酸。在一些特定的實施方案中，脂肪酸的混合物包含65% wt.的油酸。
[0095]在該發(fā)明的上下文中，至少一種“第一水溶性的有機溶劑”應是指與水混合時形成基本均勻的混合物的任何有機溶劑。根據本發(fā)明的水溶性的有機溶劑可以是乙醇或丙酮。根據一些實施方案，水溶性的有機溶劑可以是乙醇。
[0096]在本發(fā)明的上下文中，術語“堿性溶液”應是指可溶堿的溶液，其中，由一般的化學定義來定義“堿”，其中堿是能接受水合氫離子的物質。
[0097]根據本發(fā)明所用的堿可以是任何堿性堿，例如氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液或任何其他堿性金屬氫氧化物，但其他堿也可能是合適的，包括例如氨。在一些實施方案中，堿是氫氧化鈉。
[0098]包含至少一種表面活性劑，其中表面活性劑可以是例如脂肪酸或脂肪酸混合物；至少一種第一水溶性的有機溶劑的溶液可以在部分溶解脂肪酸的條件下在堿性溶液中混合以形成乳液。
[0099]在如室溫的溫度下，可以例如使用磁力攪拌器混合合適的時間量，例如約5分鐘。
[0100]根據工藝(b)的第二步驟，將重金屬物質的溶液和至少一種還原劑添加到上面所詳述的乳液中以產生還原的金屬納米粒子。
[0101]在一些實施方案中，“重金屬”可以是如上面所定義和所詳述的任何金屬物質。在一些實施方案中，金屬是金。
[0102]如本文中所用的“離子金屬物質”被認為是含有或可以產生(且因此是前體)金屬離子的任何物質或化學實體。
[0103]根據一些實施方案,其中金屬是金離子金物質”可以選自AuC13、AuF3、AuBr3、HAuC14或MAuC14，其中M代表堿金屬陽離子，例如鈉陽離子或鉀陽離子。根據一些其他實施方案，離子金物質是HAuC14。因此，HAuC14是產生[AuC13]-離子的前體離子物質。
[0104]根據一些其他實施方案，“離子金屬物質”可以選自FeC12、FeS04、FeC13。
[0105]本文中所用的至少一種“還原劑”是能夠還原乳液內的離子金屬物質的試劑。在一些實施方案中，還原劑是有機的或無機的。這樣的還原劑的非限制性實例可以是例如抗壞血酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、存在或缺乏丹寧酸的檸檬酸鈉、硼氫化鈉、具有檸檬酸鈉或EDTA和氰基硼氫化物的混合物中的硼氫化物、肼、二苯基氨基磺酸鈉或硼氫化鋰及其任何組合中的任一種。[0106]根據一些其他實施方案，還原劑是抗壞血酸。
[0107]在金屬是金的實施方案中，可以以相對于離子金物質的2:1的摩爾比添加還原劑。
[0108]可以根據本發(fā)明使用的可選擇的還原方法可以是例如照射方法，如超聲波、UV照射或脈沖或激光輻解。
[0109]在金屬是金的實施方案中，在混合過程中可以添加離子金屬物質，并可以任選地產生淡黃色的溶液。在添加包含至少一種還原劑的溶液之后，溶液顏色可以變成紅葡萄酒的紫色，可能表明離子金物質的還原的完成。
[0110]在本申請的上下文中，應該理解，在乳液中添加金屬物質可以提供控制所形成的納米粒子的尺寸且因此能夠形成預定尺寸的納米粒子的方法。
[0111]根據工藝(C)的第三步驟，至少一種配體被添加到上面的混合物中。
[0112]如本文中所用的術語“配體”是如上面所詳述的，且可以是溶于水且能夠通過結合(共價或非共價)到金屬來包覆金屬納米粒子的表面從而形成表面改性的金屬納米粒子的任何有機配體。
[0113]至少一種具有至少一個游離硫基的配體的共價結合，可以是例如經由配體的任一種硫基和金屬原子的相互作用。
[0114]在一些實施方案中，配體是N-乙酰半胱氨酸、白蛋白和氨基酸(例如，半胱氨酸和甲硫氨酸、谷胱甘肽)、氨基硫醇、硫代羧酸、氨和胺、二胺或其任何組合，或能夠結合金屬納米粒子的任何配體中的至少一種。
[0115]在一些實施方案中，配體是N-乙酰半胱氨酸。在一些實施方案中，配體是半胱氨酸。金屬和配體之間的摩爾比可以是1:4，優(yōu)選1:6，更優(yōu)選1:8。
[0116]根據本發(fā)明，配體可以共軛到聚合物上。根據本公開內容的聚合物是惰性且無毒的聚合物。通常使用的聚合物包括，不限于此:聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(乙酸乙烯酯)、聚酰胺胺(樹枝狀大分子)、聚二噻富烯、殼聚糖。
[0117]在一些實施方案中，聚合物可以是線性聚合物，例如PEG。
[0118]根據本公開內容，在將至少一種配體添加到如上面所詳述的混合物中前，可以進行PEG與至少一種配體的共軛。
[0119]根據一些實施方案，金屬納米粒子的表面改性是共軛到聚乙二醇(PEG)的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的化合物。在一些實施方案中，金屬納米粒子和NAC-PEG化合物之間的摩爾比可以是在約1:1到1:20的范圍內。例如，在一些實施方案中，金屬納米粒子和NAC-PEG化合物之間的摩爾比可以是1:1。例如，在一些實施方案中，金屬納米粒子和NAC-PEG化合物之間的摩爾比可以是1:2。例如，在一些實施方案中，金屬納米粒子和NAC-PEG化合物之間的摩爾比可以是1:4。例如，在一些實施方案中，金屬納米粒子和NAC-PEG化合物之間的摩爾比可以是1:8。例如，在一些實施方案中，金屬納米粒子和NAC-PEG化合物之間的摩爾比可以是1:10。例如，在一些實施方案中，金屬納米粒子和NAC-PEG化合物之間的摩爾比可以是1:20。
[0120]根據一些實施方案，提供了 NAC-PEG化合物。在一些實施方案中，NAC-PEG化合物可以用于金屬納米粒子的表面改性。
[0121]根據本發(fā)明，表面改性的重金屬納米粒子的水分散體可以共軛到第二分子例如抗體，其中抗體可以有助于將金屬納米粒子例如靶向到如例如診斷中所關注的位點。此外，本發(fā)明的納米粒子可以共軛到在視覺上或以其他方式可檢測的部分，例如發(fā)色團或熒光團。
[0122]添加至少一種配體后，可以混合溶液合適的時間段，例如，但不限于約30分鐘，更優(yōu)選多于I小時。
[0123]將至少一種配體添加到含有還原的金屬納米粒子的混合物中可以導致水溶性的表面改性的金屬納米粒子的形成。
[0124]根據一些實施方案，在添加至少一種配體的過程中，可以將pH調節(jié)到堿性的pH，優(yōu)選高于9、9.5、10的pH的pH值，優(yōu)選高于pH9的pH值。這可以允許大部分脂肪酸被轉變成脂肪酸鹽，這又允許配體結合金納米粒子。
[0125]根據本發(fā)明，可以使用例如通過用任何堿性堿，可能氫氧化鈉或氫氧化鉀的滴定來調節(jié)pH。
[0126]根據一些另外的實施方案，可以將至少一種第二有機溶劑添加到含有水溶性的表面改性的金納米粒子的溶液中，且其后可以將PH調節(jié)到酸性pH?？梢詳嚢枞芤豪缰辽僖恍r。
[0127]根據本發(fā)明，“第二有機溶劑”是與在酸性pH下溶解脂肪酸的與水不溶混的任何有機溶劑。添加該溶劑往往導致兩相分離成未乳化的性質不同的相，從而分離有機相與水相。
[0128]在一些實施方案中，第二有機溶劑是己烷、環(huán)己烷、乙醚、戊烷、環(huán)戊烷、氯仿、乙酸乙酯或甲苯。根據一些實施方案，第二有機溶劑是己烷。
[0129]根據一些實施方案，添加第二有機溶劑并將pH調節(jié)到酸性pH，例如，低于pH7、低于ρΗ6.5、低于ρΗ6、低于ρΗ5.5、低于ρΗ5，低于ρΗ4.5，低于4、低于ρΗ3的酸性pH。在一些實施方案中，pH低于pH6.5。可以使用任何酸，例如鹽酸來調節(jié)pH。
[0130]添加第二有機溶劑并將pH調節(jié)到酸性pH使相分離成為可能，其中將乳液分離成水相和有機相。
[0131]水相可以包含表面包覆的金屬納米粒子，其中有機相可以包含有機溶劑和脂肪酸。
[0132]根據一些實施方案，添加第二有機溶劑后，還可以將至少一種配體添加到反應混合物中。根據一些實施方案，至少一種配體將結合金屬納米粒子的表面上的游離位點。根據該實施方案，配體可以是例如白蛋白，該白蛋白可以被添加并可以允許將混合物在磁力攪拌器上攪拌例如30分鐘。
[0133]相分離后，可以例如通過合適的裝置，如例如，通過使用分液漏斗來分離有機相與水相。
[0134]根據本發(fā)明，還可以干燥水相。根據本發(fā)明，干燥水相可以是，例如通過蒸發(fā)、真空干燥、冷凍干燥(凍干法)、干燥或去除水殘留物或水分并獲得例如呈粉末形式的固體的產物的任何其它合適的技術。
[0135]在一些實施方案中，干燥可以包括蒸發(fā)微量的第一水溶性的有機溶劑，產生表面改性的金屬納米粒子的干粉。
[0136]在一些實施方案中，可以將干粉溶解在水中或在約4.5到約8之間的pH下，優(yōu)選
7.3-7.4的生理pH下的緩沖液中。溶解干粉產生表面改性的重金屬納米粒子的水分散體。
[0137]在一些實施方案中，金屬納米粒子的水分散體包含以從約Inm到約lOOnm，從約Inm 到 IOnm,從約 IOnm 到 20nm,從約 20nm 到 30nm,從約 30nm 到 40nm,從約 40nm 到 50nm,從約50nm到60nm,從約60nm到70nm,從約70nm到80nm,從約80nm到90nm,從約90nm到IOOnm的尺寸的金屬納米粒子。在一些實施方案中，金屬納米粒子具有小于IOnm的尺寸。
[0138]將本發(fā)明的金屬納米粒子以0.001 μ M-1M的濃度，例如以大于0.005Μ,大于0.01Μ,大于0.05Μ，大于0.1Μ，或有時大于0.5Μ的濃度分散在水溶液中。
[0139]可以通過使用兩相微乳液方法來進行金屬納米粒子的制備(例如，如由Μ.Burst等人，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.S，1994，7，801-802所描述的)。因此，將含有金屬的試劑從水相轉移到有機相。添加表面活性劑溶液后，形成了微乳液。還原反應在分散相中進行，該分散相中液滴尺寸是至多l(xiāng)OOnm。因此，實際上形成了單分散的納米粒子。在合成納米粒子的微乳液方法中，經常將烷烴硫醇添加到反應溶液中，用于穩(wěn)定顆粒。將最終的金納米粒子分散在有機相中，用烷烴硫醇穩(wěn)定。
[0140]在另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，該藥物組合物包含如本文中所公開的表面改性的重金屬納米粒子。在一些實施方案中，藥物組合物和制劑可以包含無菌水溶液，其還可以包含至少一種藥學上可接受的添加劑，如但不限于滲透增強劑、載體化合物、緩沖液、穩(wěn)定劑、稀釋劑或其它藥學上可接受的載體或賦形劑。
[0141]根據一些實施方案，藥物組合物可用于醫(yī)學治療或醫(yī)學診斷。
[0142]本公開內容的藥物組合物可例如用于惡性病癥的醫(yī)學診斷。如本文中所用的“醫(yī)學診斷”是指確定可能的疾病或病癥的特性。診斷可以基于跡象、癥狀和測試結果的組合。根據本公開內容，藥物組合物可以例如在癌癥檢測中用作例如用于分子成像的探針、用于光學成像的光活性劑、在計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)或能夠檢測癌癥且另外提供評價的任何方法中的造影增強劑。
[0143]本發(fā)明的藥物組合物還可以包含額外的治療活性劑。
[0144]根據一些實施方案，藥物組合物可以適合于口服施用、注射或輸注。
[0145]本公開內容的藥物組合物可用于例如，治療惡性病癥或細胞增殖性病癥，如，例如，可以是例如實體腫瘤或非實體腫瘤的惡性腫瘤。在一些實施方案中，本公開內容的藥物組合物可用于例如，治療與細胞的增加的、增強的或異常的增殖相關聯的非惡性病癥。
[0146]在一些實施方案中，惡性病癥可以是，例如，實體腫瘤如癌癥、肉瘤、黑色素瘤、胚細胞瘤或母細胞瘤。
[0147]在一些實施方案中，惡性病癥可以是，例如在嘴唇和口腔、咽、喉、鼻旁竇、大唾液腺、甲狀腺、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、肛管、肝、膽囊、肝外膽管、法特氏壺腹、外分泌胰腺、肺、胸膜間皮瘤、骨、軟組織肉瘤的腫瘤；皮膚、乳房、外陰、陰道、子宮頸、子宮體、卵巢、輸卵管、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、陰莖、前列腺、睪丸、腎、腎盂、輸尿管、膀胱、尿道的癌癥和惡性黑色素瘤；眼瞼癌、結膜癌、結膜的惡性黑色素瘤、血管膜的惡性黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、淚腺癌；眼窩、腦、脊髓、血管系統(tǒng)的肉瘤；血管肉瘤和卡波濟氏肉瘤。
[0148]在一些實施方案中，惡性病癥可以包括，例如，非實體腫瘤，如白血病或淋巴瘤。
[0149]在一些實施方案中，醫(yī)學治療可以是,例如,惡性病癥的輻射治療或與輻射治療組合的任何治療。因此，包含金屬納米粒子的水分散體的藥物組合物可用于輻射治療以增強惡性病癥的治療中的選擇性。
[0150]輻射治療應理解為使用高能輻射源的治療，高能輻射源例如但不限于X射線、Y射線，以及通過影響癌細胞生活力用于癌癥治療的帶電顆粒。
[0151]可以通過外部光束輻射源裝置、同步加速器輻射源或可選擇地通過內部輻射源如身體內遞送的放射性物質將輻射遞送到接近癌細胞的位置，如短程治療。
[0152]在其他實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以與任何過熱治療組合，例如與激光、UV、RF、超聲波以及所用的任何其他過熱源組合使用。
[0153]應當理解，表面改性的金屬納米粒子的水分散體本身可以在治療上用于醫(yī)學治療或醫(yī)學診斷或者可選擇地與輻射組合或與常規(guī)使用的任何治療方法組合使用。
[0154]根據一些實施方案，可以例如通過全身施用或局部施用向患者施用藥物組合物。
[0155]術語“全身施用”應是指包括腸內施用的施用途徑，包括例如口服、直腸、舌下或含服施用或腸胃外施用，腸胃外施用可以包括例如刺穿皮膚或粘膜。
[0156]術語“局部施用”應是指包括應用到身體部分的表面的施用途徑。
[0157]在一些實施方案中，施用途徑可以包括，例如，靜脈內(1.V.)、肌內(1.m.)、腹膜內(1.P.)、透皮、經粘膜、瘤內、胃內、鼻內或例如通過片劑、膠囊、錠劑或滴劑口服或例如通過霜劑、皮膚貼片以及類似物的局部施用，或其任何組合。
[0158]在一些實施方案中，可以經由胃內施用或口服施用通過消化系統(tǒng)將藥物組合物遞送入循環(huán)。
[0159]在一些實施方案中，可以通過注射或輸注施用藥物組合物。
[0160]在一些實施方案中，可以給所關注的目標直接施用藥物組合物，例如，用于輻射治療。在一些實施方案中，例如，通過注射，施用可以接近待治療的腫瘤。
[0161]應理解，表面改性的金屬納米粒子的水分散體本身可以如上面對藥物組合物所描述的來施用。
[0162]如本文中可以理解的，可以通過使用有效量的表面改性的金屬納米粒子的水分散體或含有該水分散體的組合物來實現如根據本發(fā)明所描述的治療。
[0163]術語“有效量”、“治療有效量”或“劑量”在本文中可交換地使用，且意指達到所選結果所需要的任何量，其現在可以包括用于治療癌癥或增殖的惡性或非惡性的病癥尤其是殺死癌細胞或其他不正常的細胞所需的金屬納米粒子的量。
[0164]治療有效量或劑量取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴重性和應答性，療程持續(xù)一個小時到幾個小時，或直到實現治愈，或實現疾病狀態(tài)的減少?？梢砸园刻煲淮问┯没蛎刻於啻问┯脛┝康姆桨赶蛴行枰娜颂峁﹦┝?。
[0165]普通技術人員可以容易地確定最佳劑量、劑量方法學和重復率。最佳劑量可以根據本發(fā)明的表面改性的金納米粒子的水分散體或包含該水分散體的組合物的相對效力而變化，且通常可以根據EC50來估計，發(fā)現在體外細胞模型、體外器官或組織模型以及在體內動物模型中是有效的。本領域的普通技術人員可以容易地根據測量的停留時間、可以例如受有需要的受試者的年齡、性別和體重影響的濃度，來估計劑量的重復率。
[0166]根據本公開內容，當在組合治療例如輻射治療或所用的任何另外的治療中使用時，可以相應地調節(jié)劑量。
[0167]在本文中可以互換使用術語“疾病”、“病癥”和“病狀”。
[0168]如本文中用來描述本發(fā)明的，“惡性腫瘤(malignant)”、“癌癥”、“腫瘤”、“惡性腫瘤(malignancy)”、“惡性增殖”、“過度增殖”全部等效地涉及組織或器官的增生。[0169]如本文中所用的術語“治療(treat)”、“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指改善了具有癌癥或惡性增殖或非惡性疾病的患者體內的疾病活動的一個或多個臨床征象。本文中“治療”是指治療學治療。
[0170]在一些實施方案中，在體外或體內可以使用表面改性的金屬納米粒子的水分散體或包含該水分散體的藥物組合物進行惡性病癥的治療或診斷。
[0171]如本文中所用的，術語“在體內”可以是指體內治療或體內診斷，且應理解為在活的有機體中發(fā)生的過程。當是指在體內的診斷時，術語在體內還應理解為可以在活的有機體中以侵入的或非侵入的方式來進行的任何診斷，例如但不限于MR1、CT。
[0172]術語“體外”包括對可以從有需要的患者提取的體液如血液、尿、唾液或腦脊液(CSF)、器官或組織進行的任何治療或診斷。
[0173]在本發(fā)明的另一方面，提供了如上面所描述的表面改性的重金屬納米粒子在制備藥物組合物中的用途。
[0174]在一些實施方案中，藥物組合物可用于如上面所描述的醫(yī)學治療或醫(yī)學診斷。
[0175]在本發(fā)明的又一方面，提供了包含表面改性的重金屬納米粒子的水分散體或包含如上面所描述的水分散體的藥物組合物的可注射溶液。在一些實施方案中，提供了包含該溶液的無菌注射器。該注射器可以例如是一次性的且從而使用一次或被制造用于多次使用程序。
[0176]在本發(fā)明的又一方面，提供了可以包含分散在水中或在水溶液中的表面改性的重金屬納米粒子的水分散體的試劑盒。在一些實施方案中，水溶液包含在4.5和8之間的pH值下；例如在約7.3到7.4的生理pH值下的緩沖液，或包含水分散體的組合物；用于向患者施用水分散體或組合物的裝置；及使用說明書。
[0177]在本發(fā)明的另一方面，提供了可以包含呈干燥形式的表面改性的重金屬納米粒子、用于分散表面改性的重金屬納米粒子的水溶液的試劑盒。在一些實施方案中，水分散體包含水或在4.5和8之間的pH值下，例如，在約7.3到7.4的生理pH值下的緩沖液，用于向患者施用水分散體的裝置；及使用說明書。
[0178]分散表面改性的重金屬納米粒子或含有表面改性的重金屬納米粒子的藥物組合物的水溶液，可以包括另外的組分，只要組分與分散體是相容的，其中相容應理解為例如不引起沉淀或不引起聚集的組分。
[0179]應理解，通過本文中所公開的制備方法制備的并在本文中所公開的治療方法中使用的表面改性的重金屬納米粒子分散體以及組合物的有利的穩(wěn)定性提供了使表面改性的重金屬納米粒子維持在水分散體中達延長的時間段或可選擇地維持在干燥的形式的方式和可能性。
[0180]因此，本文中所公開的試劑盒可以包含重金屬納米粒子的水分散體和用于施用該水分散體的裝置，例如無菌注射器。在可選擇的實施方案中，無菌注射器可以整體包含呈即時使用形式的藥物組合物，該藥物組合物包含重金屬納米粒子的水分散體。
[0181]本發(fā)明的試劑盒可以包含例如在瓶子、小瓶或安瓿中呈干燥形式的表面改性的重金屬納米粒子；以及用于分散它們且從而在水或在4.5和8之間的pH值下，優(yōu)選在約7.3到7.4的生理pH值下的緩沖液中原位制備水分散體的水溶液；用于注射組合物的裝置，如無菌注射器。[0182]試劑盒可以包含無菌注射器，該無菌注射器可以包含呈干燥形式的表面改性的重金屬納米粒子，一旦使用，呈干燥形式的表面改性的重金屬納米粒子被分散，并從而在水或在例如4.5和8之間的pH值下；例如，在約7.3到7.4的生理pH值下的緩沖液中制備納米粒子的分散體，它們全部在注射器中。
[0183]本發(fā)明還提供了治療或診斷惡性病癥的方法。本發(fā)明的方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的如上面所描述的表面改性的重金屬納米粒子或包含表面改性的重金屬納米粒子的藥物組合物。應理解，本發(fā)明的方法可以任選地使用如由本發(fā)明所定義的試劑盒。治療或診斷的方法可以包括借助于例如口服施用、輸注或注射來施用。
[0184]下面呈現用金作為納米粒子的重金屬芯的本發(fā)明的實施方案，作為本發(fā)明的實踐的非限制性實例，其還可以在根據本發(fā)明的納米粒子組合物和分散體中利用其他金屬芯。
[0185]如說明書和所附權利要求中所用的且根據長期存在的專利法實踐，除非上下文清楚地規(guī)定，否則單數形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”通常是指“至少一個”、“一個或多個”以及其他復數指代物。因此，例如“一個細胞”和“一個納米粒子”包括細胞的混合物和一個或多個所描述類型的納米粒子。
[0186]在整個該說明書和隨后的權利要求中，除非上下文要求，否則單詞“包含(comprise)”及變化形式例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”應理解意指包含所述整數或步驟、或整數或步驟的組，但不排除任何其他整數或步驟、或整數或步驟的組。
實施例
[0187]材料和方法:
[0188]油酸-65.0-88.0%(GC) (Aldrich)
[0189]乙醇-Frutarom (絕對化學純)
[0190]HAuCl4.3H20_ACS 試劑，Sigma Aldrich
[0191]抗壞血酸-測試的細胞培養(yǎng)，Sigma Aldrich
[0192]N-乙酰半胱氨酸-Sigma 級，Sigma Aldrich
[0193]半月光氛酸->97%(Aldrich), Sigma Aldrich
[0194]NaOH - SigmaUItra, Sigma Aldrich
[0195]正己燒-化學純，Frutarom
[0196]EMT-6癌細胞-小鼠乳腺癌細胞系[Technion, Israel]
[0197]DMEM>D-葡萄糖、FBS、L_ 谷氨酸胺溶液、Pen-Strep 溶液-Biological Industries
[0198]膜蛋白酶-EDTA溶液-Biological Industries
[0199]王水-王水是通常以各自3:1的摩爾比的鹽酸和硝酸的混合物
[0200]HCl - TraceSelect, Fluka Analytical
[0201]HNO3 - TraceSelect, Fluka Analytical
[0202]實施例1:制備包覆有N-乙酰半胱氨酸(NAC)的金納米粒子
[0203]將脂肪酸的混合物(3.75ml，65%油酸，亞油酸18%，棕櫚酸16%)、Na0H200mg和乙醇(15ml)添加到30ml的水(Mill1-Q，Millipore)中，并且允許溶液在磁力攪拌器上攪拌5分鐘。
[0204]然后，攪拌同時添加HAuCl4(50mg)，產生了淡黃色的溶液，接著緩慢地將5ml0.05M抗壞血酸添加到溶液中。當完成金物質的還原時(如通過溶液的顏色變成酒紅色所指示的)，將N-乙酰半胱氨酸(124mg)緩慢地添加到溶液中。允許溶液攪拌30分鐘。
[0205]然后用Na0H2M將pH緩慢調節(jié)到pH=9，并允許所得溶液在磁力攪拌器上進一步攪拌至少一個小時。
[0206]之后，添加正己烷(20ml)，并將溶液繼續(xù)在磁力攪拌器上攪拌至少另外的一小時。
[0207]然后，用HCl溶液(37%)將所得的反應混合物的pH調到pH=7。
[0208]使用分液漏斗將混合物分成兩相，即有機相和水相。在真空下蒸發(fā)水相以去除微量的有機溶劑。將包含表面改性的金納米粒子的干粉溶解在5ml水(Mill1-Q，Millipore)中，產生表面改性的金納米粒子的水分散體。使用滲析管滲析水分散體以去除不需要的產物。
[0209]按照本文所描述的制備的表面改性的金納米粒子的水分散體以如圖1A和IB中所闡明的單獨的納米粒子存在。如在圖1A和IB中所示，顯示為黑“點”的納米粒子是分離的，并不形成聚集體。此外，可以看出，金納米粒子以等于或小于IOnm的尺寸存在。
[0210]實施例2-制備包覆有N-乙酰半胱氨酸(NAC)和白蛋白的金納米粒子
[0211]將油酸(3.75ml)、Na0H200mg 和乙醇(15ml)添加至Ij 30ml 7jC(Mill1-Q,MiIlipore)中，允許溶液在磁力攪拌器上攪拌5分鐘。
[0212]然后，添加HAuCl4(50mg)產生淺黃色溶液，攪拌同時，將5ml0.05M抗壞血酸緩慢添加到溶液中。當完成Au的還原時(溶液的顏色變?yōu)榫萍t色)，將N-乙酰半胱氨酸(111.6mg,在5ml水中)緩慢添加到溶液中。允許溶液攪拌30分鐘。
[0213]然后使用Na0H2M將pH慢慢調節(jié)到pH=9，并允許所得的溶液在磁力攪拌器上攪拌至少一小時。之后，添加正己烷(20ml)，在磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌溶液至少另外的一小時。
[0214]用HCl溶液(37% )將所得的反應混合物的pH調節(jié)到pH=7。
[0215]然后，添加過量的白蛋白，并允許混合物在磁力攪拌器上攪拌30分鐘。
[0216]用分液漏斗將混合物分成兩相，即有機相和水相。在真空下蒸發(fā)水相，以去除微量的有機溶劑。將包含表面改性的金納米粒子的干粉溶解在5ml水(Mill1-Q，Millipore)中。
[0217]實施例3-制各N-乙酰半胱氡酸(NAC)和聚乙二醇(PEG)衍牛物
[0218]材料和方法:合成前體(N-乙酰-L-半胱氨酸> 99%，及對甲苯磺酸一水合物>98.5 %，和聚(乙二醇)-600)均購自Sigma-Aldrich，沒有進行進一步純化。溶劑(甲苯> 99.5%,甲醇“分析的(analytical)”,和二氯甲燒“Ar”>99.9% )分別購自Frutarom和Gadot，且沒有進行進一步純化就被使用。用于NMR測量的氘化溶劑(DMS0-d6和D20)購自Sigma-Aldrich。用于色譜法的溶劑是分析等級。碳酸鈉(Na2C03) >99.8 %,及硫酸鈉(Na2S04)>99%購自Frutarom。分析薄層色譜法(TLC)用F-254的指示器在娃膠板上進行，通過用UV光照射顯像。用娃膠(Grace)0.040-0.063mm (Merck)進行柱色譜法。在BrukerAvance400 (400MHzlH NMR)上記錄IH NMR光譜。以ppm報告化學位移值(δ )(對于1Η，TMS δ =Oppm ;對于1Η，殘留的DMS0_d6 δ =2.5ppm)。質子光譜被報告為以下δ (多重性、耦合常數J、質子數、部分)。通過s (單峰)、t (三重峰)、m (多重峰)等等，來指示多重性。
[0219]制備NAC:PEG分子:250ml單頸圓底燒瓶配備有磁力攪拌器、迪安-斯達克榻分水器和回流冷凝器。用甲苯(150ml)中的N-乙酰半胱氨酸(“NAC”3.26g，20mmol)和聚(乙二醇)-600 (“PEG-600”，12.0g,20mmol))裝載燒瓶。添加對甲苯磺酸一水合物(“p-TSA”，4.0g，21mmol)，并將攪拌的混合物在油浴(約140°C )中在回流下加熱2_3小時(用TLC監(jiān)測反應)。允許混合物冷卻至環(huán)境溫度，并觀察到兩相。通過添加碳酸鈉(2g)來中和混合物，并攪拌2小時(氣體冒泡)。在減壓下蒸發(fā)溶劑并將殘余物溶解在二氯甲烷中，過濾沉淀物，將有機相經無水硫酸鈉干燥，過濾并用旋轉蒸發(fā)器濃縮以產生粘性油。
[0220]通過硅膠柱色譜法(洗脫液:012(:12:0130!1，95:5)來純化產物。收集適當的部分，并用旋轉蒸發(fā)器濃縮，以產生作為黃色粘性油的7.4g (9.7mmol,48.5%)的產物。1H-NMR(DMS0-d6，400MHz) δ:1.82 (s, 1H,SH),2.13 (s, 3H, CH3), 3.34-3.60 (m，56H，PEG-CH20)，
4.13-4.22 (m，2H，CH2S)，5.05 (t, J=8.1Hz, 1H, CH), 5.69 (s，lH，NH)。
[0221 ] N AC-PEG的1H-NMR光譜被顯示于圖2中。
[0222]為了制備NAC-PEG包覆的納米粒子，在25°C下用PEG-NAC溶液(按照上面所描述的制備)以1:1摩爾比溫育10mg/ml的金納米粒子24小時。
[0223]實施例4-制備包覆有半胱氨酸的金納米粒子
[0224]將油酸(3.75ml)、Na0H200mg 和乙醇(15ml)添加到 30ml 水(Milli_Q，Millipore)中，并允許溶液在磁力攪拌器上攪拌5分鐘。
[0225]然后，添加HAuCl4 (50mg)以產生淺黃色溶液，攪拌同時，將5ml0.05M的抗壞血酸緩慢添加到溶液中。當完成Au的還原時(溶液的顏色變?yōu)榫萍t色)，將半胱氨酸(5ml水中，92.6mg)緩慢添加到溶液中。允許溶液攪拌30分鐘。
[0226]然后使用NaOH2M將pH慢慢調節(jié)到pH=9，并允許所得的溶液在磁力攪拌器上攪拌至少一小時。之后，添加正己烷(20ml)，在磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌溶液至少另外的一小時。
[0227]用HCl溶液(37% )將所得的反應混合物的pH調節(jié)到pH=7。
[0228]使用分液漏斗將混合物分成兩相，即有機相和水相。在真空下蒸發(fā)水相以去除微量的有機溶劑。將包含表面改性的金納米粒子的干粉溶解在5ml水(Mill1-Q，Millipore)中。
[0229]實施例5-具有含有90%半胱氨酸和10%白蛋白的涂層的金納米粒子
[0230]將油酸(3.75ml)、Na0H200mg 和乙醇(15ml)添加到 30ml 水(Milli_Q，Millipore)中，并允許溶液在磁力攪拌器上攪拌5分鐘。
[0231]然后，添加HAuC14 (50mg)以產生淺黃色溶液，攪拌同時，將5ml0.05M抗壞血酸緩慢添加到溶液中。當完成Au的還原時(溶液的顏色變?yōu)榫萍t色)，將半胱氨酸(5ml水中，83.34mg)緩慢添加到溶液中。允許溶液攪拌30分鐘。
[0232]然后使用NaOH2M將pH慢慢調節(jié)到pH=9，并允許所得的溶液在磁力攪拌器上攪拌至少一小時。之后，添加正己烷(20ml)，在磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌溶液至少另外的一小時。
[0233]使用HCl溶液(37% )將所得的反應混合物的pH調節(jié)到pH=7。
[0234]然后添加白蛋白，并允許在磁力攪拌器上攪拌混合物30分鐘。
[0235]使用分液漏斗將混合物分成兩相，即有機相和水相。在真空下蒸發(fā)水相以去除微量的有機溶劑。將包含表面改性的金納米粒子的干粉溶解在5ml水(Mill1-Q，Millipore)中。
[0236]實施例6 =NAC表面改性的金納米粒子或PEG-NAC表面改性的金納米粒子在含有蛋白的溶液中的穩(wěn)定性。
[0237]在生長培養(yǎng)基(DMEM)中測試NAC表面改性的金納米粒子或PEG-NAC表面改性的金納米粒子的穩(wěn)定性。用9.5ml DMEM和500 μ INAC表面改性的金納米粒子或PEG-NAC表面改性的金納米粒子溫育培養(yǎng)板24小時。
[0238]結果被呈現于圖4中，該圖顯示了容納PEG-NAC表面包覆的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基皿(左手皿)或容納NAC表面包覆的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基皿(右手皿)的象形圖。如在圖4中所示，與其中觀察到GNP-蛋白共軛物的形成的容納相同濃度的NAC表面包覆的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基(右手皿)相比，容納PEG-NAC表面改性的金納米粒子的細胞培養(yǎng)基皿顯得澄清(左手皿)。因此，與通過單獨的NAC的表面改性相比，PEG-NAC表面改性給金納米粒子提供了增強的溶解性和穩(wěn)定性。
[0239]同樣，在下列介質中測試金納米粒子或PEG-NAC表面改性的金納米粒子的穩(wěn)定性:血液、生長培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)溶液。
[0240]用500 μ I金納米粒子或PEG-NAC表面改性的金納米粒子來溫育容納9.5ml DMEM或FBS的培養(yǎng)板并跟蹤24小時。用300 μ I金納米粒子或PEG-NAC表面改性的金納米粒子溫育容納2.5ml血液的管。
[0241]結果顯示，用金納米粒子溫育的板顯示形成聚集體并確定出黑色沉積物，該黑色沉積物是不穩(wěn)定的納米粒子的指示物。相反地，用PEG-NAC表面改性的金納米粒子溫育的板顯示澄清的溶液，沒有形成聚集體或其他沉積物，表明表面改性的金納米粒子在這樣的溶液中是穩(wěn)定的。
[0242]圖5A-B中呈現的結果是用300 μ I金納米粒子或NAC-PEG表面改性的金納米粒子溫育的血液樣品的光學顯微鏡圖像。圖5Α-5Β中顯示的結果表明在用300 μ I金納米粒子溫育的血液中形成了聚集體(圖5Α)，然而在用300 μ I PEG-NAC表面改性的金納米粒子溫育的血液中沒有檢測到聚集且血溶液仍然是澄清的(圖5Β)。
[0243]實施例7:體外測定-將金納米粒子引入癌細胞
[0244]在常規(guī)生長條件:5% CO2和37.6°C下，ΕΜΤ-6癌細胞在補充有10% FBS,2% L-谷氨酸胺溶液(200mM)和 2% Pen-Strep 溶液(Biological Industries)以及 4.5m/1 D-葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中生長。
[0245]將根據實施例1的程序制備的表面改性的金納米粒子的水分散體以0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.127mg/ml或0.253mg/ml的最終濃度中的一個添加到細胞中，在培養(yǎng)箱中持續(xù)2小時或4小時的溫育時間，除了添加金納米粒子之外，將對照細胞保持在相同的條件下。
[0246]在2小時或4小時的溫育時間后，用PBS洗滌細胞，使用胰蛋白酶-EDTA溶液(Biological Industries)收獲細胞,使用顯微鏡計數室(血細胞計數器)在顯微鏡下計數，并用王水消化用于ICP (電感耦合等離子體光譜法)分析，其中閾值被設置為lppb。
[0247]使用Varian720_ES ICP儀器確定每種樣品中的金濃度。
[0248]計算Ig細胞中的Au量。也分析對照組的金，結果表明對照樣品中沒有金。
[0249]用表面改性的金納米粒子的水分散體溫育細胞后，使用Varian720_ES (電感耦合等離子體質譜法)ICP_MS儀器確定金濃度。ICP-MS是高度敏感的并能確定金屬濃度的質譜法儀器。
[0250]如在表I和表2中可以看出，在測試的濃度和時間段下，表面改性的金納米粒子的水分散體結合到細胞中。[0251]如在表1中可以看出，金納米粒子結合到癌細胞取決于生長培養(yǎng)基中的金納米粒子的濃度，以及取決于溫育時間。如通過比較經處理的細胞的數量和對照細胞的數量所表明的，在金納米粒子溫育期間在細胞中沒有觀察到毒性。
[0252]在另外的研究中，使用了較高濃度的金納米粒子，如在表2中可以看出，保持了對金納米粒子濃度和溫育時間的依賴性。
[0253]更重要地，即使在較高濃度下，沒有觀察到對細胞的毒性作用。因此，表明了表面改性的金納米粒子的水分散體在體內研究中的安全使用。
[0254]復1:細胞中的金濃度
[0255]
【權利要求】
1.一種表面改性的重金屬納米粒子，包含:重金屬芯和包覆層，所述包覆層包含共軛到聚乙二醇(PEG)的至少一種配體，其中所述至少一種配體選自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何組合。
2.根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子，其中所述配體是N-乙酰半胱氨酸(NAC)。
3.根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子，其中所述至少一種配體共價結合到所述重金屬納米粒子芯的表面。
4.根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子，其中所述重金屬選自金、金物質、銀、鉬、鐵、銅、鎳、鈕、銥、鈦或鉛。
5.根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子，其中所述重金屬是金物質。
6.根據權利要求4中任一項所述的表面改性的重金屬納米粒子，其中所述金物質是AuC13、AuF3> AuBr3> HAuCl4或MAuCl4,其中M代表堿金屬陽離子。
7.根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子，其中所述納米粒子具有從約0.5nm到約400nm的尺寸。
8.根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子，實質上呈干粉形式。
9.一種分散在水中或緩沖液中的根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子的水分散體。
10.一種用于制備表面改性的重金屬納米粒子的工藝，包括以下步驟:` 將共軛到聚乙二醇(PEG)的至少一種配體添加到包含金屬納米粒子的混合物中，其中所述至少一種配體結合到所述重金屬納米粒子芯的表面，產生表面改性的重金屬納米粒子，其中所述配體選自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、白蛋白、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、氨基硫醇、硫代羧酸、氨、胺、二胺或其任何組合。
11.根據權利要求10所述的工藝，其中所述配體是N-乙酰半胱氨酸(NAC)。
12.根據權利要求10所述的工藝，其中通過以下來制備所述混合物: Ca)將至少一種表面活性劑與至少一種有機溶劑混合在水溶液中以產生乳液； (b)將重金屬物質的溶液和至少一種還原劑添加到步驟(a)的所述乳液中，以產生還原的金屬納米粒子。
13.根據權利要求10所述的工藝，還包括分離包含所述表面改性的重金屬納米粒子的無機相與所述有機相。
14.根據權利要求10所述的工藝，其中所述重金屬是金物質。
15.根據權利要求14所述的工藝，其中所述金物質是AuC13、AuF3>AuBr3> HAuCl4或MAuCl4，其中M代表堿金屬陽離子。
16.根據權利要求10所述的工藝，其中所述重金屬納米粒子具有從約0.5到約400nm的尺寸。
17.根據權利要求10所述的工藝，還包括干燥所述水相，產生呈干燥形式的表面改性的重金屬納米粒子。
18.根據權利要求10中任一項所述的工藝，包括將所述重金屬納米粒子分散在水中或緩沖液中。
19.根據權利要求12所述的工藝，其中所述至少一種表面活性劑包括至少一種脂肪酸。
20.根據權利要求19所述的工藝，其中所述至少一種脂肪酸是油酸。
21.根據權利要求12所述的工藝，其中所述有機溶劑是乙醇。
22.根據權利要求12所述的工藝，其中所述至少一種還原劑是抗壞血酸、乙二胺四乙酸(EDTA )、檸檬酸鈉、硼氫化鈉或硼氫化鋰中的任一種。
23.根據權利要求10所述的工藝，其中所述還原劑是抗壞血酸。
24.根據權利要求12所述的工藝，還包括添加至少一種第二有機溶劑。
25.根據權利要求24所述的工藝，其中所述第二有機溶劑是己烷、環(huán)己烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯或甲苯。
26.通過根據權利要求10所述的工藝可獲得的表面改性的重金屬納米粒子。
27.通過根據權利要求10所述的工藝可獲得的表面改性的重金屬納米粒子的水分散體。
28.一種藥物組合物，包含根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子。
29.根據權利要求28所述的藥物組合物，任選地還包含藥學上可接受的添加劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或賦形劑中的至少一種。
30.根據權利要求28所述的藥物組合物，適合于口服施用、注射或輸注。
31.根據權利要求28所述的藥物組合物，用于醫(yī)學治療或醫(yī)學診斷。
32.根據權利要求28所述的藥物組合物，用于治療惡性病癥。
33.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中所述惡性病癥是癌癥、肉瘤、胚細胞瘤或母細胞瘤中的任一種。
34.根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子在制備藥物組合物中的用途。
35.根據權利要求34所述的表面改性的重金屬納米粒子的用途，包括治療惡性病癥。
36.根據權利要求35所述的表面改性的重金屬納米粒子的用途，其中所述惡性病癥是癌癥、肉瘤、胚細胞瘤或母細胞瘤中的任一種。
37.根據權利要求36所述的表面改性的重金屬納米粒子的用途，包括診斷惡性病癥。
38.根據權利要求34所述的用途，其中所述治療或診斷是在體外或在體內。
39.一種可注射溶液，包含根據權利要求28所述的藥物組合物。
40.一種無菌注射器，包含根據權利要求39所述的可注射溶液。
41.一種試劑盒,包含: Ca)根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子的水分散體或包含所述水分散體的藥物組合物，其中，所述分散體包含水或在約4.5到約8之間的pH值下的緩沖液； (b)用于向患者施用所述水分散體或所述藥物組合物的裝置；及 (c)使用說明書。
42.一種試劑盒，包含: Ca)根據權利要求1所述的表面改性的重金屬納米粒子，其呈干燥形式； (b)用于分散所述表面改性的重金屬納米粒子的水溶液，其中所述水分散體包含水或在4.5和8之間的pH值下的緩沖液； (c)用于向患者施用所述水分散體的裝置'及 (d)使用說明書。
43.一種治療或診斷惡性病癥的方法，包括向有需要的受試者施用治療有效量的根據權利要求1中所定義的表面改性的重金屬納米粒子或包含所述表面改性的重金屬納米粒子的藥物組合物的步驟。
44.根據權利要求43所述的方法，其中施用是口服、通過輸注或通過注射。
45.一種用于金屬納米粒子的表面改性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)-聚乙二醇(PEG)共軛物，其中所述N-乙酰半胱氨酸(NAC)能夠結合到所述金屬納米粒子芯的表面。
46.根據權利要求45所`述的共軛物，其中所述金屬是金物質。
【文檔編號】B22F9/00GK103608139SQ201180069839
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2011年11月3日 優(yōu)先權日:2011年2月3日
【發(fā)明者】阿邁爾·阿尤布, 納西姆·薩法迪, 索比?！ぐ蜕釥? 申請人:美塔羅治療有限公司