專利名稱：一種產?；撬峋甑暮Y選方法及用該菌株發(fā)酵法生產牛磺酸的制作方法
技術領域：
—種產?；撬岬目莶菅挎邨U菌的篩選方法及應用該菌株生產?；撬?屬于生物工程領域，特別是一株產?；撬岬目莶菅挎邨U菌。
背景技術：
?；撬?Taurine)是動物體內的一種含硫氨基酸，又稱牛膽堿、牛膽素，其化學結構式為H2N-CH2-CH2-SO3H,化學名稱為2-氨基乙磺酸。它廣泛分布于生物體內各組織、器官，主要以游離狀態(tài)存在于組織間液和細胞內液中，因最先從牛膽汁中分離出來而得名。1954年Stern和Moore首次在腦和脊髓中發(fā)現了?；撬?。但長期以來一直被認為是含硫氨基酸的無功能代謝產物[1]。1976年Hayes等首次報道用以酪蛋白為主要蛋白來源但缺乏?；?酸的飼料喂貓，可引起貓的視網膜變性，若長時間缺乏，可使貓失明，從而引起了人們對?；撬釥I養(yǎng)作用的極大關注。研究發(fā)現，?；撬崾钦{節(jié)機體正常生理活動的活性物質，具有維持正常視覺功能、維持機體滲透壓平衡，調節(jié)細胞鈣平衡，與細胞膜的流動性有關，降血糖、調節(jié)神經傳導、參與內分泌活動、調節(jié)脂類消化與吸收、增加心臟收縮能力、提高機體免疫能力、增強細胞膜抗氧化能力、保護心肌細胞等廣泛生物學作用。?；撬嵩谂R床上已被廣泛應用于心血管疾病、高膽固醇血癥、眼部疾病、糖尿病、早老性癡呆和肝病等一系列疾病的治療。在食品領域，?；撬岬囊呀洺蔀槎喾N食品營養(yǎng)強化劑和添加劑的主要活性成分，作為食品添加劑，其可被添加到乳制品、飲料、豆制品等食品中。目前，世界上?；撬岬哪晗牧恳殉^I. 5萬噸/年，其中80%以上用作食品營養(yǎng)添加劑。我國生產的?；撬嶂饕糜诔隹?、醫(yī)藥以及食品，其中出口量約占90%，作為食品添加劑僅占6%，而美國僅在飲料食品中作營養(yǎng)強化劑一項消費就近每年I萬噸。隨著國內人民生活水平和健康意識的提高，?；撬嶙鳛闋I養(yǎng)保健品和強化食品添加劑將越來越受到人們的重視，市場需求趨旺，具有巨大的發(fā)展?jié)摿涂臻g。由于牛磺酸在天然生物中較分散、量少，從天然生物品中提取的量也很有限。所以目前?；撬岬墨@取主要還是靠化工合成。如利用2-溴乙胺氫溴酸鹽與Na2SO3，反應制備?；撬?，雖然產率較高，但成本很高，難以實現工業(yè)化，而使用低成本的合成方法如2-氯乙胺鹽酸鹽與Na2SO3反應，則收率較低。目前，?；撬岬纳a廠家主要集中在日本、美國、歐洲等發(fā)達國家和地區(qū)，我國?；撬嵘a工藝陳舊、成本高、產量低，與歐美等發(fā)達國家還有很大差距。早在1988年日本就有專利報道，可用發(fā)酵法制取?；撬幔⑼瑫r報道了許多種類的微生物都能生產?；撬峄蚱漕愃莆?。然而近幾十年來，鮮有關于采用微生物發(fā)酵法生產?；撬岬难芯繄蟮溃瑑H在2009年Choi Y. J.等報道了采用代謝工程的方法在大腸桿菌中生
產?；撬?。對采用微生物發(fā)酵法生產?；撬岬难芯可刑幱诔醪诫A段，仍沒用一種可以利用微生物發(fā)酵直接生產?；撬岬姆椒ā?br>
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種?；撬嵘a菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產牛磺酸。本發(fā)明的技術方案I、一種產?；撬峥莶菅挎邨U菌的篩選方法I)枯草芽孢桿菌的初步分離純化稱取約O. 2g 土壤于20ml O. 85%無菌生理鹽水中，將菌懸液在沸水中振蕩加熱IOmin后，迅速冷卻至室溫。此菌懸液作為母液梯度稀釋至10_8，取10_6_10_8稀釋菌液涂布于營養(yǎng)肉湯平板上，30°C倒置培養(yǎng)24h，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察芽孢，將有芽孢菌株作為進一步篩選的枯草芽孢桿菌疑似菌株，編號保存； 2)產?；撬峥莶菅挎邨U菌的篩選將上述分離純化得到的菌種接種于種子培養(yǎng)基中，然后轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后離心收集發(fā)酵液，發(fā)酵液經高效液相方法中的內標法進行分析，使得牛磺酸標準品峰聞增聞的菌株即為廣牛橫酸的枯草芽抱桿菌。2、根據權利要求I所述一種產?；撬峥莶菅挎邨U菌的篩選方法，其篩選得到產?；撬岬目莶菅挎邨U菌的鑒定方法如下I)形態(tài)學鑒定菌落形態(tài)、細胞形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色；2)生理生化鑒定接觸酶試驗，V. P.及M. R.試驗，明膠液化及淀粉水解，耐鹽耐酸試驗，硝酸鹽還原試驗；3) 16sRNA分子生物學鑒定用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組RNA，采用枯草芽孢桿菌16sRNA通用引物進行PCR擴增，擴增產物用膠回收試劑盒回收純化，連接至克隆載體PMD18T Vector,轉化大腸桿菌JM109菌株，利用克隆載體的青霉素抗性篩選獲得陽性轉化子，并用通用引物對轉化子進行質粒PCR鑒定。陽性克隆測序所得16sRNA序列與GenBank數據庫中枯草芽孢桿菌的核苷酸序列進行同源性分析，其與枯草芽孢桿菌的同源性高達99%，結合形態(tài)學、生理生化等實驗結果將該陽性克隆鑒定為枯草芽孢桿菌，并命名為B. subtilis FMME059。3、本發(fā)明公開的一種牛磺酸的生產方法，其特征是采用B. subtilis FMME059為出發(fā)菌株，以種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵生產?；撬?；I)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖40，胰蛋白胨20，KH2PO4L 5，K2HPO4,0. 5，MgSO4 · 7Η200· 5，生物素50，酵母膏5，尿素3，鹽酸硫胺素10，初始PH 7. 2-7. 4 ；培養(yǎng)條件溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，培養(yǎng)18_20h ；2)液體發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖20，酵母粉15，尿素15，KH2PO4L 5，K2HPO4L 5，MgSO4 · 7Η200· 4，MnCl2 · 4H20 MgSO4 · 7Η200· 2，硫酸銨 20，初始 PH 7. 2-7. 4 ；
發(fā)酵條件接種量10%，溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，發(fā)酵72h。4、?；撬岙a量的測定根據?；撬岷?，4- 二硝基氟苯(DNFB)進行衍生后在紫外360nm處有吸收峰，采用高效液相測定發(fā)酵液中的?；撬岷?。發(fā)酵液的預處理取發(fā)酵液8000rpm離心IOmin,收集上清液,并加入15%的三氯乙酸沉淀發(fā)酵液中的蛋白(體積比I : 4)，靜置lh，8000rpm離心lOmin，取上清液。標準曲線的制作以商品?；撬?Sigma公司)作為標準品，配制1000、800、600、400、200mg/L的標準溶液。柱前衍生精密量取上述不同濃度的標準品和處理過的發(fā)酵液各lmL，分別置于 IOmL棕色量瓶中，依次加入O. 5mol/L的碳酸氫鈉溶液ImL (取碳酸氫鈉12g，用水溶解并稀釋至250mL,用O. lmol/L氫氧化鈉調節(jié)pH 9. O)，I %的2，4 二硝基氟苯乙腈溶液O. 5mL,搖勻，置60°C水浴中避光加熱Ih后取出，放冷至室溫，加磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0，取磷酸二氫鉀O. 68g，加O. lmol/L氫氧化鈉溶液29. lmL，用水稀釋至IOOmL,搖勻，即得)稀釋至刻度，搖勻。用0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定?；撬岬暮俊＝涍^柱前衍生處理，標準品都稀釋到原來的10倍，所以標準曲線的最終梯度為100、80、60、40、20mg/L。發(fā)酵液經過除蛋白和柱前衍生處理，相當于稀釋了 50倍。色譜條件色譜柱反相C18 柱 250mm X 4. 6mm,直徑 5 μ m流動相磷酸鹽緩沖液(pH8)乙腈(色譜純)水=70 20 10柱溫35°C；檢測波長360nm；進樣量20μ L流速lmL/min。標準曲線在20_100mg/L之間呈現良好的線性關系(圖1)，回歸方程y =2. 875x-2. 976，R2 = 0. 9990。據此得到72h稀釋后?；撬岙a量的值，此值乘以稀釋倍數得最終產量為lg/L，如圖2。


圖I?；撬針藴是€圖2色譜檢測結果，A 60mg/L?；撬幔珺 72h發(fā)酵液
具體實施例方式以下是枯草芽孢桿菌(B. subtilis FMME059)篩選、鑒定及發(fā)酵生產牛磺酸的實施例。實施例I稱取約0. 2g 土壤于20mL 0. 85%無菌生理鹽水中，將菌懸液在沸水中振蕩加熱IOmin后，迅速冷卻至室溫。此菌懸液作為母液梯度稀釋至10_8，取10_6_10_8稀釋菌液涂布于營養(yǎng)肉湯平板上，30°C倒置培養(yǎng)24h，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察芽孢，挑選芽孢桿菌進一步發(fā)酵復篩。發(fā)酵培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)72h后離心收集發(fā)酵液，發(fā)酵液經高效液相色譜法分析，以?；撬嶙鲀葮?，使?；撬針藴势贩甯咴龈叩木昙礊楫a牛磺酸菌株。實施例2對篩選的FMME 59菌株按《微生物分類學》進行生理生化特性鑒定(見表I、2)，并按細菌基因組提取試劑盒提取方法提取基因組DNA，以Pl和P2為正向和反向引物Pl 5/ -CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3'，P2 5/ -CGACTTCACCCCAATCATCTG-3'。用PCR擴增16S rDNA基因，委托華大基因研究中心進行16S rDNA測序，得到本菌株部分16S rDNA序列(GenBank登錄號JX501915)后，在NCBI網站上用BLAST檢素工具進行同源性比對分析?；?6S rDNA序列分析和生理生化特性鑒定，結合對該菌的生長和 發(fā)酵特性研究，認為是枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus, subtilis FMME059。表I菌株(BN)與枯草芽孢桿菌菌落形態(tài)特征對比
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59Ji/ “表2菌株(BN)生理生化鑒定結果
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—一―59......................................................—— 一實施例3菌株保藏于終濃度為15%的甘油管中，取200 μ L保藏菌液接入50mL種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，30°C，200rpm培養(yǎng)20h后，以10%的接種量接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖40L，胰蛋白胨20，KH2PO4L 5，K2HPO4,05,MgSO4 ·7Η200. 5，生物素50，酵母膏5，尿素3，鹽酸硫胺素10，初始pH 7. 2-7. 4 ;發(fā)酵培養(yǎng)基以 g/L 計葡萄糖 20，酵母粉 15，尿素 15,KH2PO4L 5,K2HPO4L 5,MgSO4 ·7Η200· 4,MnCl2 ·4Η20MgS047H200. 2，硫酸銨 20，初始 pH 7. 2-7. 4。在 30°C,200rpm 條件下發(fā)酵 72h，用 HPLC 測定發(fā)酵液中的?；撬岬暮慨a量為lg/L。
權利要求
1.一種產?；撬峥莶菅挎邨U菌的篩選方法，其特征為 1)枯草芽孢桿菌的初步分離純化 稱取約O. 2g 土壤于20ml O. 85%無菌生理鹽水中，將菌懸液在沸水中振蕩加熱IOmin后，迅速冷卻至室溫，稀釋菌懸液涂布于營養(yǎng)肉湯平板上，30°C倒置培養(yǎng)24h，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察芽孢，將有芽孢菌株作為進一步篩選的枯草芽孢桿菌疑似菌株，編號保存； 2)產?；撬峥莶菅挎邨U菌的篩選 將上述分離純化得到的菌種接種于種子培養(yǎng)基中，然后轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72h后離心收集發(fā)酵液，發(fā)酵液經過預處理后采用內標法經高效液相色譜進行定性分析，使得?；撬針藴势贩甯咴龈叩木昙礊楫a牛磺酸的枯草芽孢桿菌。
2.根據權利要求I所述一種產?；撬峥莶菅挎邨U菌的篩選方法，其篩選得到產牛磺酸的枯草芽孢桿菌經形態(tài)學、生理生化及16sRNA分子生物學鑒定為枯草芽孢桿菌，并命名為Bacillus, subtilis FMME059。
3.一種?；撬岬纳a方法，其特征是采用B. subtilis FMME059為出發(fā)菌株，以種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵生產牛磺酸； 1)種子培養(yǎng)基以g/L 計葡萄糖 40，胰蛋白胨 20，KH2P041. 5,K2HPO4,0. 5,MgS047H200. 5，生物素50，酵母膏5，尿素3，鹽酸硫胺素10，初始pH 7. 2-7. 4 ； 培養(yǎng)條件溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，培養(yǎng)18_20h ； 2)液體發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖20，酵母粉15，尿素15，KH2PO4L 5，K2HPO4L 5，MgSO4 · 7Η200· 4，MnCl24H20 MgSO4 · 7Η200· 2，硫酸銨 20，初始 PH 7. 2-7. 4 ； 發(fā)酵條件接種量10%，溫度30°C、搖床轉速200rpm條件下，發(fā)酵72h。
全文摘要
本發(fā)明闡述了一種產?；撬峋甑暮Y選方法及用該菌株發(fā)酵法生產?；撬?，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明菌株首先將土壤經過沸水浴后稀釋涂布，染色鏡檢獲得有芽孢菌株，然后對篩選出的菌株采用一級發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液中加入?；撬針藴势纷鳛閮葮?，采用高效液相色譜法進行定性分析篩選，并對篩選菌株進行形態(tài)學、生理生化及分子生物學鑒定，最終獲得一株高產牛磺酸的枯草芽孢桿菌。本發(fā)明同時公開一種采用該菌株生產?；撬岬姆椒ǎ捎帽痉椒òl(fā)酵72h?；撬岙a量為1g/L。
文檔編號C12R1/125GK102965317SQ20121048749
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權日2012年11月27日
發(fā)明者吳靜, 羅秋玲, 朱曉彤 申請人:江南大學