本發(fā)明涉及一種人抗體基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞轉(zhuǎn)染是真核細(xì)胞由于外源DNA或RNA摻入而獲得新遺傳標(biāo)志的過(guò)程。它是基因功能研究、基因免疫的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，也是研究基因表達(dá)調(diào)控、突變分析等的常規(guī)工具。同時(shí)也是基因治療、疫苗接種、藥物開(kāi)發(fā)等應(yīng)用的重要工具。細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用的方法有：生物學(xué)方法(即以病毒為載體的轉(zhuǎn)染法)、化學(xué)方法(磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子聚合物法)、物理方法(顯微注射法、基因槍法、電穿孔法、激光照射法、聲孔效應(yīng)法、磁性納米顆粒等)。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但其目的基因容量小，制備復(fù)雜，成本高，不能體內(nèi)反復(fù)使用；另外，其可能在體內(nèi)發(fā)生基因的重組或互補(bǔ)，存在致癌、致畸的風(fēng)險(xiǎn)，安全性差，適用性窄。磷酸鈣法操作簡(jiǎn)單實(shí)用，但對(duì)細(xì)胞有一定的選擇性，且重復(fù)性差，不能廣泛應(yīng)用。顯微注射法需要特殊的技術(shù)，對(duì)細(xì)胞的損傷較大，不能廣泛應(yīng)用?；驑尫ㄐ枰厥獾脑O(shè)備，價(jià)格昂貴，在轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)細(xì)胞具有物理?yè)p傷而不能被普及應(yīng)用。影響基因轉(zhuǎn)染效率的因素很多，包括轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染方法、細(xì)胞種類、細(xì)胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染時(shí)間、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和純度、轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例等。理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)該具有較好的生物降解性、穩(wěn)定性、靶向性強(qiáng)、有助于基因的表達(dá)并能應(yīng)用于基因方面疾病的治療。針對(duì)目前轉(zhuǎn)染方法的不足，我們利用脂質(zhì)體法將人抗體基因重組質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，為單克隆抗體藥物篩選提供研究基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有轉(zhuǎn)染方法的不足，提供一種人抗體基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法。本發(fā)明是利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將Lipofectamine3000作為轉(zhuǎn)染試劑，HEK293細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，邊傳代邊轉(zhuǎn)染，將人抗體重鏈基因重組質(zhì)粒和人抗體輕鏈基因重組質(zhì)粒體外瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG分泌量，從而將人抗體基因重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)染方法為：(1)人抗體基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包括步驟：(a)HEK293細(xì)胞傳代、接種：使用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到80％左右，將0.25％的胰酶-EDTA消化終止后的細(xì)胞，按每孔10000個(gè)細(xì)胞接種96孔板，再補(bǔ)加培養(yǎng)液至190μL。同時(shí)設(shè)置不同的對(duì)照組，對(duì)照組1為只加單個(gè)重鏈的質(zhì)粒組；對(duì)照組2為只加單個(gè)輕鏈的質(zhì)粒組；對(duì)照組3只加轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞，不加質(zhì)粒；對(duì)照組4只加細(xì)胞，不加轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒；(b)用opti-MEM分別稀釋質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，使得加入每孔的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000為0.15μL，每孔的P3000為0.2μL，每孔的人抗體重鏈基因重組質(zhì)粒和人抗體輕鏈基因重組質(zhì)粒各為50ng；(c)按1：1的體積比例將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫孵育5min后，將其加入到接種有細(xì)胞的孔中，37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。(2)Elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG分泌量：收集步驟(1)中的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白包被酶標(biāo)板，采用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的二抗為1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的GoatAnti-HumanIgG，待檢測(cè)的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)應(yīng)的二抗為1:10000稀釋的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清特異性，看其是否分泌IgG；具體操作如下：(A)用包被液(50μL/孔)將GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白(各100ng/孔)包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。洗板機(jī)洗板5遍。洗液為含0.05％Tween的PBS；(B)用封閉液200μL/孔，37℃封閉2h，洗板5遍；(C)分別在對(duì)應(yīng)孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)上清，或者梯度稀釋的IgG標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)用水和PBS作為陰性對(duì)照，50μL/孔，37℃放置1h。洗板5遍；(D)分別在對(duì)應(yīng)孔中加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的GoatAnti-HumanIgG，以及1:10000稀釋的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated50μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍；(E)加入顯色液100μL/孔，室溫避光顯色10min；(F)加入2mol/L硫酸50μL/孔，終止顯色反應(yīng)，檢測(cè)OD450nm，參考波長(zhǎng)為630nm。所述步驟(1)采用的轉(zhuǎn)染方法是HEK293細(xì)胞傳代與人抗體基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染同時(shí)進(jìn)行；所述抗體基因重組質(zhì)粒種屬來(lái)源不僅限于人，抗體基因重組質(zhì)粒種屬來(lái)源可以是任一動(dòng)物。本發(fā)明的有益效果：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將Lipofectamine3000作為轉(zhuǎn)染試劑，HEK293細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，邊傳代邊轉(zhuǎn)染，將人抗體重鏈基因重組質(zhì)粒和人抗體輕鏈基因重組質(zhì)粒體外瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG分泌量，從而將人抗體基因重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：一種人抗體基因重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法操作簡(jiǎn)便，安全，重復(fù)性好，可自然降解，低細(xì)胞毒性，快速，高效，經(jīng)濟(jì)，適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為Elisa檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式1、人抗體基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包括步驟：(a)HEK293細(xì)胞傳代、接種：使用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到80％左右，將0.25％的胰酶-EDTA消化終止后的細(xì)胞，按每孔10000個(gè)細(xì)胞接種96孔板，再補(bǔ)加培養(yǎng)液至190μL。同時(shí)設(shè)置不同的對(duì)照組，對(duì)照組1為只加單個(gè)重鏈的質(zhì)粒組；對(duì)照組2為只加單個(gè)輕鏈的質(zhì)粒組；對(duì)照組3只加轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞，不加質(zhì)粒；對(duì)照組4只加細(xì)胞，不加轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒；其中表1為Elisa檢測(cè)的96孔板整體布局；(b)用opti-MEM分別稀釋質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，使得加入每孔的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000為0.15μL，每孔的P3000為0.2μL，每孔的人抗體重鏈基因重組質(zhì)粒和人抗體輕鏈基因重組質(zhì)粒各為50ng；(c)按1：1的體積比例將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫孵育5min后，將其加入到接種有細(xì)胞的孔中，在37℃及5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。2、Elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG分泌量使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，其中表2為Elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG的OD值，表3為Elisa檢測(cè)樣品的IgG濃度。具體操作如下：(A)用包被液(50μL/孔)將GoatAnti-HumanKappa蛋白和GoatAnti-HumanLambda蛋白(各100ng/孔)包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。洗板機(jī)洗板5遍。洗液為含0.05％Tween的PBS；(B)用封閉液200μL/孔，37℃封閉2h，洗板5遍；(C)分別在對(duì)應(yīng)孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)上清，或者梯度稀釋的IgG標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)用水和PBS作為陰性對(duì)照，50μL/孔，37℃放置1h。洗板5遍；(D)分別在對(duì)應(yīng)孔中加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的GoatAnti-HumanIgG，以及1:10000稀釋的Goatx-humanIgG-FcFragmentHRPConjugated50μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍；(E)加入顯色液100μL/孔，室溫避光顯色10min；(F)加入2mol/L硫酸50μL/孔，終止顯色反應(yīng)，檢測(cè)OD450nm，參考波長(zhǎng)為630nm。表1Elisa檢測(cè)的96孔板整體布局對(duì)照組1為只加單個(gè)重鏈的質(zhì)粒組；對(duì)照組2為只加單個(gè)輕鏈的質(zhì)粒組；對(duì)照組3只加轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞，不加質(zhì)粒；對(duì)照組4只加細(xì)胞，不加轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒。表2值123456789101112A1.1261.1421.1320.0650.0670.0640.0670.0660.0630.0610.0620.063B0.9761.0220.9971.0691.0861.0951.0341.0161.0171.0761.0721.081C0.7520.8980.8311.0731.0641.0681.1261.1091.1051.061.0761.066D0.6010.6220.6081.1121.1151.1181.0261.0091.0290.0630.0610.161E0.4050.3890.3951.0521.0571.0541.1021.1061.1070.0720.0690.068F0.2110.2060.2091.0631.0811.0921.0631.0791.0650.0690.0880.079G0.1430.1340.1411.0591.0621.0691.0831.0971.1010.0550.0570.056H0.1140.1060.1090.0650.0650.0620.0610.0610.0620.0640.0610.062表3當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3