一種二萜化合物在制備抑制乳腺癌的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化合物藥用領(lǐng)域，具體涉及從芫花中分離得到的一種新的二萜化合物 在制備抑制乳腺癌的藥物中的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 芫花又稱紫芫花、南芫花、頭痛花、藥魚草等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，為 傳統(tǒng)的峻下逐水藥。《本草綱目》列入毒草類，按《吳普本草》謂芫花"二月生青葉，加厚則黑， 花有紫、赤、白者，三月實(shí)落盡，葉乃生。"韓保昇《蜀本草》謂"近道處處有之，苗高二三尺。葉 似白前及柳葉，根皮黃似桑根，正月二月花發(fā)，紫碧色，葉未生時(shí)收。"結(jié)合《本草圖經(jīng)》"安徽 滁州芫花"和"四川錦州芫花"附圖看，古今藥用芫花品種一致，其原植物均為Daphne genkwa sieb.Et zucc·無疑?！吨袊?guó)藥典》2010版收載其為瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香屬 (Daphne)植物芫花(Daphne genkwa sieb et zucc)的干燥花蕾。謝宗萬曾對(duì)芫花進(jìn)行了本 草學(xué)考證，確證了歷代本草中所記載的芫花應(yīng)該為紫芫花Daphne genkwa sieb.Et zucc的 干燥花蕾。該植物為全國(guó)大多數(shù)地區(qū)臨床習(xí)用的品種，其野生主要產(chǎn)于河南、山東、江蘇、安 徽、四川等省，河南省主要分布在信陽、南陽等地的山區(qū)。
[0003] 到目前為止，從芫花的花、花蕾、葉、枝條、根中提取分離出化合物有70多種，其中 含有黃酮類成分、二萜原酸酯類成分、香豆素類成分、綠原酸類成分、木脂素類成分、酚苷類 等多種成分。
[0004] 芫花為傳統(tǒng)的峻下逐水藥，有毒，功能瀉水逐飲，解毒殺蟲，現(xiàn)代研究表明其具有 以下藥理作用:①利尿作用;②鎮(zhèn)咳祛痰作用;③殺蟲、抗寄生蟲作用;④引產(chǎn)作用;⑤抗炎、 抗腫瘤作用;⑥免疫調(diào)節(jié)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種從芫花中分離得到的一種二萜類化合物在制備抑制 乳腺癌的藥物中的新用途，以及該二萜類化合物作為有效成分制成的組合物在制備抑制乳 腺癌的藥物中的新用途。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種二萜化合物在制備抑制乳腺癌的藥物中的應(yīng)用，所述二萜化合物芫花提取物 中分離獲得，二萜化合物具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I): LziN 丄UDD乙乙O Λ _/·!·? 乙/ i X
C I )〇：
[0009]作為優(yōu)選，所述二萜化合物芫花提取物中分離包括如下步驟：
[0010] a、將干燥的芫花粉碎，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次 用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正 丁醇萃取物；
[0011] b、步驟a中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，依次用10%乙醇和75%乙醇洗脫，收 集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏；
[0012] C、步驟b中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、40:1、20:1、 10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」5個(gè)組分；
[0013] d、步驟C中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25 : 1、20:1和10:1的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；
[0014] e、步驟d中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集9-13個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0015] 作為優(yōu)選，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0016] -種藥物組合物在制備抑制乳腺癌的藥物中的應(yīng)用，藥物組合物由含有治療有效 量的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體組成。
[0017] 本發(fā)明在制備抑制乳腺癌的藥物中的應(yīng)用時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物 的形式使用。實(shí)驗(yàn)表明，上述二萜化合物（I)直接使用可顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗 腫瘤作用。具體是，二萜化合物（I)可使三種乳腺癌細(xì)胞增殖活性降低，顯著抑制其增殖，顯 示出較強(qiáng)的體外細(xì)胞毒性，具有體外抗乳腺癌效應(yīng)。以二萜化合物（I)的治療有效量為主藥 作為藥物組合物的形式使用時(shí)，可藥用載體或賦形劑可以是一種或多種選自固體、半固體 和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式 使用。即本發(fā)明化合物（I)作為藥物可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于 口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、 口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等，均具 有很好的抑制乳腺癌的作用。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019]圖2為不同劑量化合物(I)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活力的影響；
[0020]圖3為不同劑量化合物(I)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0022] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0023] 藥材和試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海 凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。芫花購(gòu)自安徽亳 州中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地福建。
[0024] 制備方法：（a)芫花(8kg)粉碎至綠豆大小，用75%乙醇熱回流提取(25LX3次），合 并提取液，濃縮至無醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯(6L X 3次)和水飽和的正 丁醇(6LX 3次)萃取，濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(315g)和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用純凈水溶解至2L，醫(yī)用脫脂棉過濾，濾液用AB-8型大孔 樹脂（I.5kg)分離，依次用10%乙醇（IOL)和75% (12L)乙醇洗脫，收集75%乙醇洗脫液，減 壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏（155g); (c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用200-300目正相 硅膠分離，依次用體積比為80:1 (10個(gè)柱體積）、40:1 (8個(gè)柱體積）、20:1 (8個(gè)柱體積）、10:1 (8個(gè)柱體積)和1:1 (5個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組 分3(36g)用200-300目正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1 (8個(gè)柱體積）、20:1 (8個(gè) 柱體積)和10:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2 (12g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠0DS-C18分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液 等度洗脫，收集9-13個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)(25mg)。
[0025] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z 401.1612,結(jié)合核磁特征可得分子式為 C20H26O7，不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρπι，DMS〇-d 6，500MHz): H-I (1 · 95，m)，H-I (2.07，m)，H-2(1.63，m)，H-2(2.86，m)，H-3(4.63，m)，H-4(1.98，br，s)，H-6(4.61，t，J= 8.9)，H-7(2.26，dd，J=14.4,8.4)，H-7(1.80，dd，J=14.4,9.6)，H-10(2.24，m)，H-11 (2.20，dd，J=14.4,8.4)，H-ll(2.33，dd，J=14.4,6.0)，H-12(5.29，dd，J = 8.4，6.0)，H-14(6.28，br，s)，H-15(7.38，br，s)，H-16(7.35，br，s)，H-17(1.21，s)，H-19(1.37，s)，H-20 (5.25,8) ;核磁共振碳譜數(shù)據(jù)5。（？？111，0130-(16，125泡）：18.2(〇1 2，1-〇,25.0(〇12,2-〇， 72.1(CH，3-C)，54.9(CH，4-C)，39.1(C，5-C)，84.6(CH，6-C)，41.8(CH2,7-C)，73.2(C，8-C)， 56.0(C，9-C)，42.7(CH，10-C)，40.0(CH2，11-C)，70.6(CH，12-C)，128.9(C，13-C)，108.2 (CH，14-C)，144.0(CH，15-C)，138.5(CH，16-C)，26.9(CH 3，17-C)，177.8(C，18-C)，29.6(CH3， 19-C)，105.8(CH，20-C);碳原子標(biāo)記參見圖I。IR光譜顯示該化合物含有羥基和內(nèi)酯基團(tuán) (3444cm- 1和1770cm-4 JMR譜數(shù)據(jù)表明該化合物含有一個(gè)典型的β-單取代呋喃環(huán)[δΗ6.28 (br，s，H-14)，7.38(br，s，H-15)4P7.35(br，s，H-16);SC128.9(C-13)，108.2(C-14)，144.0 (0-15)，和138.5((：-16)〕，一個(gè)酯羰基[6(：177.8((：-18)]，三個(gè)含氧次甲基[6072.1((：-3)， 84.6(06)，和70.6(012)]，連氧季碳[5073.2((：-8)]和兩個(gè)甲基[5!11.21(3!1，8，!13-17)和 1.37 (3H，s，H3-19)]。根據(jù)它的分子式和NMR數(shù)據(jù)，該化合物鑒定為高含氧二萜類化合物。1H - 1H COSY譜表明C-I與C-4，C-6與C-7，C-11與C-12以及C-14與C-15具有相關(guān)性。HMBC譜中， H3-19與〇4，(：-5，(：-6，和(：-10以及出-17與(：-7，(：-8和(：-9的相關(guān)性表明化合物為含有5,8-二 甲基以及3,6,8_三含氧的六元二環(huán)雙萜。HMBC譜中H-6與C-18以及H-3與C-18的相關(guān)性，表 明存在一個(gè)γ-內(nèi)酯環(huán)。此外根據(jù)HMBC譜中H-12與C-14和C-16的相關(guān)性，可推斷呋喃環(huán)位于 C-12位上。NOESY譜中Η3-19與Η-4，Η-6和H-IO相關(guān)性表明，它們均為α構(gòu)型。Η-16和Η 3-17的相 關(guān)性表明CH3-17為β構(gòu)型。此外，Η3-17與Η-20的相關(guān)性表明H-20、H-11和Η-7為β構(gòu)型。此該化 合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0026]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0027] 一、材料和儀器
[0028] DMEM/F12高糖培養(yǎng)液購(gòu)于北京Hyclone公司。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于北京 Hyclone公司。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)于天津TBD公司。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑購(gòu)于日本株式會(huì)社 同仁化學(xué)研究所。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海炎彬化工科技有限公司。Κ-? 線粒體膜電位探針購(gòu)于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。二甲基亞礬 (DMSO) 和磷酸鹽緩沖溶 液(PBS)購(gòu)于Sigma公司產(chǎn)品。
[0029] -70°C低溫冰箱(Forma Scientif iclnc.公司，美國(guó)），電子天平（島津AEL-200型， 日本），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-IC型，蘇州），恒溫振蕩器(THZ-C型，國(guó)產(chǎn)），高壓蒸汽消毒鍋 (YX-400B型，國(guó)產(chǎn)），C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱(FormaSeries Π ,ThermaleIectroncorp ·，美國(guó)），恒溫 水浴鍋（BHW2-1型，國(guó)產(chǎn)），倒置相差顯微鏡（CK40型，01ympus，日本），顯