雙靶向遞送化療藥物納米體系制備方法及其增強抗腫瘤應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙靶向遞送化療藥物納米體系及其制備方法與在增強抗腫瘤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
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[0002]常規(guī)的抗癌治療著意于直接殺死腫瘤細胞，不可避免地殺死人體正常細胞和破壞免疫系統(tǒng)，從而引發(fā)嚴重的系統(tǒng)毒性。藥物的給藥方式對藥效的發(fā)揮起很大的作用，很多藥物有一個最適宜的濃度范圍，即在這個范圍可以產(chǎn)生理想的藥效，高于或低于此濃度則影響藥效的發(fā)揮，甚至產(chǎn)生毒副作用。同時，一些重大疾病治療的研究進展十分緩慢，這產(chǎn)生了綜合運用多種方案來將藥物靶向運輸?shù)郊膊〗M織的需求。于是，一些控制藥物代謝動力學、非特異性毒理學、免疫學、生物識別、藥物效能等方面的新想法應(yīng)運而生，這些新的方案，就是我們常說的的藥物運輸系統(tǒng)。
[0003]納米藥物運輸系統(tǒng)將納米技術(shù)與現(xiàn)代藥劑學結(jié)合，具有的藥物緩控、控釋性和靶向性等特點可以大幅度提高藥物的生物利用率、降低用藥量、減少毒副作用，已成為國際腫瘤藥物研制中的熱點和前沿。特定位點靶向性的藥物輸運對調(diào)節(jié)有效藥物劑量和治療疾病是很重要的，而靶向性藥物運輸系統(tǒng)具有細胞特異性，可以有效地將載有藥物的運輸系統(tǒng)運送到靶細胞，通過細胞內(nèi)吞進入細胞內(nèi)，有效的殺滅病變細胞，而不傷及其他正常細胞，因此能大幅度提高藥物生物利用率、降低藥物服用量和對其他器官的毒性。在眾多的靶向納米載體中，應(yīng)用最多的是主動靶向性納米載體，主動靶向性納米載體是指以抗體、配體或磁性為導(dǎo)向的納米載體，由于其對靶器官或靶細胞具有高度的特異性和選擇性，因此近年來得到迅速發(fā)展。
[0004]5-氟尿嘧啶是化療常用抗癌藥物之一，它進入細胞后，經(jīng)過代謝作用，轉(zhuǎn)變成5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸，從而抑制脫氧胸苷酸合成酶，進而抑制DNA的合成，最終殺死細胞。5-氟尿嘧啶抗瘤譜廣，適用于乳腺癌、胃癌、肝癌等，但體內(nèi)代謝快，有效期短，與其它化療藥物一樣，患者直接應(yīng)用5-氟尿嘧啶時，副作用較大。由于腫瘤細胞活性增強，周圍組織局部溫度高于正常組織溫度，脈管系統(tǒng)寬滲漏范圍等特點。但5-氟尿嘧啶化療時毒副反應(yīng)強，病患的化療反應(yīng)很痛苦，如何做到5-氟尿嘧啶到達腫瘤部位后能夠更快地釋放藥物，并促使腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶的內(nèi)吞，從而降低5-氟尿嘧啶的毒副作用是目前急需解決的問題。本發(fā)明采用帶有正電的PEI與溫度敏感的PNIPAM形成納米凝膠載體，通過PEI的正電荷和化療藥物5-Fu的負電荷相互作用，將5-Fu包裹進凝膠載體內(nèi)，避免了游離藥物在體內(nèi)對正常組織的毒副作用；另外，腫瘤部位較高的溫度和載體表面抗體主動靶向能夠顯著增強腫瘤細胞對載藥納米凝膠的內(nèi)吞，納米載體進入腫瘤組織和細胞后，腫瘤組織獨特的微環(huán)境作用下可以實現(xiàn)藥物在腫瘤部位有效快速的釋放，從而有效的殺死腫瘤細胞。
[0005]EGFR廣泛分布于哺乳類動物的細胞膜上，基因位于7號染色體P12-14區(qū)域，其家族包括 EGFR (ErBl/HERl)、ErbB2 (HER2/neu)、ErbB3 (HER3)、ErbB4 (HER4)等 4 個成員。隨著人類醫(yī)學科學的快速發(fā)展生物靶向治療已經(jīng)成為目前治療惡性腫瘤的重要手段，近幾年許多分子靶向表皮生長因子受體(EGFR)藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，以ABX-EGF、頂C-C225(西妥昔單抗cetuximab)、MAB528、MAB225為代表的單抗類藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床腫瘤治療，在治療中也取得良好療效。這些抗Her-1單抗隆抗體包括對胃癌(SGC7901)、人肺癌(H125)、人直腸(DiFi)、表皮細胞癌(A431)以及食管鱗癌的治療等。
[0006]中國專利申請CN201210048338.5，發(fā)明名稱為“一種納米復(fù)合溫敏凝膠劑及其制備方法和應(yīng)用”，申請公布號為CN102525882A，其實施例1公開了一種包載5-氟尿嘧啶(5-Fu)的PLGA-PLL-cRGD溫敏復(fù)合凝膠劑的制備和應(yīng)用，是采用復(fù)乳法制備:取8mgPLGA-PLL-cRGD溶于400 μ L 二氯甲烷，加入40 μ L濃度為20mg/mL的5-氟尿嘧啶(5_Fu)溶液，超聲乳化后，再加入4.4mL 2wt%的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超聲。然后室溫下攪拌3h除去有機相，即得納米?；鞈乙骸Ｉ鲜鲋频玫募{米粒粒徑控制在1-1OOOnm,在以上納米粒水分散體中加入F-127使?jié)舛葹?5%，即得復(fù)合凝膠劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種具備良好的腫瘤靶向和殺傷能力的雙靶向遞送化療藥物納米體系，本發(fā)明的另一目的是提供上述雙靶向遞送化療藥物納米體系的制備方法，本發(fā)明的第三目的在于提供上述雙靶向遞送化療藥物納米體系在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的主要技術(shù)方案是:采用自由基共沉淀的方法制備出5-氟尿嘧啶高載藥量的溫度敏感性核殼結(jié)構(gòu)微凝膠，該載體以溫度敏感性的聚異丙基丙烯酰胺為內(nèi)核，帶正電荷的聚乙烯亞胺為外殼，借助電荷間的相互吸附可以裝載并實現(xiàn)5-氟尿嘧啶的載藥量可以調(diào)節(jié)控制。微凝膠包裹5-氟尿嘧啶之后，可以延長其半衰期，促使更多的5-氟尿嘧啶到達腫瘤部位，微凝膠在受到腫瘤局部高溫刺激后，發(fā)生塌縮進而減小粒徑，促進腫瘤細內(nèi)吞5-氟尿嘧啶，并更快的釋放藥物，從而降低5-氟尿嘧啶的毒副作用。本發(fā)明還通過連接物連接抗Her-1抗體,革El向微凝膠/5-氟尿啼唆復(fù)合體具備良好的腫瘤革El向和殺傷能力。
[0009]本發(fā)明的第一方面，提供一種雙靶向遞送化療藥物納米體系，所述的藥物納米體系包括:
[0010]藥物載體，以溫度敏感性的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)為內(nèi)核，以帶正電荷的聚乙烯亞胺(PEI)為外殼；
[0011 ] 化療藥物，為5-氟尿嘧啶(5-FU)；
[0012]藥物載體通過電荷間的相互吸附裝載5-氟尿嘧啶；以實現(xiàn)5-氟尿嘧啶載藥量的可控調(diào)節(jié)；
[0013]藥物載體中的馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(mPEGs)通過mPEGs上馬來酸酐中雙鍵與巰基化抗Her-1抗體上的巰基發(fā)生加成反應(yīng)，將抗體連接到mPEGs上，同時mPEGs上的琥珀亞酰胺與載體材料中的游離氨基發(fā)生取代反應(yīng)，從而得到抗體靶向的納米載體；以實現(xiàn)靶向微凝膠載藥體系對Her-1陽性的腫瘤具備良好的靶向性。
[0014]所述的溫度敏感性的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，在32度是發(fā)生臨界相轉(zhuǎn)變行為。
[0015]所述的聚乙烯亞胺(PEI),分子量25KD,為分枝狀；
[0016]所述的納米粒徑為300nm±25nm。
[0017]優(yōu)選的，所述的溫度敏感性的聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，體積相變溫度(VPTT)約32 °C，即當溫度接近腫瘤病灶部位溫度時，溫度T大于(相轉(zhuǎn)變溫度)VPTT時，能夠明顯促進細胞對載體的內(nèi)吞。
[0018]本發(fā)明的第二方面，提供一種雙靶向遞送化療藥物納米體系的制備方法，該方法包括如下步驟:
[0019]A、陽離子納米凝膠PNIPAM/PEI的制備
[0020]先將PE1、NIPAM、N, N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中，向該PBS體系中通入N2除氧后，加入叔丁基過氧化氫(TBHP)，在80°C的油浴封閉環(huán)境下攪拌反應(yīng)2-6h ;反應(yīng)結(jié)束后，通入O2攪拌停止反應(yīng)；37°C下，15000rpm離心純化凝膠10—20min ;用去離子水(Mill1-Q water)重新溶解凝膠；用30KD的透析膜在Mill1-Q water中透析5-10天,制得陽離子納米凝膠PNIPAM/PEI。
[0021]所述的PE1、NIPAM、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)這三者的重量比例為4/6/0.1 ?6/4/0.10
[0022]B、靶向納米凝膠包裹化療藥物5-Fu的制備
[0023]步驟A制備得到的陽離子納米凝膠PNIPAM/PEI與帶有一定負電荷的化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)溶于納米凝膠溶液中，所述的納米凝膠與藥物的質(zhì)量比為1:1，1:3，1:5。根據(jù)載體載藥后藥物的釋放情況以及載體的穩(wěn)定性確定納米凝膠載體與5-Fu的質(zhì)量比為1:1?1:3之間最為合適；然后通過mPEGs將巰基化的抗體和納米凝膠載體交聯(lián)起來，巰基化抗體的質(zhì)量與載體的質(zhì)量比為1:10為佳。
[0024]所述的步驟A具體為:
[0025]先將25KD的PE1、NIPAM、N, N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中向該體