專利名稱：：使用非血紅素鹵素過氧化物酶由羧酸酯底物酶催化制備過酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及過酸的生物合成和原位酶催化領(lǐng)域。具體地說是，用具有過水解活性的非血紅素面素過氧化物酶(haloperoxidase)由羧酸酯底物制備過酸。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)報導(dǎo)，過酸組合物是有效的抗微生物試劑。用其對堅硬表面、肉制品、活植物組織和衛(wèi)生器材進行清潔、滅菌和/或消毒以抵抗不受歡迎的微生物的生長的方法已經(jīng)有所描述(US6,545,047,US6,183,807,US6,518,307,US20030026846和US5,683,724)。還有報導(dǎo)表明，過酸可以有效地用于制備洗衣店去污用漂白組合物(US3,974,082，US5,296,161和US5,364,554)。過酸可以通過羧酸與過氧化氬的化學(xué)反應(yīng)來制備(參見OrganicPeroxides,DanielSwern編輯,第1巻,第313-516頁；WileyInterscience,NewYork)。強無機酸，例如濃^危酸，通常能夠催化所述反應(yīng)。過氧化氫與羧酸的反應(yīng)是平衡反應(yīng)，所以使用過量濃度的過氧化物和/或羧酸或者除去水是有利于過酸的產(chǎn)生的。化學(xué)反應(yīng)制備過酸存在幾個缺點a)為了有利于制備過酸而使用高濃度的羧酸會導(dǎo)致在使用含有過酸的溶液時會產(chǎn)生不受歡迎的氣味，2)隨著時間的推移過酸在溶液中通常是不穩(wěn)定的，所以在使用前的儲存期間溶液中過酸的濃度會降低，和3)由于使用濃硫酸作催化劑所以所得制劑通常是強酸性的?？朔瘜W(xué)制備過酸的缺點的一種方式是使用酶催化劑來代替強酸催化劑。酶催化劑的使用使得能夠在使用和/或應(yīng)用的時候快速地制備過酸，從而避免了與過酸溶液儲存和過酸溶液濃度隨時間改變有關(guān)的問題。通過與過氧化氬直接進行化學(xué)反應(yīng)制備過酸一般需要使用高濃度的羧酸，而酶催化制備過酸則不需要使用這樣的高濃度的羧酸，其中所述酶催化的反應(yīng)能夠使用羧酸酯底物在比化學(xué)反應(yīng)通常使用的羧酸濃度低的多的濃度下進行。酶反應(yīng)可以在很大的pH值范圍內(nèi)進行，其取決于給定pH值下的酶的活性和穩(wěn)定性以及給定pH值下底物對過水解作用的特異性。酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶能夠催化烷基酯的水解從而制備出相應(yīng)的羧酸(式1)。式1脂肪酶、酯酶或蛋白酶R!COOR2+H20->R!COOH+HOR2一些酯酶、脂肪酶或蛋白酶顯示出過水解活性，能夠從烷基酯催化合成過酸(式2)。式2脂肪酶、酯酶或蛋白酶R4COOR2+H202->RiC000H+H0R2O.Kirk等人(腸c她—,11:65-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、酯酶和蛋白酶)催化?；孜锱c過氧化氫的過水解反應(yīng)形成過氧羧酸的能力，其報導(dǎo)在含水體系中過水解反應(yīng)進展的效率極低。此外，他們發(fā)現(xiàn)脂肪酶和酯酶能夠?qū)⑦^羧酸分解為相應(yīng)的羧酸和過氧化氬。作者推斷酯酶、脂肪酶和蛋白質(zhì)通常不適合液相環(huán)境中的簡單酯的過水解催化，所述簡單酯例如辛炔酸曱酯和三辛精。US3,974,082描述了通過將所要漂白的材料與含有能夠釋放氧氣的無機過氧化物、?；榛ズ湍軌蛩怩サ孽ッ富蛑久傅乃芤合嘟佑|來制備洗衣店去污用漂白組合物。US5,364,554描述了一種活化的氧化體系，該體系能夠使用蛋白酶類酶、過氧化氬源和酯底物在含水溶液中原位產(chǎn)生過酸，其中所述酯底物優(yōu)選不能化學(xué)地過水解。還公開了漂白的方法和形成過酸的方法。US5,296,161描述了在含水溶液中制備過酸，其中所述含水溶液中包含一種或多種特異性的酯酶和脂肪酶、過氧化氫源和適合用在漂白組合物中的功能化酯底物。然而，其所制得的過酸的濃度通常不能滿足許多商業(yè)消毒劑應(yīng)用的需要。大多數(shù)已知的用酶催化劑由相應(yīng)的羧酸酯制備過酸的方法不能產(chǎn)生并積聚足夠高濃度的過酸以在各種應(yīng)用中進行有效的消毒。最近報導(dǎo)有幾種蛋白酶和脂肪酶的組合物能夠在原位產(chǎn)生過酸(例如過乙酸)并且所產(chǎn)生的過酸的濃度適合用作消毒劑和/或商業(yè)漂白劑(US11/413,246)。然而，仍然需要發(fā)現(xiàn)其他的能夠用于在原位制備過酸的酶催化劑。卣素過氧化物酶廣泛地存在于自然界，通常發(fā)現(xiàn)于動物、植物、細菌、真菌和藻類中。首次發(fā)現(xiàn)的卣素過氧化物酶據(jù)報導(dǎo)含有血紅素作為輔基或輔助因子。后來，有許多非血紅素鹵素過氧化物酶得到了鑒定，這些非血紅素鹵素過氧化物酶主要來自于細菌。鹵素過氧化物酶能夠催化卣離子(X-C1,Br或I)在過氧化氫存在下的氧化以生成相應(yīng)的次卣酸，所述次卣酸是一種反應(yīng)性氧類物質(zhì)，已經(jīng)報導(dǎo)其具有比過氧化氫更好的抗微生物活性(式3)。非血紅素卣素過氧化物酶->HOX+H2。對來自口比咯菌素葉艮單胞菌(尸化wt/owowoy/jrrac/ma)的非血紅素卣素過氧化物酶進行植物重組表達已經(jīng)被報導(dǎo)能夠提高對病原體抵抗力(Jacks等人,US6,703，540)。Jacks等人報導(dǎo)重組表達的非血紅素卣素過氧化物酶還顯示能夠催化乙酸和過氧化氬之間的反應(yīng)，形成抗微生物劑過乙酸。轉(zhuǎn)基因植物中次卣酸和過乙酸產(chǎn)量的增加與病原體抵抗力的增加有關(guān)。然而，后來報導(dǎo)在表達吡咯菌素假單胞菌非血紅素面素過氧化物酶的轉(zhuǎn)基因植物中對真菌病原體黃曲霉(Aspergillusflavus)的抵抗力的增加可能并不是由于過乙酸的形成，因為在將所述底物氧化為過乙酸酯之前，酶飽和所需的底物(過氧化氳或乙酸酯)的濃度是致命(對真菌病原體)的(Jacks等人，y4g〃c.Foot/CT^m.48:4561-4564(2000);Jacks等人，丄爿gnc.FoodC/em.,50:706-709(2002))。所要解決的問題是提供一種在原位酶催化制備過酸的方法并且所制得的過酸的濃度適合用于各種消毒應(yīng)用。優(yōu)選地，用于制備過酸組合物的底物應(yīng)該是相對無毒且便宜的，例如羧酸酯。發(fā)明簡介上述問題已經(jīng)通過發(fā)現(xiàn)非血紅素卣素過氧化物酶在無機源過氧源(例如過氧化氫)和羧酸酯底物的存在下能夠在原位制備足以用作消毒劑和/或漂白劑濃度的過酸。在本發(fā)明的一個方面，提供了一種水酶催化方法，所述方法能夠用非血紅素卣素過氧化物酶與所選擇的底物結(jié)合在原位產(chǎn)生過酸，所述方法包括a)提供一組過酸反應(yīng)組分，所述組分包括1)底物，其選自i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中R產(chǎn)C1到C10的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或Cl到C4的烷氧基取代，并且R2=C1到C10的直鏈或支鏈烷基，(CH2CH2-0)nH或(CH2CH(CH3)-0)nH，并且11=1到10;ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中R產(chǎn)C1到C10的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或Cl到C4的烷氧基取代，并且R3和R4各自為H或RAO);2)過氧源；和3)具有過水解活性的非血紅素卣素過氧化物酶；b)在含水反應(yīng)條件下合并所述反應(yīng)組分，借此，在反應(yīng)組分合并約5分鐘到約2小時內(nèi)產(chǎn)生過酸組合物，其中所產(chǎn)生的過酸的濃度至少為500ppb。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種減少堅硬表面或無生物上的活微生物種群的方法，所述方法為在過酸反應(yīng)組分合并后的48小時內(nèi)使堅硬表面或無生物與由上述方法制備的過酸組合物接觸，該方法使活微生物種群減少了至少3-log,優(yōu)選至少4-log，更優(yōu)選至少5-log,最優(yōu)選至少6-log。在進一步的方面，在與將要處理的表面或無生物接觸之前，任選地將由上述方法制備的過酸組合物稀釋到所需的有效濃度。在本發(fā)明進一步的方面，還提供了編碼具有過水解活性的非血紅素卣素過氧化物酶的核酸片段。生物學(xué)序列簡述以下序列描述和附于此的序列表符合37C.F.R.§1.821-1.825所列的指導(dǎo)專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列披露的規(guī)定，并且是按照WorldIntellectualPropertyOrganization(WIPO)Standard(世界知識產(chǎn)權(quán)組織標(biāo)準(zhǔn))ST.25(1998)以及EPC和PCT的序列表要求(實施細則5.2和49.5(—至二)，以及第208節(jié)和附錄C的審查指南(AdministrativeInstructions))。用于核普酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式符合37C.F.R.§1.822的規(guī)定。SEQIDNO:1是引物#1的核苦酸序列。SEQIDNO:2是引物#2的核普酸序列。SEQIDNO:3是引物#3的核苷酸序列。SEQIDNO:4是用引物#1和引物#2由惡臭假單胞菌(尸wi^omo"a5B(NRRL-18668)基因組DNA擴增的核苷酸序列。SEQIDNO:5是用引物#1和引物#3由惡臭假單胞菌5B(NRRL-18668)基因組DNA擴增的核苷酸序列。SEQIDNO:6是引物弁4的核苷酸序列。SEQIDNO:7是引物弁5的核芬酸序列。SEQIDNO:8是引物#6的核苦酸序列。SEQIDNO:9是來自惡臭假單胞菌5B(NRRL-18668)的非血紅素卣素過氧化物酶編碼區(qū)核苷酸序列。SEQIDNO:10是來自惡臭假單胞菌5B(NRRL-18668)的非血紅素面素過氧化物酶的推導(dǎo)核苷酸序列。SEQIDNO:11是引物#7的核苦酸序列。SEQIDNO:12是引物弁8的核香酸序列。SEQIDNO:13是來自才艮癌土》裏桿菌(Jgra6""er/wmfwme/a"ew)C58(GenBank16119616)的非血紅素卣素過氧化物酶("AtuAl")的核苷酸序列。SEQIDNO:14是來自根癌土壤桿菌C58(GenBank16119616)的非血紅素卣素過氧化物酶("AtuAl")的氨基酸序列。SEQIDNO:15是引物弁9的核苷酸序列。SEQIDNO:16是引物#10的核芬酸序列。SEQIDNO:17是來自根癌土壤桿菌C58(GenBank16119293)的非血紅素閨素過氧化物酶("AtuA2")的核普酸序列。SEQIDNO:18是來自根癌土壤桿菌C58(GenBank16119293)的非血紅素卣素過氧化物酶("AtuA2")的氨基酸序列。SEQIDNO:19是引物#11的核普酸序列。SEQIDNO:20是引物#12的核普酸序列。SEQIDNO:21是來自沖艮癌土壤桿菌C58(GenBank15891475)的非血紅素卣素過氧化物酶("AtuA3")的核苷酸序列。SEQIDNO:22是來自根癌土壤桿菌C58(GenBank15891475)的非血紅素卣素過氧化物酶("AtuA3")的氨基酸序列。SEQIDNO:23是引物#13的核苷酸序列。SEQIDNO:24是引物#14的核苦酸序列。SEQIDNO:25是引物#15的核苷酸序列。SEQIDNO:26是引物#16的核普酸序列。SEQIDNO:27是來自根癌土壤桿菌C58(GenBank15891444)的非血紅素卣素過氧化物酶("AtuA4")的核苷酸序列。SEQIDNO:28是來自根癌土壤桿菌C58(GenBank15891444)的非血紅素卣素過氧化物酶("AtuA4")的氨基酸序列。SEQIDNO:29是引物#17的核普酸序列。SEQIDNO:30是引物#18的核普酸序列。SEQIDNO:31是引物#19的核苦酸序列。SEQIDNO:32是引物#20的核苦酸序列。發(fā)明詳述本文提供了由羧酸酯底物使用具有過水解活性的非血紅素卣素過氧化物酶在原位產(chǎn)生過酸的含水酶催化方法。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種減少堅硬表面或無生物上的活微生物種群的方法，所述方法為在過酸反應(yīng)組分合并后48小時內(nèi)使堅硬表面或無生物與由上述方法制備的過酸組合物接觸，該方法使活微生物種群減少了至少3-log，優(yōu)選至少4-log，更優(yōu)選至少5-log,最優(yōu)選至少6-log。在本公開文本中使用了許多術(shù)語和縮寫。除非另有明確的說明，否則其使用的定義如下。如本文中所使用的，術(shù)語"包含"的意思如權(quán)利要求中所指，是表示所描述特征、整數(shù)、步驟或組分的存在，但并不排除其中還存在或加入了一種或多種其他的特征、整數(shù)、步驟、組分或基團。如本文中所^吏用的，術(shù)語"過酸"的含義與過氧酸(peroxyacid)、過氧羧酸、過氧酸(peroxyacid)、過羧酸和過IU匕酸(peroxoicacid)相同。如本文中所使用的，術(shù)語"過乙酸"的縮寫為"PAA",其含義與過氧乙酸、乙烷過氧化酸(ethaneperoxoicacid)和所有其它CAS登記號為79-21-0的同義詞的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"過氧源(sourceofperoxygen)，，的意思是指能夠向含水反應(yīng)混合物提供過氧化氫的過氧化合物(即，"過氧源(peroxygensource)，，，其選自過硼酸鹽、過碳酸鹽、過磷酸鹽、過氧化氫、過氧化氫-尿素加合物(CAS#124-43-6)以及它們的混合物。如本文中所使用的，術(shù)語"一醋精，，與單乙酸甘油酯(glycerolmonoacetate)、甘；由一乙酉臾酉旨(glycerinmonoacetate)禾口甘、油基單乙酉臾酉旨(glycerylmonoacetate)的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"二醋精"的含義與二乙酸甘油酯(glyceroldiacetate);甘油二乙酸酉旨(glycerindiacetate),甘油基二乙酉臾酉旨(glyceryldiacetate)和所有其它CAS登記號為25395-31-7的同義詞的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"三醋精"的含義與三乙酸甘油酯(glycerintriacetate);甘油三乙酉臾酉旨(glyceroltriacetate);甘〉'由基三乙酸酉旨(glyceryltriacetate),1,2,3-三乙酰氧丙烷，1,2,3-丙三醇三乙酸酯和所有其它CAS登記號為102-76-1的同義詞的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"一丁精(monobutyrin)"的含義與單丁酉臾"tf"、J由酉旨(glycerolmonobutyrate),"fef"、;由一丁酸酉旨(glycerinmonobutyrate)和甘油基一丁酸酉旨(glycerylmonobutyrate)的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"二丁精(dibutyrin)"的含義與甘油二丁酉臾酉旨(glyceroldibutyrate)禾口甘油基二丁酸酉旨(glyceryldibutyrate)的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"三丁精(tributyrin)"的含義與甘油三丁酸酯(glyceroltributyrate)，1,2,3-三丁?；视秃退蠧AS登記號為60-01-5的其它同義詞的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"一丙精(mon叩ropionin)"的意思與單丙酉臾甘油酉旨(glycerolmonopropionate)、甘油一丙酉臾酉旨(glycerinmonopropionate)禾口甘油基一丙臥臾酉旨(glycerylmonopropionate)的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"二丙精(dipropionin)"的意思與甘油二丙酉交酉旨(glyceroldipropionate)和甘油基二丙酉臾酉旨(glyceryldipropionate)的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"三丙精(tripropionin)"的含義與甘油基三丙酉臾酉旨(glyceryltripropionate),甘油三丙酸酉旨(glyceroltripropionate),1,2,3-三丙?；视秃退衅渌麮AS登記號為139-45-7的同義詞的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"醋酸乙酯"的含義與乙酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙烷酸乙酯(ethylethanoate)、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙酸的乙基酯和所有其它CAS登記號為141-78-6的同義詞的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"乳酸乙基酯"的含義與乳酸乙酯和所有其它CAS登記號為97-64-3的同義詞的含義相同。如本文中所使用的，術(shù)語"適當(dāng)?shù)暮磻?yīng)條件"是指在其中反應(yīng)物和過水解酶催化劑能夠接觸的條件。本文提供了適于反應(yīng)的組分和條件，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預(yù)期適合于所述方法的組分和條件的變化范圍。如本文中所使用的，術(shù)語"過水解"的定義是所選擇底物與過氧化物形成過酸的反應(yīng)。一般地，是使無機過氧化物與所選擇的底物在催化劑的存在下反應(yīng)產(chǎn)生過酸。如本文中所使用的，術(shù)語"化學(xué)過水解"包括在反應(yīng)中底物(過酸的前體)與過氧化氫源發(fā)生了結(jié)合的過水解反應(yīng)，其中所述過酸是在不存在酶催化劑的情況下形成的。如本文中所使用的，術(shù)語"酶催化過水解"是指用酶輔助或催化進行的過水解反應(yīng)。如太矛古所估)l的."非南告過急化,脅醢"、"忐告i寸tu匕物酶"、"HPO"和"細菌卣素過氧化物酶"是指能夠在卣離子和過氧化氫的存在下催化各種底物的卣化的非血紅素卣素過氧化物酶，所述鹵素過氧化物酶可以進一步分為氯過氧化物酶(E.C.1.11.1.10)、溴過氧化物酶或碘過氧化物酶(E.C.1.11.1.8)。已經(jīng)顯示，非血紅素面素過氧化物酶能夠催化?；人犷惖倪^氧化反應(yīng)生成過酸(US6,703,540;Jacks等人，上文，2000;Jacks等人,上文，2002)。如本酸酯底物顯示具有過水解活性的非血紅素卣素過氧化物酶。如本文中所使用的，"惡臭假單胞菌5B"是保藏在NorthernRegionalResearchLab(NRRL)保藏編號為NRRL-18668的惡臭假單胞菌林(US5,811,286)。所述NorthernRegionalResearchLab已經(jīng)更名為NationalCenterforAgriculture,.USDAResearch(Peoria，IL)。如本文中所使用的，"根癌土壤桿菌，，是指根癌土壤桿菌菌抹C58(Goodner等人,Sc,e"ce,294(5550):2323-2328(2001))。該菌林也被稱為放射型根瘤菌(A/n^&wmrad/oM"w),該菌林能夠從AmericanTypeCultureCollection(ATCC)獲得，保藏標(biāo)記號為ATCC33970。如本文中使用的，術(shù)語"過水解酶催化劑，，在本文中是指以過水解活性為特征的酶催化劑(非血紅素卣代過水解酶)。所述酶催化劑可以是全微生物細胞、通透化微生物細胞(復(fù)數(shù))、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分、部分純化的酶或純化的酶的形式。如本文中所描述的，非血紅素閨素過氧化物酶顯示對羧酸酯具有過水解活性。如本文中使用的，術(shù)語"過水解酶活性"是指每單位質(zhì)量(例如，毫克)蛋白、細胞干重或固定化催化劑重量的催化活性。對催化劑的過水解酶活性的比較是與細胞干重或蛋白催化劑重量成比例地確定的。如本文中所使用的，"一個單位的酶活性，，或"一個單位的活性"或"U"的定義是在規(guī)定溫度下每分鐘制備lpmol過酸產(chǎn)品所需的酶活性的數(shù)值。如在本文中所使用的，術(shù)語"消毒"是指凈化從而破壞并預(yù)防病原性微生物生長的過程。正如本文中所使用的，術(shù)語"消毒劑"是指能夠通過破壞、抵消或抑制攜帶病原的微生物的生長而實現(xiàn)消毒的試劑。一般消毒劑被用于處理無生物或表面。如本文中所使用的，術(shù)語"抗菌劑"是指能夠抑制攜帶病原的微生物生長的化學(xué)試劑。如本文中所使用的，術(shù)語"殺病毒劑"和"殺毒劑"是指能夠抑制或破壞病毒的試劑。顯示出具有抑制或破壞病毒的能力的試劑被稱作具有"殺病毒，，或"殺毒"活性。過酸具有殺病毒活性。適合用于本發(fā)明的本領(lǐng)域已知的典型可選擇殺病毒劑包括，例如，醇類、醚類、氯仿、曱醛、苯酚類、(3-丙內(nèi)酯、碘、氯氣、汞鹽、羥胺、環(huán)氧乙烷、乙二醇、季銨化合物、酶和洗滌劑。如本文中所使用的，術(shù)語"殺生物劑"是指能夠使微生物滅活或能夠破壞微生物的化學(xué)試劑，其一般是廣譜的。顯示出能夠使微生物滅活或能夠破壞微生物的化學(xué)試劑被稱為具有"殺生物"活性。過酸具有殺生物活性。適合用于本發(fā)明的本領(lǐng)域已知的典型可選擇殺生物劑包括，例如，氯氣、二氧化氯、氯異氰脲酸酯、次氯酸鹽、臭氧、丙烯醛、胺、氯代酚醛樹脂、銅鹽、有機-硫化合物和季銨鹽。如本文中所使用的，短語"最小殺生物濃度"是指能夠在特定接觸時間內(nèi)使目標(biāo)微生物活種群發(fā)生所期望的減少的殺生物劑最小濃度，其中所述減少是致死的、不可逆的。有效性可以通過處理之后活微生物的logw減少來衡量。在一方面，處理之后活細胞的目標(biāo)減少量為3-log的減少，更優(yōu)選為4-log的減少，最優(yōu)選至少為5-log的減少。在另一方面，最小殺生物濃度是活微生物細胞的6-log的減少。如本文中所使用的，修飾本發(fā)明或本發(fā)明使用的組分或反應(yīng)物的數(shù)量的術(shù)語"約，，是指，例如通過在實際作業(yè)中制備濃縮物或使用溶液的一般測量和液體處理方法；通過這些操作過程中的偶然誤差；通過制備組合物或?qū)嵤┓椒〞r使用的組分在制備、來源或純度方面的差異等而產(chǎn)生的數(shù)值大小的改變。對于由特殊初始混合物而獲得的組合物來說，術(shù)語"約"還包括由于不同平衡條件而導(dǎo)致有所不同的量。無論是否有術(shù)語"約"修飾，權(quán)利要求均包括所述數(shù)量的等同物。由羧酸酯和過氧化氫酶-催化制備過酸的合適的反應(yīng)條件本發(fā)明的一個方面提供了制備含有過酸的含水混合物的方法，所述方法是通過使羧酸酯與無機過氧化物在具有過水解活性的非血紅素卣素過氧化物酶催化劑的存在下反應(yīng)而實現(xiàn)的，其中所述無機過氧化物不限于為過氧化氫、過硼酸鈉或過碳酸鈉。合適的羧酸酯底物具有選自以下結(jié)構(gòu)的化學(xué)式a)具有以下化學(xué)式的酯其中R產(chǎn)C1到C10的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或CI到C4的烷氧基取代，并且R2=C1到CIO的直鏈或支鏈烷基，(CH2CH2-0)nH或(CH2CH(CH3)-0)nH,并且n-l到10;和b)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中R產(chǎn)C1到CIO的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或CI到C4的烷氧基取代，并且R3和R4各自為H或R!C(O)。在一方面，羧酸酯底物選自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸曱酯、乙醇酸乙酯、曱氧基乙酸甲酯、曱氧基乙酸乙酯、3-羥基丁酸曱酯、3-羥基丁酸乙酯、2-乙?；鶛幟仕崛阴ァ⑵咸烟俏逡宜狨?、葡糖酸內(nèi)酯、甘油酯(單、二和三酸甘油酯)例如單乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯(1,2,3-丙三醇二乙酸酯)、三醋精(三乙酸甘油酯)、單丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯(三丙酸甘油基酯)、一丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯(二丁酸甘油基酯)、三丁酸甘油酯(三丁酸甘油基酯)和他們的混合物。另一方面，羧酸酯底物選自單乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、二丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、一丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。仍然在另一方面，羧酸酯底物選自二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。酶底物(羧酸酯)是以足以通過酶-催化過水解制備所需濃度的過酸的濃度存在于反應(yīng)混合物中的。在所附的實施例中已經(jīng)顯示，對于制備所期望濃度的過酸來說存在優(yōu)選的酶底物和酶催化劑組合。羧酸酯不必完全溶解在反應(yīng)混合物中，但其應(yīng)具有足夠的溶解度以使所述酯能夠通過酶催化劑轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的過酸。羧酸酯底物以0.05wt。/。到40wt%的反應(yīng)混合物的濃度存在于反應(yīng)混合物中，優(yōu)選以0.1wt%到20wto/o的反應(yīng)混合物的濃度存在，更優(yōu)選以0.5wtM到10wtM的反應(yīng)混合物的濃度存在。過氧源可以包括，但不限于，過氧化氬、過硼酸鹽、過磷酸鹽、過碳酸鹽以及他們的混合物。過氧化合物在反應(yīng)混合物中的濃度可以在0.1wt%到約50wt%，優(yōu)選1wt%到約40wt%,更優(yōu)選2wt%到約30wt。/o的范圍之內(nèi)。本文中所描述的酶催化劑是非血紅素卣素過氧化物酶家族的成員(例如氯過氧化物酶[E.C.l.ll.l.lO],溴過氧化物酶和缺過氧化物酶[E.C.1.11.1.8])。具有催化作用的三聯(lián)體(絲氨酸97:天冬氨酸229:組氨酸258)已經(jīng)被報導(dǎo)是使該族蛋白具有面化活性的原因(Pelletier等人，S/oc/2膽cae^—戸'c"cm1250:149-157(1995))。本發(fā)明非血紅素卣素過氧化物酶包含該三聯(lián)體，雖然來自根癌土壤桿菌(AtuA2;SEQIDNO:18)的本發(fā)明非血紅素卣素過氧化物酶中的一個似乎具有47個氨基酸的N端延伸。當(dāng)不存在47個氨基酸的N端延伸時，AtuA2含有特有的三聯(lián)體，該三聯(lián)體使其具有卣化活性。特別地，用于本發(fā)明的酶是對羧酸酯底物具有過水解活性的非血紅素卣素過氧化物酶。在一方面，酶催化劑是來源于原核生物或從原核生物中分離出來的非血紅素卣素過氧化物酶。在另一方面，所述非血紅素卣素過氧化物酶是來源于細菌或從細菌分離中分離出來的。在另一方面，非血紅素卣素過氧化物酶來源于選自假單胞菌屬(尸化wc/omo"ww.)和土壤桿菌屬(jgra^c&hwmw.)的生物。在進一方面，非血紅素卣素過氧化物酶的來源選自惡臭假單胞菌和根癌土壤桿菌。在優(yōu)選的方面，非血紅素鹵素過氧化物酶的來源選自惡臭假單胞菌5B(NRRL-18668)和根癌土壤桿菌C58(ATCC33970)。在一方面，用于本發(fā)明的核酸分子是那些編碼下述非血紅素鹵素過氧化物酶的核酸分子，所述非血紅素卣素過氧化物酶與選自SEQIDNO:10,14,18,22和28的氨基酸序列具有至少80%的同一性。在另一方面，本方法使用的編碼非血紅素卣素過氧化物酶的核酸分子與本文所報導(dǎo)的氨基酸序列具有至少85%,優(yōu)選至少90%,甚至更優(yōu)選至少95%,甚至又更加優(yōu)選至少98%,最優(yōu)選至少99%的同一性。在進一步的實施方式中，本方法使用的編碼非血紅素鹵素過氧化物酶的核酸序列表示為選自SEQIDNOs:10,14,18,22和28的氨基酸序列。在進一步的實施方式中，適合于本方法的編碼非血紅素卣素過氧化物酶的核酸序列與本文所提供的序列具有至少80%，更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%,甚至又更加優(yōu)選95%,甚至又更加優(yōu)選98%,更優(yōu)選至少99%的核酸序列同一性。在另一方面，適合于本方法的編碼非血紅素卣素過氧化物酶的核酸序列具有選自SEQIDNOs:9,13,17,21和27的核酸序列。已經(jīng)報導(dǎo)有許多酶催化劑(全細胞，部分純化或純化的)具有過氧化氬酶活性(EC1.11.1.6)。過氧化氫酶能夠?qū)⑦^氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水。一方面，過水解催化酶的過氧化氫酶活性是不足的。另一方面，可以向反應(yīng)混合物中加入過氧化氬酶抑制劑。過氧化氫酶抑制劑的例子包括，但不限于，疊氮化鈉和羥胺硫酸鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)需要調(diào)節(jié)過氧化氫酶抑制劑的濃度。過氧化氫酶抑制劑的濃度一般在0.1mM到約1M;優(yōu)選約1mM到約50mM;更優(yōu)選約1mM到約20mM的范圍內(nèi)。在一個方面，疊氮化鈉的濃度一般在約20mM到約60mM的范圍內(nèi)，而羥胺流散鹽的濃度一般在約0.5mM到約30mM的范圍內(nèi)，優(yōu)選約10mM。在優(yōu)選的實施方式中，酶催化劑不具有顯著的過氧化氫酶活性或者通過操作使其過氧化氫酶活性得到減少或消除。用于重組表達本發(fā)明過水解酶的宿主細胞可以選自那些缺乏過氧化氫酶活性的宿主細胞(例如，大腸桿菌(￡.co")菌林UM2(CGSC7156))。在進一步的實施方式中，宿主細胞內(nèi)的過氧化氫酶活性可以通過用熟知的技術(shù)破壞負責(zé)過氧化氫酶活性的基因(復(fù)數(shù))的表達而得到調(diào)低或消除，所述技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)位子誘變、RNA反義表達、目標(biāo)"i秀變和隨枳J秀變。選擇酶催化劑在含水反應(yīng)混合物中的濃度以獲得所期望的反應(yīng)速率，所述濃度還取決于酶催化劑的具體催化活性。用作催化劑的可溶解酶在過水解反應(yīng)物中的重量一般在0.05mg到10mg酶每mL總反應(yīng)物體積的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.10mg到2.0mg酶每mL。還可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將酶固定在可溶解或不可溶解的支持物上；參見寸列^口，ImmobilizationofEnzymesandCells;GordonF.Bickerstaff,纟扁輯；Humana出版，Totowa,NJ，USA;1997。固定化酶的使用使催化劑能夠在后續(xù)反應(yīng)中被回收和再利用。能夠用于本申請的酶催化劑的其他形式包括全微生物細胞、細胞提取物和部分純化的酶。這些其他形式的催化劑也可以用以上參考的方法固定。在一方面，由羧酸酯的化學(xué)過水解和酶催化過水解結(jié)合產(chǎn)生的過酸的濃度足以在期望pH下提供漂白或消毒用有效濃度的過酸。在另一方面，本方法提供了通過結(jié)合酶和酶底物制備所需有效濃度的過酸的方法，其中在不加入酶的情況下，所制備的過酸的濃度會顯著地降低。雖然有時候通過無機過氧化物與酶底物的直接化學(xué)反應(yīng)會導(dǎo)致酶底物的明顯化學(xué)過水解，但是化學(xué)過水解所產(chǎn)生的過酸的濃度可能不足以在所需應(yīng)用中提供有效濃度的過酸，而通過向反應(yīng)混合中加入適當(dāng)?shù)倪^酶催化劑能夠使總過酸濃度得到顯著的增加。由羧酸酯的酶催化過水解產(chǎn)生的過酸的濃度至少為500ppb過酸，優(yōu)選至少為lppm過酸，更優(yōu)選至少為2ppm過酸，甚至更優(yōu)選至少為4ppm過酸，甚至更加優(yōu)選至少5ppm,最優(yōu)選至少8ppm。為了制備所期望的過酸濃度較低的混合物，可以任選地用水或主要由水組成的溶液來稀釋含有過酸的產(chǎn)物混合物。制備所期望濃度的過酸所需要的反應(yīng)時間不超過約二小時，優(yōu)選不超過約30分鐘，更優(yōu)選不超過約10分鐘，最優(yōu)選不超過約5分鐘。過酸的濃度可以繼續(xù)增加到高于最初所預(yù)期的在不超過約2小時內(nèi)產(chǎn)生的過酸濃度，以至于反應(yīng)混合物在至少48小時時才產(chǎn)生最高過酸濃度。對反應(yīng)溫度進行選擇以控制反應(yīng)速率和酶催化活性的穩(wěn)定性。反應(yīng)的溫度可以在剛好高于反應(yīng)混合物的水點(約0°C)到約65。C的范圍內(nèi)，優(yōu)選的反應(yīng)溫度范圍是從約5。C到約35°C。含有過酸的最終反應(yīng)混合物的pH為約1到約10,優(yōu)選約2到約7.5,更優(yōu)選約3到約7,甚至更優(yōu)選約3.5到約6.5。反應(yīng)的pH和最終反應(yīng)混合物的pH可以通過加入適當(dāng)?shù)木彌_劑來控制，所述緩沖劑包括但不限于磷酸鹽、焦磷酸鹽、碳酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。緩沖劑的濃度為0.1mM到1.0M,優(yōu)選1mM到100mM,最優(yōu)選10mM到50mM。在另一方面，酶催化過水解產(chǎn)物可以含有另外的組分，所述另外的組分能夠提供合乎需要的功能。在一方面，所述的合乎需要的功能包括能夠?qū)⒃摬牧嫌糜谄讘?yīng)用中。這些另外的組分包括但不限于，乳化劑和表面活性劑。乳化劑的例子包括聚乙烯醇和聚維酮。表面活性劑的例子，包括a)非離子表面活性劑例如環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化或丙氧基化的直線或枝狀一級和二級醇和脂肪族氧化膦，b)陽離子表面活性劑例如季銨化合物，特別是氮原子上連有C8-C20烷基并且另外連有三個Cl-C2烷基的季銨化合物，c)陰離子表面活性劑例如鏈烷基羧酸類(例如C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸鹽、鏈烷基磺酸鹽(例如十二烷基磺酸鈉)或直鏈或支鏈烷基苯磺酸鹽、鏈烯基磺酸鹽，以及d)兩性和兩性離子表面活性劑例如氨基羧酸類、氨基二羧酸類和烷基甜菜堿(alkybetaines)。另外的組分可以包括香料、染料、過氧化氫穩(wěn)定劑(例如l曙羥基亞乙基-U-二膦酸(Dequest2010,SolutiaInc.，StLouis,MO)),酶活性穩(wěn)定劑(例如，聚乙二醇(PEG))，洗滌增效助劑和金屬螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))。在原位酶催化制備過酸本含水酶催化方法能夠在原位制備對殺生物和/或殺病毒應(yīng)用有效濃度的過酸。制得的過酸非常具有反應(yīng)性并且不穩(wěn)定，通常其濃度會隨時間降低。因此，使多種反應(yīng)組分保持分離也許是合意得，尤其是對于制劑的至少一種組分是液體的制劑來說。在一方面，可以將過氧化氫源從底物或酶中，優(yōu)選從兩者中分離出來。所述分離可以使用多種技術(shù)來完成，所述技術(shù)包括但不限于使用多間隔室狀分配器(multicompartmentchambereddispensers)(US4,585,150),并且接著對酶催化劑與所存在的底物進行物理混合以引發(fā)含水酶催化過水解反應(yīng)?？梢詫⒚复呋瘎┕潭ㄔ诜磻?yīng)室內(nèi)部，也可以在與作為處理目標(biāo)的表面和/或物體接觸之前將其從包含過酸的反應(yīng)產(chǎn)物中分離出來(例如通過過濾等)。酶催化劑可以存在于液體基質(zhì)或者固體形式的基質(zhì)(即粉末，片劑)中或者被包埋在固體基質(zhì)的內(nèi)部，接著將所述基質(zhì)與底物混合以用于引發(fā)酶催化過水解反應(yīng)。在進一步的方面，酶催化劑可以包含在可溶解或多孔的袋的內(nèi)部，所述袋可以;故加入到含水底物基質(zhì)中以用于引發(fā)酶催化過水解。用于測定過酸和過氧化氫濃度的HPLC分析方法在本方法中可以使用多種分析方法來分析反應(yīng)物和產(chǎn)物，所述方法包括但不限于，本發(fā)明實施例中所述的滴定，高效液相色語(HPLC),氣相色鐠(GC),質(zhì)譜(MS),毛細管電泳(CE),U.Karst等人描述的分析方法C7ze附.，69(17):3623畫3627(1997))和2，2，畫連氮基隱雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)試驗(S.Minning等人,顛toC7n脂c"加378:293-298(1999)和WO2004/058961Al)。過酸的最小殺生物濃度的測定可以使用丄Gabrielson等人(J.Mcra&o/.逾Ws50:63-73(2002))描述的方法來測定過酸或者過氧化氫和酶底物的最小殺生物濃度(MBC)。所述測定方法是以XTT還原抑制作用為基礎(chǔ)的，其中XTT((2,3-雙[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑錙，一鈉，內(nèi)鹽)是一種氧化還原染料，其能夠通過490nm或450nm下測定的光密度(OD)的改變來顯示微生物的呼吸能力。然而，許多其它方法也可以有效地測定消毒劑和防腐劑的活性，所述其它方法包括但不限于活體平板計數(shù)法、直接顯微鏡計數(shù)法、干重法、濁度測定法、吸光度法和生物發(fā)光法(參見，例如Brock，SemourS.，Disinfection,Sterilization,andPreservation,第5版，LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA，USA;2001)。酶催化制備的過酸組合物的應(yīng)用根據(jù)本方法制備的酶催化形成的過酸可以用于以減少微生物、真菌和病毒污染為目的的各種應(yīng)用，例如醫(yī)療器械(例如內(nèi)窺鏡)、紡織品(例如，服裝、氈毯)、食品制品表面、食品貯藏和食品-包裝設(shè)備、用于包裝食物產(chǎn)品的材料、雛雞孵化場和外用生長設(shè)備、動物圍欄和具有微生物的過程廢水的去污和/或殺病毒活動?？梢詫⒚?產(chǎn)生的過酸用于滅活蛋白用制劑(例如含有某些蛋白酶制劑)中以提供另外的殺生物活性。在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的過酸組合物能夠特別有效地用作無法高壓滅菌的醫(yī)療器械和食品包裝設(shè)備用清潔和殺菌劑?？梢允褂肎RAS或食品級的組分(酶、酶底物、過氧化氫和緩沖劑)來制備含過酸的制劑，這樣酶-產(chǎn)生的過酸還可以用于動物死體、肉類、水果和蔬菜的去污，或者用于預(yù)加工食品的去污?？梢詫⒚?產(chǎn)生的過酸加入到最終形態(tài)為粉末、液體、凝膠、固體或氣霧劑的產(chǎn)品中?？梢詫⒚?產(chǎn)生的過酸稀釋到仍能夠提供有效去污作用的濃度。包含有效濃度的過酸的組合物可以用于對;故病原性微生物和/或病毒污染的(或懷疑被污染的)表面和/或物體進行清潔和消毒，所述清潔和消毒是通過使所述表面或物體與由本發(fā)明方法制備的產(chǎn)品接觸而進行的。正如本文所使用的，"接觸"是指將包含有效濃度的過酸的消毒組合物與懷疑被致病實體污染的表面或無生物接觸一段足以完成清潔和消毒的時間。接觸包括噴霧、處理、浸漬、沖洗、傾注在其上或其內(nèi)、混合、結(jié)合、涂漬、涂覆、施加、粘貼以及其他能夠?qū)行舛冗^酸的過酸溶液傳遞給懷疑被污染的表面或無生物的方式。包含有效濃度的過酸的組合物還可以含有另外的抗微生物劑、殺病毒劑或殺生物劑。這些試劑與由請求保護的方法制備的過酸相結(jié)合，在用于對被病原性微生物、病毒和/或蛋白感染素污染(或懷疑被污染)的表面和/或物體進行清潔和消毒時可以提供增效和/或協(xié)同作用。合適的抗微生物劑包括羧酸酯(例如，對-羥基烷基苯甲酸酯和肉桂酸烷基酯)，磺酸(例如，十二烷基苯磺酸)，碘化合物或具有活性的面素化合物(例如，卣素單質(zhì)，卣素氧化物(例如，NaOCl,HOC1,HOBr，CI02),碘，互卣化物(interhalides)(例如，一氯化碘，二氯化碘，三氯化硪，四氯化碘，氯化溴，一溴化碘或二溴化碘)，多卣化物，次氯酸鹽，次氯酸，次溴酸鹽，次溴酸，氯代-和溴代-乙內(nèi)酰脲，二氧化氯和亞氯酸鈉)，有機過氧化物包括過氧化苯曱酰、烷基過氧化苯曱酰，臭氧，純態(tài)氧產(chǎn)生物及其混合物，苯酚衍生物(例如，鄰-苯基苯盼，鄰-節(jié)基-對-氯盼，叔-戊基苯酚和CrC6烷基羥基苯曱酸酯)，季銨化合物(例如，烷基二曱基苯曱基氯化銨，二烷基二曱基氯化銨和他們的混合物)，以及這樣的抗微生物劑的混合物，上述抗微生物劑的含量是足以提供所需程度的微生物保護的量?？刮⑸飫┑挠行Я堪s0.001Wt-%到約60Wt-。/。的抗微生物劑，約0.01Wt-%到約15wt-n/。的抗微生物劑，或者約0.08wt-。/o到約2.5wt-。/o的抗微生物劑。申請人明確地將所有引用參考文獻的全部內(nèi)容引入到本公開文本中。此外，當(dāng)數(shù)量、濃度或其他數(shù)值或參數(shù)是作為范圍、優(yōu)選范圍或一列較高優(yōu)選值和較低優(yōu)選值給出的時，應(yīng)理解為其明確地公開了所有由任意一對任意上限值或優(yōu)選值和任意下限值或優(yōu)選值形成的范圍，不論所述范圍是否被單獨地公開。當(dāng)本文對數(shù)值范圍進行描述時，除非另有說明，所述范圍意圖包括其端點和在該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。在定義一個范圍時，其并不是試圖將本發(fā)明的范圍限定于所描述的具體數(shù)值。一般方法以下實施例是提供用來證明本發(fā)明的優(yōu)選方面的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)可以預(yù)見到，實施例中公開的工藝是按照本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的能夠很好地實現(xiàn)本發(fā)明的代表性工藝進行的，因此其可以被認(rèn)為是構(gòu)成了用于實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮到本申請公開內(nèi)容以后應(yīng)當(dāng)能夠預(yù)見，可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對所公開的具體實施方式進行許多變化且仍能獲得相同或相似的結(jié)果。PCR參數(shù)利用PCR擴增來合成核酸分子的方法是本領(lǐng)域所熟知的。PCR試劑是由RocheDiagnosticsCorporation(Indianapolis,IN)獲4尋的,才耍廠家說明書中推薦的方式使用。PCR周期參數(shù)如下第1步5分鐘，95°C第2步0.5分鐘，95°C(變性)第3步0.5分鐘，55°C(逐漸冷卻)第4步1分鐘，74°C(擴增)第2-4步重復(fù)循環(huán)25次除非另有指明，所有的試劑和原料都是從DIFCOLaboratories(Detroit,Ml),GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)，TCIAmerica(Portland,OR)，RocheDiagnosticsCorporation(Indianapolis,IN)或Sigma/AldrichChemicalCompany(St.Louis,MO)獲得的。說明書中的以下縮寫對應(yīng)于以下測量、工藝、特征或化合物單位"sec"或"s"的含義是秒(復(fù)數(shù))，"min"的含義是分鐘(復(fù)數(shù))，"h"或"hr"的含義是小時(復(fù)數(shù))，"d，，的含義是以g/mL表示的密度，"|iL"的含義是微升，"mL"的含義是毫升，"L"的含義是升，"mM"的含義是毫克分子的，"M"的含義是摩爾，"mmol"的含義是毫摩爾(復(fù)數(shù))，"ppm"的含義是百萬分之一，"ppb"的含義是十億分之一，"wt"的含義是重量，"wt%"的含義是重量百分比，"g"的含義是克，'Vg"的含義是微克，"HPLC"的含義是高效液相色譜，"O.D."的含義是指定波長下的光密度，"dew"的含義是干細胞重量，"CFU"的含義是菌落數(shù)，"ATCC"或"ATCC⑧，，的含義是AmericanTypeCultureCollection,"U"的含義是過水解酶活性單位，"RPM"的含義是每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)，"EDTA"的含義是乙二胺四乙酸，"IPTG"的含義是異丙基P-D-疏代吡喃半乳糖苷，"CFU"的含義是菌落單位，"XTT"意思是(2,3-雙[2-曱氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鏡-5-曱酰苯胺(carboxanilide)內(nèi)鹽；CAS#111072-31-2),以及"CGSC，，的含義是ColiGeneticStockCenter(YaleUniversityEscherichiaColiGeneticStockCenter,NewHaven,CT)。實施例1惡臭假單胞菌5B非血紅素卣素過氧化物酶的克隆以來自惡臭假單胞菌菌抹的公開非血紅素鹵素過氧化物酶序列為基礎(chǔ)設(shè)計一系列的PCR引物，所述惡臭假單胞菌菌林包括KT2440,IF-3和MR-2068(分別為，GenBank26991929、6451702和1360922)。4吏用來自惡臭假單胞菌5B(NRRL-18668)的基因組DNA的PCR與引物#1(5畫GATCTGGTCATCGTCGCCATGCATCAC-3，；SEQIDNO:1)和引物#2(5,畫GCCGACGACTGGGACGCGCAGATG-3';SEQIDNO:2)以及與引物#1和引物#3(5，-ATGAGCTACGTCACCACCAAAGATGG隱3';SEQIDNO:3)分別生成了大約600bp和700bp的產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的核普酸序列(SEQIDNos:4和5)以及相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列被證實與部分非血紅素囟素過氧化物酶基因具有同一性。用引物#4(5'-GGCTACGTCGTCGGCATAGTGGTC-3，；SEQIDNO:6)的基因組測序顯示在非血紅素卣素過氧化物酶基因的上游存在幾百bp的尸M限制位點。用尸圳連接所述基因組DNA然后進行結(jié)扎，使用引物#5(5,-GGTGGAAGTGGATCACCGGTGCATCGC畫3';SEQIDNO:7)和引物#6(5，-GCCCATTACGATGGCATCGTGGC-3';SEQIDNO:8)進行反向PCR。將由該PCR產(chǎn)物獲得的核苷酸序列用于解釋整個天然惡臭假單胞菌5B非血紅素卣素過氧化物酶的編碼序列(SEQIDNO:9),所述編碼序列是對SEQIDNO:10所示的氨基酸進行的編碼。實施例2惡臭假單胞菌5B非血紅素卣素過氧化物酶在大腸桿菌中的表達將來自惡臭假單胞菌5B的非血紅素鹵素過氧化物酶使用引物#7(5'-GAATTCATGAGCTATGTAACCACGAAGGACGGC-3，；SEQIDNO:11)和引物#83，；SEQIDNO:12)進行PCR擴增，并亞克隆入pTrcHis2-TOPO(Invitrogen)和pCR4-TOPO(Invitrogen)以分別產(chǎn)生表達質(zhì)粒pSW167和pSW169。此外，將來自pSW169的EcoRI片段亞克隆入pET-28a(Novagen;Madison,Wl)以產(chǎn)生表達質(zhì)粒pSW174。用pSW167或pSW169對大腸桿菌TOP10(Invitrogen)進行轉(zhuǎn)化以分別產(chǎn)生菌林TOP10/pSW167和TOP10/pSW169。用pSW174對大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)進行轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生菌抹BL21/pSW174。根據(jù)Invitrogen's表達協(xié)議在TOP10/pSW167,TOP10/pSW169和BL21/pSW174中表達5B非血紅素卣素過氧化物酶?；旧希贠D6(X)=0.5-0.6下用1mM的IPTG在37。C且搖動的條件下誘導(dǎo)細胞3hr。SDS-PAGE分析證實產(chǎn)生了分子量為大約30kDa的蛋白，在對照林(無質(zhì)粒的宿主)中不存在該分子量帶。還用pSW167和pSW169對大腸桿菌FM5(TCC53911)和大腸桿菌UM2(GSC7156)進行轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生菌林FM5/pSW167,UM2/pSW167,FM5/pSW169和UM2/pSW169。實施例3根癌土壤桿菌(A"me&c,e朋)非血紅素鹵素過氧化物酶(GenBank16119616)在大腸桿菌中的表達來自根癌土壤桿菌C58("C58")的非血紅素卣素過氧化物酶基因(GenBank⑧16119616;在本文中也稱作"AtuAl，，;SEQIDNos:13-14)用引物#9(5'-ATGGGCTTCGTAACAACCAAGGACGGCAC-3，；SEQIDNO:15)和引物#10(5，-TCAGCCCTTGATGAAGGCTAGCAGGTCCTG-3，；SEQIDNO:16)進行PCR-擴增并亞克隆入pCR4-TOPO(Invitrogen)以產(chǎn)生pSW166質(zhì)粒。此外，將來自pSW166的EcoRI片段亞克隆入pET-28a(Novagen)以產(chǎn)生表達質(zhì)粒pSW175。用pSW166轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10(Invitrogen)以產(chǎn)生菌抹TOP10/pSW166。用pSW175轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)以產(chǎn)生菌林BL21/pSW175。將C58非血紅素卣素過氧化物酶通過在OD6。。=0.5-0.6下用1mM的IPTG在37。C且搖動條件下誘導(dǎo)3hr從而表達于TOP10/pSW166和BL21/pSW175中。SDS-PAGE分析證實產(chǎn)生了分子量為大約30kDa的蛋白，在對照抹(無質(zhì)粒的細胞)中不存在該蛋白。還用pSW166對大腸桿菌FM5(ATCC53911)和大腸桿菌UM2(CGSC7156)進行了轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生菌抹FM5/pSW166和UM2/pSW166。實施例4根癌土壤桿菌非血紅素卣素過氧化物酶(GenBank16119293)在大腸桿菌中的表達將來自根癌土壤桿菌C58的非血紅素卣素過氧化物酶基因(GenBank⑧16119293;在本文中也稱作"AtuA2，，；SEQIDNos:17-18)用引物#11(5'-ATGTCGCGTTTCACCACCACTGACGGTACC-3，；SEQIDNO:19)和引物#12(5，-TCAGCCGTGGATAAAGGCGAGCACGTCG-3';SEQIDNO:20)進行PCR-擴增，并亞克隆入pCR4-TOPO(Invitrogen)和pTrcHis2-TOPO(Invitrogen)中以分別產(chǎn)生表達質(zhì)粒pSW171和pSW173。此外，將來自pSW171的EcoRI片段亞克隆入pET-28a(Novagen)中以產(chǎn)生表達質(zhì)粒pSW176。用pSW171或pSW173轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10(Invitrogen)以分別產(chǎn)生菌抹TOP10/pSW171和TOP10/pSW173。用pSW176轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)以產(chǎn)生菌株BL21/pSW176。將C58非血紅素卣素過氧化物酶通過在OD600=0.5-0.6下用1mM的IPTG在37。C且搖動條件下誘導(dǎo)3hr而表達于TOP10/pSW171、TOP10/pSW173和BL21/pSW176中。SDS-PAGE分析證實產(chǎn)生了分子量為大約30kDa的蛋白，在對照抹(無質(zhì)粒的宿主細胞)中不存在該蛋白。還用pSW171和pSW173對大腸桿菌FM5(ATCC53911)和大腸桿菌UM2(CGSC7156)進行了轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生菌林FM5/pSW171、UM2/pSW171、FM5/pSW173和UM2/pSW173。實施例5根癌土壤桿菌非血紅素卣素過氧化物酶(GenBank⑧15891475)在大腸桿菌中的表達將來自根癌土壤桿菌C58的非血紅素卣素過氧化物酶基因(GenBank15891475;在本文中也稱作"AtuA3，，；SEQIDNos:21-22)用引物#13(5，-ATGACAACGATCACCACCAGAGACGGAACG-3，；SEQIDNO:23)和引物#14(5'-TCAGGCGTTGATGAAGGTGAGGAGGTCG-3，；SEQIDNO:24)進行PCR-擴增，并亞克隆入pTrcHis2-TOPO(Invitrogen)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pSW170。此外，將來自根癌土壤桿菌C58的非血紅素卣素過氧化物酶基因(GenBank15891475)用引物#15(5，-CAATTGATGACAACGATCACCACCAGAGACG-3，；SEQIDNO:25)和引物#16(5,-CAATTGATGACAACGATCACCACCAGAGACG-3，；SEQIDNO:26)進行PCR擴增，并亞克隆入pET-28a(Novagen)的A^el和之間以產(chǎn)生表達質(zhì)粒pSW177。用pSW170轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10(Invitrogen)以產(chǎn)生菌林TOP10/pSW170。將C58非血紅素卣素過氧化物酶通過在OD6(K)=0.5-0.6下用1mM的IPTG在37。C且搖動條件下誘導(dǎo)3hr而表達于TOP10/pSW170和BL21/pSW177中。SDS-PAGE分析證實產(chǎn)生了分子量為大約30kDa的蛋白，在對照抹(無質(zhì)粒的宿主細胞)中不存在這樣的蛋白。還用pSW170對大腸桿菌FM5(ATCC53911)和大腸桿菌UM2(CGSC7156)進行了轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生菌林FM5/pSW170和UM2/pSW170。實施例6根癌土壤桿菌非血紅素鹵素過氧化物酶(GenBank15891444)在大腸桿菌中的表達將來自根癌土壤桿菌C58的非血紅素卣素過氧化物酶基因(GenBank15891444;在本文中也稱作"AtuA4，，;SEQIDNos:27-28)用引物#17(5，-ATGGGCTTTGTTAAGACGACAGACGGAACC-3，；SEQIDNO:29)和引物#18(5，-TCAGCCCTTGATGAAGGCCAGCAGATCC-3，；SEQIDNO:30)進行PCR擴增，并亞克隆入pTrcHis2-TOPO(Invitrogen)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pSW172。此外，將來自根癌土壤桿菌C58的非血紅素鹵素過氧化物酶基因(GenBank15891444)用引物#19(5，-ATGAATTCATGGGCTTTGTTAAGACGACAGACG-3，；SEQIDNO:31)和引物#20(5，-ATGCGGCCGCTCAGCCCTTGATGAAGGCCAGCAGATC-3，；SEQIDNO:32)進4亍PCR擴增，并亞克隆入pET-28a(Novagen)以產(chǎn)生表達質(zhì)粒pSW178。用pSW172轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10(Invitrogen)以產(chǎn)生菌林TOP10/pSW172。用pSW178轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)以產(chǎn)生菌株BL21/pSW178。將C58非血紅素卣素過氧化物酶通過在OD600=0.5-0.6下用1mM的IPTG在37。C且搖動條件下誘導(dǎo)3hr而表達于TOP10/pSW172和BL21/pSW178中。SDS-PAGE分析證實產(chǎn)生了分子量為大約30kDa的蛋白，在對照林(無質(zhì)粒的宿主細胞)中不存在這樣的蛋白。還用pSW172對大腸桿菌FM5(ATCC53911)和大腸桿菌UM2(CGSC7156)進行了轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生菌抹FM5/pSW172和UM2/pSW172。實施例7細胞漿液的制備將來自LB板的單一菌落，所述LB板含有安比西林(大腸桿菌TOP10)或卡那霉素(大腸桿菌BL21)，轉(zhuǎn)移到2mL的含有50|ug/mL安比西林或卡那霉素的Miller'sLB肉湯中，并且在37。C和搖動條件(250rpm)下培養(yǎng)16-18小時。將50mL含有適當(dāng)抗生素的Miller'sLB用0.5mL的18hr培養(yǎng)物接種。在37。C和搖動(250rpm)條件下培養(yǎng)細胞直至光密度(OD6Q。)達到0.5。加入1M的IPTG溶液直到最終濃度為1mM并繼續(xù)培養(yǎng)3小時。通過以7，000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離20分鐘采集細胞。測量細胞的濕重，并且將細胞球冷凍并存儲在-70。C下。此方法可以按比例放大到500mL。將非重組細胞列(大腸桿菌和惡臭假單胞菌5B(NRRL國18668"從不含抗生素的LB瓊脂上的單一菌落轉(zhuǎn)移到50mL的Miller'sLB中。在37。C和搖動(250rpm)下培養(yǎng)8-18小時。采集條件與重組細胞的相同。實施例8過酸的制備以及在pH6.5下的一全測實-瞼本實施例描述了制備過酸和測量所制備過酸的量的聯(lián)合方法。實驗在96孔微量滴定板上進行，并使用SpectroMaxplus平板讀數(shù)器(MolecularDevicesCorp.;Sunnyvale,CA)在405歸下進行分析。使用2,2，-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)的氧化來測量過酸的濃度。簡單來說就是，將酶催化劑與底物在過氧化氫的存在下混合，從而產(chǎn)生過酸。通過將過酸與ABTS混合，測定所產(chǎn)生的過酸的量。通過在微量滴定板中在405nm下用分光光度法測量氧4匕的ABTS的;農(nóng)l。將全細胞漿液懸浮在0.1MKH2P04緩沖液(pH6.5)中，最終濃度范圍是0.04mg/mL到4,0mg/mL細胞濕重。將100細胞懸浮液、30|iL0.1M的磷酸鹽緩沖液(pK6.5)、20piL313mM的過氧化氬和50iuL200mM的底物的混合物在37。C下溫育15分鐘至24小時。通過從反應(yīng)混合物中省去過氧化氫并用等體積的去離子水代替來制備對照樣品。測試反應(yīng)混合物的方法是將100|iL來自離心的反應(yīng)混合物的上清液與50juL1.5M的含有0.03mg/mL硤化鉀的乙酸和501mg/mL的2,2，-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)在微量滴定板的孔中混合，室溫下溫育IO分鐘，并在405nm下測量測試混合物的吸光度。實施例9過酸的制備以及在pH4.0下的檢測實馬全本實施例描述了制備過酸和測量所制備過酸的量的聯(lián)合方法。實驗在96孔微量滴定板上進行，并使用SpectroMaxPlus平板讀數(shù)器在405nm下進行分析。將全細胞漿懸浮在0.1M的醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中，最終濃度為50mg/mL細胞濕重。將100pL細胞懸浮液，300.1M醋酸鹽緩沖液(pH4.0),20313mM過氧化氬和50200mM底物的混合物在37。C溫育15分鐘至24小時。通過從反應(yīng)混合物中省去過氧化氫并用等體積的去離子水代替來制備對照樣品。檢測反應(yīng)混合物的方法是將100pL來自離心分離后的反應(yīng)混合物的上清液與50jiL1.5M的含有0.03mg/mL碘化鉀的乙酸和50juL1mg/mL的2,2，-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)在微量滴定板的孔中混合，室溫下溫育IO分鐘，并在405nm下測量#^企測混合物的吸光度。實施例10通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使三乙酸甘油酯與過氧化氬進行過水解來制備過乙酸(pH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用三乙酸甘油酯和過氧化氳檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。由于在這些克隆體中存在過氧化氫酶，所以必須向反應(yīng)混合物中加入疊氮化鈉(50mM)作為過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約24小時后分析樣品(表l)。通過省去加入H202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試驗，所有對照試驗均產(chǎn)生0ppm的過酸。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例11通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使乙酸乙酯與過氧化氫進行過水解來制備過乙酸(PH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用乙酸乙酯和過氧化氫檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。由于在這些克隆體中存在過氧化氫酶，所以必須向反應(yīng)混合物中加入疊氮化鈉(50mM)作為過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約24小時后分析樣品(表2)。通過省去加入H202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試驗，所有對照試驗均產(chǎn)生0ppm的過酸。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實施例12通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使三乙酸甘油酯與過氣化氬進行過水解來制備過乙酸(PH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用三乙酸甘油酯和過氧化氫檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。大腸桿菌宿主UM2是無過氧化氫酶活性的，所以不用向反應(yīng)物中加入過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品(表3)。通過省去加入11202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試驗，所有對照試驗均產(chǎn)生Oppm的過酸。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實施例13通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使乙酸乙酯與過氧化氬進行過水解來制備過乙酸(pH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用乙酸乙酯和過氧化氫檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。大腸桿菌宿主UM2是無過氧化氫酶活性的，所以不用向反應(yīng)物中加入過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品(表4)。通過省去加入11202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試一瞼，所有對照試纟t均產(chǎn)生0ppm的過酸。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例14通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使乳酸乙酯與過氧化氫進行過水解來制備過乳酸(pH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用乳酸乙酯和過氧化氫檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。大腸桿菌宿主UM2是無過氧化氫酶活性的，所以不用向反應(yīng)物中加入過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品(表5)。通過省去加入1^202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試驗，所有對照試驗均產(chǎn)生0ppm的過酸。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例15通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使三乙酸甘油酯與過氧化氫進行過水解來制備過乙酸(dH4.0)按照實施例9中描述的過酸制備的分析方法，使用三乙酸甘油酯和過氧化氫檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。大腸桿菌宿主UM2是無過氧化氫酶活性的，所以不用向反應(yīng)物中加入過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品(表6)。通過省去加入H202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試驗，所有對照試驗均產(chǎn)生0ppm的過酸。表6.大腸桿菌細胞/質(zhì)粒ID過乙酸(ppm)UM2/pSW1661.6(AtuAl)UM2/pSW1670.75(Ppu5B)對照(沒有H202)0實施例16通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使乙酸乙酯與過氧化氫進行過水解來制備過乙酸(pH4.0)按照實施例9中描述的過酸制備的分析方法，使用乙酸乙酯和過氧化氫檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。大腸桿菌宿主UM2是無過氧化氫酶活性的，所以不用向反應(yīng)物中加入過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品(表7)。通過省去加入H202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試驗，所有對照試驗均產(chǎn)生0ppm的過酸。表7.<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實施例17通過用大腸桿菌非血紅素卣素過氧化物酶轉(zhuǎn)化體使乳酸乙酯與過氧化氫進行過水解來制備過乳酸(PH4.0)按照實施例9中描述的過酸制備的分析方法，使用乳酸乙酯和過氧化氫檢測以下大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的過水解活性。大腸桿菌宿主UM2是無過氧化氫酶活性的，所以不用向反應(yīng)物中加入過氧化氫酶抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品(表8)。通過省去加入H202進行了每種轉(zhuǎn)化體的對照試驗，所有對照試驗均產(chǎn)生0ppm的過酸。表6.<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實施例18通過用惡臭假單胞菌5B非血紅素卣素過氧化物酶使三乙酸甘油酯與過氧化氫進行過水解來制備過乙酸(pH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用三乙酸甘油酯和過氧化氫檢測惡臭假單胞菌5B的過水解活性。在反應(yīng)混合物中使用大約10mM的羥胺硫酸鹽作為過氧化氫酶活性抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品，制得3.7ppm的過乙酸。實施例19通過用惡臭假單胞菌5B非血紅素卣素過氣化物酶使乙酸乙酯與過氧化氫進行過水解來制備過乙酸(pH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用乙酸乙酯和過氧化氬檢測惡臭假單胞菌5B的過水解活性。在反應(yīng)混合物中使用大約10mM的羥胺石充酸鹽作為過氧化氫酶活性抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品，制得2.0ppm的過乙酸。實施例20通過用惡臭假單胞菌5B非血紅素鹵素過氣化物酶使乳酸乙酯與過氧化氫進行過水解來制備過乳乙酸(pH6.5)按照實施例8中描述的過酸制備的分析方法，使用乳酸乙酯和過氧化氫檢測惡臭假單胞菌5B的過水解活性。在反應(yīng)混合物中使用大約10mM的羥胺硫酸鹽作為過氧化氫酶活性抑制劑。在引發(fā)反應(yīng)大約30分鐘后分析樣品，制得3.2ppm的過乳酸。權(quán)利要求1.由羧酸酯底物制備過酸的方法，所述方法包括a)提供一組過酸反應(yīng)組分，所述組分包括1)羧酸酯底物，其選自i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯其中R1＝C1到C10的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或C1到C4的烷氧基取代，并且R2＝C1到C10的直鏈或支鏈烷基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n＝1到10；和ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯其中R1＝C1到C10的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或C1到C4的烷氧基取代，并且R3和R4各自為H或R1C(O)；和2)過氧源；和3)具有過水解活性的非血紅素鹵素過氧化物酶催化劑；和b)在含水反應(yīng)條件下使所述反應(yīng)組分合并，其中所述條件包括約2到約7.5的pH范圍，借此在反應(yīng)組分合并約5分鐘到約2小時的時間內(nèi)制備得到過酸，所述過酸的濃度至少為500ppb。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中pH小于約6.5。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中pH范圍小于約4.5。4.如權(quán)利要求1-3所述的方法，其中所述酯底物選自乳酸曱酯、乳酸乙酯、乙醇酸曱酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸曱酯、曱氧基乙酸乙酯、3-羥基丁酸甲酯、3-羥基丁酸乙酯以及他們的混合物。5.如權(quán)利要求1-3所述的方法，其中所述甘油酯選自單乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、單丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、一丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯和他們的混合物。6.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的方法，其中非血紅素鹵素過氧化物酶來源于選自惡臭假單胞菌(尸"wtfomo"^pw"^)和根癌土壤牙干菌(Jgra6a"en'wmfwwe/ac/e朋)的生物。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中非血紅素卣素過氧化物酶來源于選自惡臭假單胞菌5B(NRRL-18668)和根癌土壤桿菌C58(ATCC33970)的微生物。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中具有過水解活性的非血紅素囟素過氧化物酶是由分離核酸分子編碼的，所述分離核酸分子選自a)編碼多肽的分離核酸分子，所述多肽具有選自SEQIDNO:10,SEQIDNO:14,SEQIDNO:18,SEQIDNO:22和SEQIDNO:28的氨基酸序列；和b)編碼多肽的分離核酸分子，所述多肽與選自SEQIDNO:10,SEQIDNO:14，SEQIDNO:18,SEQIDNO:22和SEQIDNO:28的氨基酸序列具有至少95%的同一性。9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所制備的過酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、曱氧基過乙酸、過-p-羥基丁酸以及他們的混合物。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所制備的過酸是過乙酸。11.一種用酶催化制備的含水過酸組合物減少堅硬表面或無生物上的微生物種群的方法，所述方法包括a)提供一組過酸反應(yīng)組分，所述組分包括l)底物，其選自i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯其中R產(chǎn)C1到C10的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或Cl到C4的烷氧基取代，并且R2=C1到CIO的直鏈或支鏈烷基、(CH2CH2-0)nH或(CH2CH(CH3)-0)nH，并且n=l到10;和ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R，C1到CIO的直鏈或支鏈烷基，所述烷基任選地被羥基或CI到C4的烷氧基取代，并且R3和114各自為H或RC(0);和2)過氧源；和3)具有過水解活性的非血紅素囟素過氧化物酶催化劑；b)提供具有一定濃度的微生物和/或病毒的堅硬表面或無生物；c)在含水反應(yīng)條件下合并所述反應(yīng)組分，其中所述條件包括約2到約7.5的pH范圍，借此在反應(yīng)組分合并約5分鐘到約2小時的時間內(nèi)形成過酸濃度至少為500ppb的過酸產(chǎn)物；d)任選地稀釋所述過酸產(chǎn)物；和e)在所述反應(yīng)組分合并48小時內(nèi)使所述堅硬表面或所迷無生物與步驟c)或步驟d)中制備的過酸相接觸，該接觸能夠使所述微生物的所述濃度減少至少3-log。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在所述反應(yīng)組分合并約30分鐘內(nèi)使所述堅硬表面或無生物與步驟c)或步驟d)中制備的過酸接觸。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中在所述反應(yīng)組分合并約10分鐘內(nèi)使所述堅硬表面或無生物與步驟c)或步驟d)中制備的過酸相接觸。14.根據(jù)權(quán)利要求11至13所述的方法，其中所述微生物的濃度減少至少4-log。15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中pH范圍小于約6.5。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中pH范圍小于約4.5。17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述酯底物選自乳酸曱酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、曱氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羥基丁酸曱酯、3-羥基丁酸乙酯以及他們的混合物。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述酯底物選自乳酸乙酯、乙酸乙酯以及他們的混合物。19.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述甘油酯底物選自單乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、單丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、一丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯和他們的混合物。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述甘油酯底物選自二乙酸甘油酯和三乙酸甘油酯。21.如權(quán)利要求11所述的方法，其中非血紅素卣素過氧化物酶來源于選自惡臭假單胞菌和根癌土壤桿菌的生物。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中非血紅素卣素過氧化物酶來源于選自惡臭假單胞菌5B(NRRL-18668)和根癌土壤桿菌C58(ATCC33970)的微生物。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中具有過水解活性的非血紅素卣素過氧化物酶是由分離核酸分子編碼的，所述分離核酸分子選自a)編碼多肽的分離核酸分子，所述多肽具有選自SEQIDNO:10,SEQIDNO:14,SEQIDNO:18,SEQIDNO:22和SEQIDNO:28的氨基酸序列；和b)編碼多肽的分離核酸分子，所述多肽與選自SEQIDNO:10,SEQIDNO:14，SEQIDNO:18,SEQIDNO:22和SEQIDNO:28的氨基酸序列具有至少95%的同一性。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中過酸是以至少500ppb的濃度在約2小時內(nèi)制備的。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中過酸是以至少1ppm的濃度在約2小時內(nèi)制備的。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中過酸是以至少5ppm的濃度在約2小時內(nèi)制備的。27.如權(quán)利要求11或23所述的方法，其中所制備的過酸選自過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、甲氧基過乙酸、過-(3-羥基丁酸以及他們的混合物。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所制備的過酸是過乙酸。29.—種編碼具有過水解活性的多肽的分離核酸分子，其中所述多肽包含與SEQIDNO:10具有至少98%的同一性的氨基酸序列。30.如權(quán)利要求29所述的分離核酸分子，其編碼的多肽具有如SEQIDNO:IO所示的氨基酸序列。31.如權(quán)利要求11所述的方法，其進一步包括將步驟(c)中的過酸產(chǎn)物與一種或多種其他試劑混合，所述其他試劑包括防腐劑、消毒劑、殺病毒劑、殺生物劑、抗微生物劑或者他們的混合物。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的其他試劑是選自醇類、醚類、氯仿、甲醛、苯酚類、p-丙內(nèi)酯、碘、氯氣、汞鹽、羥胺、環(huán)氧乙烷、乙二醇、季銨化合物、酶和洗滌劑的殺病毒劑。33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的其他試劑是選自氯氣、二氧化氯、氯異氰脲酸酯、次氯酸鹽、臭氧、丙烯醛、胺、氯代酚醛樹脂、銅鹽、有機-硫化合物和季銨鹽的殺生物劑。全文摘要提供了由羧酸酯制備過氧羧酸的方法。更具體地說是使羧酸酯在原位與無機過氧化物在具有過水解活性的非血紅素鹵素過氧化物酶的存在下反應(yīng)生成過氧乙酸，其中所述過水解酶催化劑來源于乳酸桿菌。文檔編號C11D3/20GK101300333SQ200680037213公開日2008年11月5日申請日期2006年10月6日優(yōu)先權(quán)日2005年10月6日發(fā)明者J·E·加瓦根,L·沃納,M·S·佩恩,R·迪科西莫申請人:納幕爾杜邦公司