懸液接種至裸鼠右背部皮下，每只裸鼠接種的細(xì)胞數(shù)為IXlO7個(gè)；裸鼠精心飼養(yǎng)2周后，選擇腫瘤生長良好，腫瘤體積長至約50mm3的裸鼠，作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，然后每只荷瘤裸鼠注射D-Luciferase底物的劑量為150mg/kg,通過小動(dòng)物活體成像儀(Caliper LifeSciences,Hokpinton,MA)初步觀察裸鼠乳腺癌模型的構(gòu)建情況。
[0112]腫瘤體積計(jì)算公式:體積V =長X寬X寬/2。
[0113]當(dāng)裸鼠的腫瘤體積達(dá)到50-60_3時(shí)，即可進(jìn)行體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)。
[0114]將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成3組，每組3只，分別通過尾靜脈注射100 μ I/只包裹FITC的 PEI 溶液(PE1-FITC)和 100 μ I/ 只包裹 FITC 的納米凝膠(PNIPAM/PE1-FITC，1.ν.)，以及通過瘤內(nèi)給藥100 μ I/只樣品包裹FITC的納米凝膠(PNIPAM/PE1-FITC，1.t.)，每只荷瘤裸鼠注射FITC熒光素的劑量為5mg/kg。每天注射I次，連續(xù)注射3天。
[0115]麻醉荷瘤裸鼠，分別在Oh (未注射樣品前，作為空白對(duì)照)、6h、8h、12h和24h五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)用小動(dòng)物活體成像儀考察三組納米凝膠樣品在裸鼠體內(nèi)分布情況并拍照，激發(fā)波長為500nm。
[0116]24h后，對(duì)荷瘤裸鼠實(shí)施安樂死，取出裸鼠的腫瘤組織及心、肝臟、脾臟和腎臟主要組織，同時(shí)用小動(dòng)物成像系統(tǒng)拍照，考察熒光高分子在主要組織的分布，激發(fā)波長為500nm。小鼠臟器冷凍包埋后，做冰凍切片DAPI染色5分鐘、封片，之后采用confocal觀測熒光高分子在腫瘤小鼠臟器內(nèi)的分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示:非靶向熒光微凝膠注射乳腺癌小鼠模型后，I小時(shí)的時(shí)間可以分布到全身部位。隨著時(shí)間的延長，小鼠血液循環(huán)，3至6小時(shí)這一時(shí)間段，熒光高分子由體表位置開始進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部。12至24小時(shí)后，非靶向熒光微凝膠僅在小鼠局部部位殘留，腫瘤部位也未顯示富集；靶向熒光微凝膠注射乳腺癌小鼠模型后，I小時(shí)的時(shí)間可以分布到全身部位，隨著時(shí)間延長，小鼠血液循環(huán)，3至6小時(shí)這一時(shí)間段，熒光高分子由體表位置開始進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部，12小時(shí)后，靶向熒光微凝膠明顯富集在腫瘤部位，腎臟也有少量聚集，這是因?yàn)槟I臟是機(jī)體主要的排泄器官。隨著時(shí)間的延長至24小時(shí)，腎臟部位的微凝膠被代謝掉，而腫瘤部位仍然有較明顯的富集。本實(shí)驗(yàn)在小鼠整體水平驗(yàn)證了靶向熒光微凝膠主要富集在小鼠腫瘤部位。
[0117]實(shí)施例11:靶向、非靶向5-氟尿嘧啶/微凝膠復(fù)合體抑瘤的研究
[0118]裸鼠乳腺癌腫瘤模型的建立，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例10所示:
[0119]當(dāng)裸鼠腫瘤體積達(dá)到50-60_3時(shí)(即腫瘤生長進(jìn)入增生階段)，即可進(jìn)行體內(nèi)腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)，體積計(jì)算公式如前所述；
[0120]將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成4組，包括對(duì)照組、靶向和非靶向nanogel/5-Fu和5_Fu組；通過尾靜脈注射的方式將上述四組藥物打入老鼠體內(nèi)，每組5只。連續(xù)3天，每天注射一次，共計(jì)給藥3次。注射藥物后，每天測量小鼠腫瘤體積大小和體重變化，連續(xù)觀測3周。根據(jù)每日測量腫瘤體積繪制小鼠腫瘤生長曲線圖，評(píng)價(jià)靶向納米凝膠載藥體系體內(nèi)腫瘤殺傷效果。
[0121]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示:靶向5-氟尿嘧啶/微凝膠組可以明顯抑制腫瘤的生長，3周之后，靶向5-Fu/微凝膠處理組小鼠體內(nèi)的腫瘤完全被抑制了 ；而非靶向5-氟尿嘧啶/微凝膠組和單純5-氟尿嘧啶組有一定的抑瘤效果，與陰性對(duì)照相比，腫瘤體積減小3倍左右，這是因?yàn)?-氟尿嘧啶是臨床常用的化療藥物，其殺死腫瘤細(xì)胞能力比較強(qiáng)。非靶向組對(duì)腫瘤的抑制作用要好于游離藥物組，是因?yàn)榉前邢蚪M納米粒子在腫瘤體內(nèi)具有EPR效應(yīng)，增強(qiáng)納米粒子在腫瘤的富集。
[0122]以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種雙靶向遞送化療藥物納米體系，其特征在于，所述的藥物納米體系包括: 藥物載體，以溫度敏感性的聚N-異丙基丙烯酰胺為內(nèi)核，以帶正電荷的聚乙烯亞胺為夕卜殼; 化療藥物，為5-氟尿嘧啶； 藥物載體通過電荷間的相互吸附裝載5-氟尿嘧啶； 藥物載體通過馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯連接抗Her-1抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙靶向遞送化療藥物納米體系，其特征在于，馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯通過mPEGs上馬來酸酐中雙鍵與巰基化抗Her-1抗體上的巰基發(fā)生加成反應(yīng)，將抗Her-1抗體連接到mPEGs上，同時(shí)mPEGs上的琥珀亞酰胺與藥物載體材料中的游離氨基發(fā)生取代反應(yīng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種雙靶向遞送化療藥物納米體系，其特征在于，所述的溫度敏感性的聚N-異丙基丙烯酰胺，在32度是發(fā)生臨界相轉(zhuǎn)變行為。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種雙靶向遞送化療藥物納米體系，其特征在于，所述的聚乙烯亞胺,分子量25KD,為分枝狀。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種雙靶向遞送化療藥物納米體系，其特征在于，所述的納米粒徑為300nm±25nm。6.一種如權(quán)利要求1所述的雙靶向遞送化療藥物納米體系的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: A、陽離子納米凝膠PNIPAM/PEI的制備 先將PE1、NIPAM、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺溶于PBS中，向該P(yáng)BS體系中通入N2除氧后，加入叔丁基過氧化氫，在80°C的油浴封閉環(huán)境下攪拌反應(yīng)2-6h ;反應(yīng)結(jié)束后，通入O2攪拌停止反應(yīng)；37°C下，15000rpm離心純化凝膠10—20min ;用去離子水重新溶解凝膠；用30KD的透析膜在Mill1-Q water中透析5_10天,制得陽離子納米凝膠PNIPAM/PEI ； 所述的PE1、NIPAM、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)這三者的重量比例為4/6/0.1?6/4/0.1 ； B、靶向納米凝膠包裹化療藥物5-Fu的制備 步驟A制備得到的陽離子納米凝膠PNIPAM/PEI與帶有一定負(fù)電荷的5-氟尿嘧啶溶于納米凝膠溶液中，所述的納米凝膠與5-氟尿嘧啶的質(zhì)量比為1:1至1:5 ;然后再通過mPEGs將巰基化的抗Her-1抗體和納米凝膠載體交聯(lián)起來。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙靶向遞送化療藥物納米體系的制備方法，其特征在于，步驟B中:所述的納米凝膠與5-氟尿嘧啶的質(zhì)量比為1:1至1:3 ;所述的巰基化抗Her-1抗體的質(zhì)量與藥物載體的質(zhì)量比為1:10。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙靶向遞送化療藥物納米體系的制備方法，其特征在于，所述的步驟B具體為: 步驟A制備得到的陽離子納米凝膠PNIPAM/PEI與帶有一定負(fù)電荷的5-氟尿嘧啶溶于納米凝膠溶液中，超聲2min，靜置12小時(shí)后，形成粒徑為300nm±25nm的微凝膠/5-FU體系；然后向微凝I父/5-FU體系中加入mPEGs,混勾后，室溫下靜止10小時(shí)；再加入疏基化抗Her-1抗體,將巰基化的抗體和納米凝膠載體交聯(lián)起來，形成抗體修飾的納米凝膠載藥復(fù)合體系。9.一種如權(quán)利要求1所述的雙靶向遞送化療藥物納米體系在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的雙靶向遞送化療藥物納米體系在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤為對(duì)Her-1陽性的腫瘤。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種雙靶向遞送化療藥物納米體系、制備方法及其增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)用。本發(fā)明的雙靶向遞送化療藥物納米體系，其藥物載體以溫度敏感性的聚N-異丙基丙烯酰胺為內(nèi)核，以帶正電荷的聚乙烯亞胺為外殼；所裝載的化療藥物為5-氟尿嘧啶；藥物載體通過馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯還連接抗Her-1抗體。本發(fā)明的雙靶向遞送化療藥物納米體系經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有良好的生物相容性，與游離藥物相比，能夠通過EPR效應(yīng)、溫敏和抗體多重靶向，增強(qiáng)藥物在腫瘤部位的富集，增強(qiáng)其抗腫瘤作用的同時(shí)，大大降低了化療藥物的毒副作用。
【IPC分類】A61K47/32, A61K47/48, A61P35/00, A61K9/50, A61K31/513, A61K47/42
【公開號(hào)】CN105535988
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410606230
【發(fā)明人】李威, 張歌, 張莉, 孫赟, 蔣成, 陳迪, 趙夢(mèng)鑫, 柯長洪
【申請(qǐng)人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2014年10月31日