d Retention of Matrix Structure)"，組織工程學(xué)（Tissue Engineering)， 第15卷，1-13(2009)，將其通過(guò)引用W其全文結(jié)合在此。
[0067] 在無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)形成之后，可W任選地將組織相容性活細(xì)胞接種到該無(wú)細(xì)胞組 織基質(zhì)中，W產(chǎn)生可W被宿主進(jìn)一步重塑的一種移植物。在一些實(shí)施例中，可W在移植前通 過(guò)標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，或者在移植后通過(guò)體內(nèi)再增殖而將組織相容性活細(xì)胞添加到 基質(zhì)中。通過(guò)受者的自身細(xì)胞遷移到無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)中或者通過(guò)將來(lái)自受者的細(xì)胞或來(lái)自 其他供者的組織相容性細(xì)胞注入或注射到原位無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)中而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)再生?？蒞使 用不同細(xì)胞類(lèi)型，包括胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞）、和/或神經(jīng)元細(xì)胞。在不 同的實(shí)施例中，運(yùn)些細(xì)胞可W恰好在移植之前或之后直接施用于無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)的內(nèi)部部 分。在某些實(shí)施例中，運(yùn)些細(xì)胞可W被置于有待被植入的無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)之內(nèi)并且可W在 植入之前將其培養(yǎng)。 實(shí)例1:處理組織基質(zhì)W增加柔軟性
[0068] W下實(shí)例展示了一種用渡蘿蛋白酶處理包括豬真皮無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)的材料W增 加材料的柔軟性的工藝。如W下所討論的，該處理不引起不同機(jī)械特性的不希望的變化。此 夕h該處理增加了材料的多孔性，運(yùn)可W改善細(xì)胞浸潤(rùn)和組織再生的比率。
[0069] 對(duì)于運(yùn)個(gè)實(shí)驗(yàn)，使用STRATTICE?無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)，如獲自生命細(xì)胞公司化I陽(yáng)CE化 CORPORATION)(布蘭斯堡(Brancliburg),新澤西州KSTRATTICE?可W W柔軟形式和更堅(jiān)實(shí) 版本獲得。兩種類(lèi)型都用于本實(shí)驗(yàn)。用于測(cè)試的運(yùn)些樣品被切成四等份，并且將四分之=進(jìn) 行處理。未處理的樣品（四分之一）用作對(duì)照。對(duì)照在處理期間中被冷卻。STRATTICE?被包裝 在一種溶液中，并且因此不需要再水化。將經(jīng)處理的樣品放在0.5升的、含有55g的味可美肉 松粉(MCCORMICK MEAT TEND邸IZ邸）的冷自來(lái)水中。
[0070] 圖1A-1D顯示使用本披露的方法用酶處理之后的無(wú)細(xì)胞組織基質(zhì)，W及未處理的 對(duì)照。圖2-6是每個(gè)經(jīng)處理的和對(duì)照樣品的拉伸強(qiáng)度、縫合強(qiáng)度、撕裂強(qiáng)度、彈性、W及抗蠕 變性的盒形圖。與對(duì)照相比，經(jīng)處理的樣品具有顯著增強(qiáng)的柔軟性，但是其他機(jī)械特性沒(méi)有 顯著降低。此外，發(fā)現(xiàn)熱轉(zhuǎn)變溫度或者膠原酶易感性無(wú)顯著變化。全部配對(duì)T檢驗(yàn)顯示對(duì)照 組與處理組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 實(shí)例2:處理組織基質(zhì)W調(diào)節(jié)在植入時(shí)的免疫應(yīng)答 1. 豬無(wú)細(xì)胞真皮基質(zhì)(pADM)的制備
[0071] 從屠宰場(chǎng)收集豬皮膚，表皮和皮下脂肪被物理地去除。在37°C下，將剩余的真皮組 織于含有抗生素的PBS中去污24小時(shí)。
[0072] 在去污之后，將組織在無(wú)菌條件下處理。將該皮膚組織用去污劑進(jìn)行脫細(xì)胞24小 時(shí)W去除活細(xì)胞，用鹽水洗涂，并且用DNA酶/a-半乳糖巧酶另外處理24小時(shí)。通過(guò)在PBS中 洗涂來(lái)去除細(xì)胞碎片和殘余的化學(xué)品。將所得豬無(wú)細(xì)胞真皮基質(zhì)(pADM)儲(chǔ)存在環(huán)境溫度下 直到使用。 2. 酶處理的pADM的制備
[0073] 將pADM用兩種蛋白酶(堿性蛋白酶或渡蘿蛋白酶)之一在37°C下處理過(guò)夜。在脫細(xì) 胞之前抑或DNA酶/a-半乳糖巧酶步驟之后，使用渡蘿蛋白酶WlOO單位/升的濃度來(lái)處理 pADM。在脫細(xì)胞步驟之前，使用堿性蛋白酶Wo. 003安森單位/mL的濃度來(lái)處理pADM。 3. 經(jīng)處理的樣品的差示掃描熱量法
[0074] 使用差示掃描量熱(DSC)分析來(lái)評(píng)估渡蘿蛋白酶酶處理對(duì)豬組織ECM的影響。將組 織樣品密封并且從2°〇至120°〇^3^：/111111進(jìn)行掃描。對(duì)于未處理的組織和根據(jù)實(shí)例2.2使用 酶(渡蘿蛋白酶和堿性蛋白酶)處理的組織的DSC熱譜圖示于圖7中。熱譜圖展示出在酶處理 后組織ECM中的一些改變。首先，與脫細(xì)胞的、未處理的對(duì)照組織相比，酶處理的ECM沒(méi)有顯 示在30°C與40°C之間的小峰值(約2%)。預(yù)期運(yùn)個(gè)小ECM峰值在人體溫度下自發(fā)變性并且可 W有助于由未處理的和酶處理的pADM引發(fā)的不同炎癥應(yīng)答。第二，55°CW上的兩個(gè)主要ECM 峰值平均稍微地降低了0.9°C。第S，在酶處理后，總ECM變性洽平均增加了約7.5%。 4. 體外單核細(xì)胞活化
[0075] 單核細(xì)胞是形成部分先天免疫系統(tǒng)的白血細(xì)胞。響應(yīng)于致炎因子，它們被迅速地 活化并起始一種炎癥應(yīng)答。為了預(yù)測(cè)人對(duì)酶處理的和未處理的組織的炎癥應(yīng)答，自人外周 血分離單核細(xì)胞并與組織一起解育過(guò)夜。在解育之后，將細(xì)胞洗涂并且使用針對(duì)用來(lái)監(jiān)測(cè) 活化的兩個(gè)表面標(biāo)記CD14和CD163的抗體進(jìn)行染色。
[0076] 一旦活化，單核細(xì)胞降低CD14和CD163兩者在它們表面上的表達(dá)。使用脂多糖 化PS)(-種已知的單核細(xì)胞活化劑）來(lái)證實(shí)運(yùn)種表達(dá)模式。圖8A-8B展示活化標(biāo)記CDH(A) 和CD163(B)在與不同組織共培養(yǎng)的單核細(xì)胞中的表達(dá)模式。將CD14和CD163在未誘導(dǎo)的單 核細(xì)胞(黑色）中的表達(dá)水平作為基線(xiàn)陰性對(duì)照。為了比較，將運(yùn)些標(biāo)記在未誘導(dǎo)的單核細(xì) 胞中的表達(dá)模式用作陰性對(duì)照。酶處理的pADM比未處理的pADM誘導(dǎo)低得多的活化水平，如 通過(guò)兩種標(biāo)記的表達(dá)模式所證明。事實(shí)上，在暴露于酶處理的pADM的單核細(xì)胞中，CD14表達(dá) 的模式和水平非常類(lèi)似于未誘導(dǎo)的單核細(xì)胞的那些。暴露于酶處理的PADM的單核細(xì)胞具有 CD163的略微降低表達(dá)，但程度比暴露于未處理的pADM抑或LPS的單核細(xì)胞小得多。 運(yùn)些結(jié)果表明酶處理的pADM在人單核細(xì)胞中誘導(dǎo)最小炎癥應(yīng)答。一旦單核細(xì)胞活化， CD14和CD163兩者的表達(dá)降低。運(yùn)種模式通過(guò)與一種已知的單核細(xì)胞活化劑(脂多糖(LPS)) 共培養(yǎng)的細(xì)胞被證實(shí)。與酶處理的pADM(綠色）相比，未處理的pADM(紅色）顯示更低的CD14 和CD163表達(dá)，運(yùn)表明酶處理減少了單核細(xì)胞活化。因此，酶處理的pADM在人單核細(xì)胞中引 發(fā)更少的炎癥應(yīng)答。 5. pADM和酶處理的pADM的體內(nèi)性能
[0077] 為了評(píng)估pADM和酶處理的pADM的體內(nèi)性能，將pADM和酶處理的pADM的Icm X Icm 片植入有免疫能力的大鼠的皮下組織中。在植入后的兩周和四周，將運(yùn)些組織進(jìn)行移植并 處理用于炎癥、細(xì)胞再生和血管重建的組織學(xué)評(píng)估。
[007引圖9A-F是未處理的pADM(9A-9C)和酶處理的pADM(9D-9F)在移植后的蘇木精和曙 紅化&E)切片，如于W上所描述。圖IOA-D是未處理的pADM(9A-9B)和酶處理pADM(9C-9D)外 植體的H&E切片，如W上所描述。酶處理的pADM誘導(dǎo)最小的炎癥至沒(méi)有炎癥，而未處理的 pADM誘導(dǎo)中度至高的炎癥應(yīng)答，其特征在于豐富的免疫細(xì)胞的存在。此外，與未處理的pADM 相比，酶處理的pADM外植體展現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞再生與血管重建。在未處理的pADM中，成纖維 細(xì)胞樣細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)主要存在于組織的外周上。相比之下，觀察到那些相同的細(xì)胞和血 管結(jié)構(gòu)遍及酶處理的pADM，包括組織的中間。 6. 膠原酶消化測(cè)定
[0079] 將不同等分試樣的冷凍干燥pADM和酶處理(使用渡蘿蛋白酶、膜蛋白酶和堿性蛋 白酶)的pADM稱(chēng)重，并且用膠原酶I型消化持續(xù)不同長(zhǎng)度的時(shí)間。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將一些等分 試樣的經(jīng)消化的樣品通過(guò)離屯、從膠原酶I溶液分離并用水洗涂W除去殘留的膠原酶I溶液。 將所有等分試樣再次冷凍干燥并稱(chēng)重。通過(guò)取經(jīng)消化樣品的干重與初始樣品的干重的比率 來(lái)計(jì)算在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的剩余基質(zhì)的百分比。
[0080] 酶處理不會(huì)負(fù)面地影響pADM對(duì)膠原酶消化的易感性。將pADM和酶處理的pADM兩者 通過(guò)膠原酶I型消化至相同的程度并且達(dá)相同速率。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本披露的運(yùn)些方法提供 在植入時(shí)改善的免疫學(xué)特性而不引起膠原酶易感性的降解。 實(shí)例3:具有經(jīng)控制的堿性蛋白酶活性的組織的處理 [0081 ]將豬真皮用具有從3x IO4至0.015安森單位/mL變化的活性的堿性蛋白酶在近似 中性抑水溶液中處理16小時(shí)。隨后將豬真皮脫細(xì)胞、消毒，并用電子光束滅菌W制備一種無(wú) 菌的無(wú)細(xì)胞真皮基質(zhì)。進(jìn)行不同試驗(yàn)W研究堿性蛋白酶對(duì)不同機(jī)械、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性的 影響。
[0082] 圖11是顯示針對(duì)使用實(shí)例3中描述的方法用堿性蛋白酶處理后的組織基質(zhì)連同未 處理對(duì)照的懸垂性試驗(yàn)結(jié)果的條形圖。垂懸性試驗(yàn)設(shè)及將真皮基質(zhì)的一個(gè)60mm直徑圓放置 在一個(gè)19mm直徑基座的頂部上。在其懸垂于該基座上后，真皮基質(zhì)的投影面積除W該60mm 直徑圓的原面積W確定懸垂值。注意在運(yùn)兩個(gè)面積相除之前，將基座的面積從圓盤(pán)的原面 積和覆蓋面積減去W確定懸垂性。較低的懸垂值意指更柔軟(更有懸垂性）的材料。該數(shù)據(jù) 顯示對(duì)于3x 1〇-5安森單位/mL的最低酶濃度，懸垂性顯著降低（該材料變?nèi)彳洠??？?〇-5安 森單位/mLW上，在選擇的處理時(shí)間、溫度及抑下，懸垂值增加并且似乎在1.5x !(T3安森單 位/mL W上達(dá)