系中通入30min的N2除氧后，加入TBHP，在80°C的油浴封閉環(huán)境下攪拌反應(yīng)4h ;反應(yīng)結(jié)束后，通入O2攪拌20min停止反應(yīng)；37°C下,采用落地式高速冷凍離心機(jī)純化凝膠，15000rpm離心15min ;用30mLMill1-Q water重新溶解凝膠；用30KD的透析膜在Mill1-Q water中透析7天，定期換水。保持反應(yīng)體系總質(zhì)量不變的情況下，通過調(diào)節(jié)PEI和NIPAM的比例，即可制備PEI含量不同的聚陽離子納米凝膠。
[0026]所述的步驟B具體為:
[0027]步驟A制備得到的智能靶向納米凝膠PNIPAM/PEI與帶負(fù)電的化療藥物5_Fu溶于去離子水中，按照不同的納米凝膠與5-Fu的質(zhì)量超聲2min,靜置12h后,形成粒徑為250nm左右的微凝膠/5-FU體系；然后向微凝膠/5-FU體系中加入mPEGs，混勻后，室溫下靜止10小時(shí)；再加入巰基化抗Her-1抗體,將巰基化的抗體和納米凝膠載體交聯(lián)起來,形成抗體修飾的納米凝膠載藥復(fù)合體系。
[0028]本發(fā)明的第三方面，提供一種雙靶向遞送化療藥物納米體系在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0029]所述的腫瘤為對Her-1陽性的腫瘤，例如H 125 (人肺癌細(xì)胞)，DiFi (人結(jié)腸癌細(xì)胞)，A431(表皮細(xì)胞癌)等。
[0030]本發(fā)明用具有溫敏特性的PNIPAM和帶正電荷的PEI制備出具有溫敏響應(yīng)性的核殼結(jié)構(gòu)智能納米凝膠包裹化療藥物5-Fu，然后在納米載體表面修飾上能夠靶向腫瘤的抗Her-1抗體用于腫瘤的靶向治療。我們發(fā)現(xiàn)，制備的靶向納米凝膠載藥體系可顯著的被腫瘤細(xì)胞所攝??；體外實(shí)驗(yàn)表明，抗體靶向納米凝膠載藥體系能夠顯著抑制腫瘤的生長；本發(fā)明用小動(dòng)物活體成像儀(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)來檢測我們制備出的這種穩(wěn)定、均一的納米凝膠復(fù)合體通過尾靜脈注射方式在荷瘤裸鼠體內(nèi)24小時(shí)的富集情況，結(jié)果顯示，相對于游離藥物組和非靶向組，抗體靶向組能夠明顯的富集在腫瘤部位；腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗體靶向組通過尾靜脈注射方式給藥的腫瘤體積相對于對照組和非靶向組減少了 15倍和6倍左右。我們的研究結(jié)果表明了我們制備出來的低毒、溫度敏感和抗體主動(dòng)靶向的核殼結(jié)構(gòu)智能納米凝膠/5-Fu復(fù)合體系在腫瘤的治療上具有顯著的療效。
[0031]本發(fā)明制備的靶向納米凝膠載藥體系具有如下特點(diǎn):
[0032](I)該載體以溫度敏感性的聚異丙基丙烯酰胺為內(nèi)核，帶正電荷的聚乙烯亞胺為外殼，借助電荷間的相互吸附可以裝載并實(shí)現(xiàn)5氟尿嘧啶載藥量的可控調(diào)節(jié)；
[0033](2)通過連接物連接抗Her-1抗體后，靶向微凝膠載藥體系能通過納米藥物增強(qiáng)的滲透與滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retent1n effect, EPR)以及抗原抗體的識別和結(jié)合效應(yīng)，增強(qiáng)其在腫瘤內(nèi)部的富集能力。
[0034](3)所述納米凝膠載藥體系與游離化療藥物相比具有更長的半衰期。
【附圖說明】
:
[0035]圖1為靶向納米凝膠載藥體系構(gòu)建示意圖；
[0036]圖2為靶向納米凝膠載藥體系表征分析；
[0037]圖3為靶向納米凝膠載藥體系的生物相容性檢測；
[0038]圖4為靶向納米凝膠載藥體系的載藥和釋放檢測；
[0039]其中4A:不同濃度的5-FU制備的靶向納米凝膠載藥體系載藥量檢測；
[0040]4B:不同載藥量的靶向納米凝膠載藥體系的藥物釋放曲線；
[0041]4C:靶向智能納米載藥體系在不同溫度下的藥物釋放曲線；
[0042]圖5為靶向納米凝膠載藥體系細(xì)胞殺傷功能檢測；
[0043]其中5A:靶向納米凝膠在37°C殺傷腫瘤細(xì)胞能力檢測；
[0044]5B:靶向納米凝膠在40°C殺傷腫瘤細(xì)胞能力檢測；
[0045]圖6為靶向納米凝膠載藥體系體內(nèi)分布檢測；
[0046]圖7為靶向納米凝膠載藥體系體內(nèi)腫瘤殺傷效應(yīng)檢測。
【具體實(shí)施方式】
:
[0047]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0048]下述具體實(shí)施例中的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0049]實(shí)施例1:祀向納米凝膠的制備方法
[0050]1.溶解 0.84g 的 25k PEI 到 20ml Mill1-Q water，用鹽酸調(diào) pH 到 7 ；
[0051]2.準(zhǔn)確稱取0.4746g的NIPAM晶體，13.146mg的BIS晶體到上述溶液中；
[0052]3.將上述混合液轉(zhuǎn)移到50ml磨口燒瓶中，補(bǔ)加1ml Mill1-Q water ；
[0053]4.將燒瓶底部浸入含有硅油的恒溫磁力攪拌器，攪拌下加熱硅油到50°C ；
[0054]5.向體系中通入高純氮?dú)獠嚢?0min ;
[0055]6.30min后，加熱硅油到80°C，并向體系加入250μ I 0.0lM叔丁基過氧化氫(TBHP)；
[0056]7.在80°C條件下，維持氮?dú)猸h(huán)境再攪拌2小時(shí)；
[0057]8.2小時(shí)后，停止N2,通入02，攪拌過夜；
[0058]9.收集制備的微凝膠，35°C下,采用落地式高速冷凍離心機(jī)純化微凝膠，15000rpm離心I 5min ；
[0059]10.用30ml Mill1-Q water重新溶解微凝膠沉淀；
[0060]11.采用30k MffCO透析膜透析微凝膠溶液,每天更換Mill1-Q water,連續(xù)透析一周。聚陽離子PNIPAM/PEI納米凝膠的合成線路圖如圖1A所示
[0061 ] 實(shí)施例2:祀向納米微凝膠組分的鑒定
[0062]1.冷凍干燥透析后的微凝膠(25K PEI含量為60% );
[0063]2.取適量微凝膠粉末，溶于D2O中，1H-NMR測試微凝膠組分；NIPAM含有酰胺鍵(δ，5.0-8.0)，PEI中含有胺類(δ，0.5-5.0)，從合成得到的微凝膠1H-NMR圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，既有酰胺鍵的質(zhì)子吸收峰，同時(shí)也能看到PEI的胺類質(zhì)子吸收峰，可見我們已成功將PEI與PNIPAM接枝形成納米凝膠共聚物。
[0064]實(shí)施例3:靶向納米微凝膠粒徑的測試
[0065]1.用適量Mill1-Q water稀釋透析后的微凝膠；
[0066]2.取I ml微凝膠溶液，確認(rèn)測定容器中無氣泡產(chǎn)生后，加入樣品池，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。測量條件為:170散射角，25°C。
[0067]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，隨著微凝膠載體中PEI含量的上升，從0% -70%，其粒徑逐漸降低從493±55nm下降到255.2±30nm，這是因?yàn)殡S著載體中PEI含量的增加，微凝膠交叉更加緊密，也使得微凝膠所帶的正電荷逐漸增多，有利于體系的穩(wěn)定和增加藥物的載藥量。
[0068]實(shí)施例4:祀向納米微凝膠核殼結(jié)構(gòu)的鑒定
[0069]1.經(jīng)300k MffCO透析膜透析后的微凝膠(25k PEI含量為60% )，稀釋I倍；
[0070]2.取8μ I樣品滴加到銅網(wǎng)的涂碳膜面上，通風(fēng)櫥中干燥過夜；
[0071]3.取10 μ I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% PTA到封口膜上，將銅網(wǎng)炭化面蓋到液面上面，染色5min ；
[0072]4.銅網(wǎng)炭化面向上，自然晾干，用透射電鏡觀測納米凝膠載藥體系的結(jié)構(gòu)。
[0073]從透射電鏡圖中可以看到形成的納米凝膠在銅網(wǎng)中分布均勻，呈核殼結(jié)構(gòu)的圓球顆粒狀分布，其粒徑大小在250nm左右，同粒度儀檢測得到的結(jié)果一致，表明形成的納米凝膠穩(wěn)定且分布均勻。
[0074]實(shí)施例5、靶向納米微凝膠溫度敏感性的研究
[0075]1.用適量Mill1-Q water稀釋透析后的微凝膠到適宜濃度；
[0076]2.吸取3ml (25K PEI含量為60% )微凝膠到紫外分光光度計(jì)樣品池中；
[0077]3.分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)置:
[0078]Wave length:400nmrate:0.5°C /min
[0079]SBff:2.0nmhold:1 min
[0080]Ave time:0.5sdata interval:0.2
[0081]4.攪拌變溫條