載藥tat-cs修飾碳納米管及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料、腫瘤治療領(lǐng)域，具體涉及一種基于TAT-CS修飾碳納米管的 化療聯(lián)合熱療的腫瘤殺傷方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 過去十幾年里，盡管腫瘤三大主要治療手段:手術(shù)、放療和化療的治療方法不斷進(jìn) 步，但是癌癥患者的治愈率仍然較低，并且這些傳統(tǒng)治療方法也存在著諸多問題，尤其是手 術(shù)、放化療對(duì)中晚期惡性腫瘤的療效還是很不樂觀，避免不了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并且通 常會(huì)嚴(yán)重降低患者的免疫力，形成惡性循環(huán)。因此，在對(duì)傳統(tǒng)治療方法不斷完善的同時(shí)，研 究者也在不斷尋求新的有效的治療方法或打破傳統(tǒng)單一性治療的局限而采用綜合治療措 施，如化療聯(lián)合放療，化療聯(lián)合熱療及腫瘤免疫治療等等。尤其是腫瘤中心部分的腫瘤細(xì)胞 處于缺氧狀態(tài)，對(duì)放射線不敏感，放療后不能完全被殺滅，而熱療對(duì)于這種類型的腫瘤細(xì)胞 作用卻特別強(qiáng)，可以彌補(bǔ)放療或化療的不足，聯(lián)和應(yīng)用提高療效。
[0003] 利用納米技術(shù)將藥物分子與載體材料組裝，可解決藥物的難溶性問題，提高藥物 在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)藥物靶向遞送，并可利用載體材料的光、熱、PH等敏感特性，實(shí)現(xiàn)藥 物的可控釋放，改善藥物的功效。因此，使用有效的載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物是一種可行的靶 向治療手段，而碳納米管在構(gòu)建新型腫瘤靶向治療體系方面，顯示出了極大的應(yīng)用潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種載藥TAT-CS修飾碳納米管及其 制備方法和應(yīng)用，克服現(xiàn)有技術(shù)中腫瘤治療化療藥物的使用量大，效果不理想的問題。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種載藥TAT-CS修飾碳納米管，由抗腫瘤藥物和TAT-CS修 飾多壁碳納米管組成，其中所述TAT為HIV的TAT片段，CS為殼聚糖。
[0006] -種載藥TAT-CS修飾碳納米管的制備方法，將多壁碳納米管(MffCNTs)溶解在超純 水中，超聲分散均勻后，加入抗癌藥物，質(zhì)量比抗癌藥物:碳納米管=3:1~4:1，室溫震蕩過 夜，加入TAT-CS溶液，質(zhì)量比TAT-CS:碳納米管=4:1，室溫震蕩，透析，制備TAT-CS修飾的載 藥碳納米管。
[0007] 所述TAT_CS(TAT多肽修飾殼聚糖共聚物)溶液按如下方法合成:TAT多肽具體氨基 酸序列為"N" -CYGRKKRRQRRR-"C"，在雙官能偶聯(lián)劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞 胺酯（SPDP)的作用下，將多肽上的半胱氨酸(-Cys)與低分子量殼聚糖（5000-8000)上的游 離氨基(-NH2)共價(jià)交聯(lián)。
[0008] 所述多壁碳納米管為原始多壁碳納米管、羧基化多壁碳納米管或羥基化多壁碳納 米管，多壁碳納米管的直徑<8nm，長(zhǎng)度為0.5-2μπι。
[0009] 所述抗癌藥物為阿霉素、紫杉醇、羥基喜樹堿、甲胺喋呤或鉑類抗癌藥。
[0010]所述透析采用透析袋，在PH=7.4的緩沖液中透析。
[0011] 所述超聲條件為功率60-701，處理時(shí)間20-3011^11。
[0012] -種載藥TAT-CS修飾碳納米管在化療聯(lián)合熱療的腫瘤殺傷中的應(yīng)用，化學(xué)藥物的 化療作用和碳納米管的光熱治療作用結(jié)合治療腫瘤。
[0013]將制得的載藥碳納米管局部注射于荷瘤鼠腫瘤內(nèi)，0.05-0.2mg DOX八鼠，通過 808nm激光照射腫瘤部位，功率為0 · 5-lW/cm2，照射時(shí)間為2-8分鐘。
[0014] 所述腫瘤包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌或胰腺癌。
[0015] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所采用的殼聚糖是一類具有較好水溶性、生物相容 性和生物可降解性的天然高分子多糖類化合物，其具有良好的成膜性、吸附性，透氣性和滲 透性，可以通過表面吸附作用修飾碳納米管，在有效提高碳納米管分散性的同時(shí)，還能夠降 低碳納米管在正常細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。
[0016] 本發(fā)明通過非共價(jià)修飾的方法將水溶性藥物和TAT修飾的殼聚糖吸附于多壁碳納 米管的表面，實(shí)現(xiàn)了碳納米管的修飾及藥物的負(fù)載，既避免了共價(jià)連接可能對(duì)抗腫瘤藥物 功能的影響，也防止了對(duì)碳納米管表面結(jié)構(gòu)的破壞從而影響其光致熱效應(yīng)。
[0017] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一種載藥TAT-CS修飾碳納米管的化療聯(lián)合熱療的腫瘤殺 傷的應(yīng)用，通過釋放藥物化療和碳管熱療能夠有效對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用，治療腫瘤范 圍包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等。該研究對(duì)降低化療藥物的使用及尋找更有效的 腫瘤聯(lián)合治療措施具有重要意義。
【附圖說明】
[0018] 圖1為原始多壁碳納米管和載藥碳納米管的透射電鏡圖；A為原始多壁碳納米管B 羧基化多壁碳納米管C為載DOX羧基化多壁碳納米管D為載Paclitaxel羧基化多壁碳納米 管；
[0019] 圖2為載藥碳納米管在不同PH條件下釋放的曲線圖;A為羧基化多壁碳納米管負(fù)載 阿霉素 B為羧基化多壁碳納米管負(fù)載紫杉醇；
[0020] 圖3為載DOX羧基化碳納米管對(duì)細(xì)胞相互作用后的共聚焦圖像；
[0021 ]圖4為腫瘤局部給藥后腫瘤組織經(jīng)激光照射后溫度變化圖；
[0022]圖5為腫瘤局部給藥后化療聯(lián)合熱療抗腫瘤效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 一種載藥TAT-CS修飾碳納米管，所述TAT多肽氨基酸序列為"N"-CYGRKKRRQRRR-"C"，所述CS為低分子量殼聚糖(5000-8000)，在雙官能偶聯(lián)劑3-(2_吡啶二巰基)丙酸N-羥 基琥珀酰亞胺酯(SPDP)的作用下，共價(jià)交聯(lián)為TAT-CS，所述碳納米管為原始多壁碳納米管， 純度>98%，管徑<8nm，管長(zhǎng)0.5-2μπι，將該碳納米管加入超純水中進(jìn)行超聲30min，濃度為 lmg/ml。配置阿霉素（DOX)溶液，濃度為6mg/ml，將碳納米管溶液與DOX溶液混合，質(zhì)量比 DOX:碳納米管=3:1，室溫條件震蕩過夜。加入TAT-CS溶液，室溫震蕩16h，透析袋透析過夜， 連續(xù)透析兩次，透析袋截留分子量3500。計(jì)算包封率和載藥量。
[0026] 實(shí)施例2
[0027] -種載藥TAT-CS修飾碳納米管，所述碳納米管為羧基化多壁碳納米管，純度〉 98 %，-⑶OH含量為3.86 %，管徑<8nm，管長(zhǎng)0.5-2μπι，將該碳納米管加入超純水中進(jìn)行超聲 30min，濃度為lmg/ml。配置DOX溶液，濃度為6mg/ml，將碳納米管溶液與阿霉素溶液混合，質(zhì) 量比DOX:碳納米管=3 :1，室溫條件攪拌過夜。加入TAT-CS溶液，室溫震蕩16h，透析袋透析 過夜，連續(xù)透析兩次，透析袋截留分子量3500。計(jì)算包封率和載藥量。
[0028] 實(shí)施例3
[0029] -種載藥TAT-CS修飾碳納米管，所述碳納米管為原始多壁碳納米管，純度>98%， 管徑<8nm，管長(zhǎng)0.5-2μπι，將該碳納米管加入超純水中進(jìn)行超聲30min，濃度為lmg/ml。配置 紫杉醇(Paclitaxel)溶液，濃度為6mg/ml，將碳納米管溶液與Paclitaxel溶液混合，質(zhì)量比 Pacl i taxe 1:碳納米管=4:1，室溫條件攪拌過夜。加入TAT-CS溶液，室溫震蕩16h，透析袋透 析過夜，連續(xù)透析兩次，透析袋截留分子量3500。計(jì)算包封率和載藥量。
[0030] 實(shí)施例4
[0031] -種載藥TAT-CS修飾碳納米管，所述碳納米管為羧基化多壁碳納米管，純度〉 98 %，-⑶OH含量為3.86 %，管徑<8nm，管長(zhǎng)0.5-2μπι，將該碳納米管加入超純水中進(jìn)行超聲 3〇111；[11，濃度為111^/1111。配置紫杉醇(？301；^3161)溶液，濃度為611^/1111，將碳納米管溶液與 Paclitaxel溶液混合，質(zhì)量比Paclitaxel:羧基化碳納米管=4:1，室溫條件攪拌過夜。加入 TAT-CS溶液，室溫震蕩16h，透析袋透析過夜，連續(xù)透析兩次，透析袋截留分子量3500。計(jì)算 包封率和載藥量。
[0032] 實(shí)施例5
[0033] DOX體外釋放的測(cè)定:將實(shí)施例1、2、3、4中制備的載藥碳納米管裝入截留分子量為 3500的透析袋中，將透析袋轉(zhuǎn)入PH= 5.5和Ph = 7.4的釋放介質(zhì)中，磁力攪拌器中不停攪拌， 前十二個(gè)小時(shí)每個(gè)小時(shí)取樣一次，接下來每十二個(gè)小時(shí)取樣一次，直到72小時(shí);測(cè)量各個(gè)取 樣時(shí)間的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中所含有的阿霉素的含量，繪制釋放曲線。
[0036] 實(shí)施例6
[003