專利名稱：：一種動物骨的仿生酶解產(chǎn)物及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種中藥動物骨的仿生酶解產(chǎn)物及其在治療骨折、風濕痹痛、腰膝酸軟和骨質(zhì)疏松中的應用。屬中藥領域。
背景技術：
：動物骨類作為傳統(tǒng)中藥應用，巳有悠久的歷史，臨床應用很廣泛?；⒐窃?7版中國藥典中記載強筋骨、祛風濕、止痛，用于治療關節(jié)疼痛、腰腿酸軟無力等癥，虎骨最早以藥酒劑型始見于《外臺秘要》巻15轉載南齊徐文伯方的虎骨酒，此后大多方書載有虎骨酒方，初為單用，逐步復方使用，《萬病回春》虎骨酒方已達74味，而今北京同仁堂虎骨酒方達147味。狗骨具有健脾和絡、活血生肌的功效，《名醫(yī)別錄》謂之"燒灰療下利，生肌"，主治風濕痹痛、腰腿無力、四肢麻、久痢、瘡痰、凍瘡，現(xiàn)有學者認為，狗骨還有良好的接骨作用，以狗骨為主藥制成的制劑有狗骨膠、狗骨膠藥酒、復方狗骨膠、復方狗骨膠藥酒、壯骨伸筋膠囊、駁骨丸等。豹骨具有追風定痛，強壯筋骨的功效，性微溫，味辛，治筋骨疼痛，風寒濕痹，四肢拘攣、麻木，腰膝酸楚。鹿骨具有補虛羸，強筋骨的功效，味甘，微熱，無毒，《別錄》中記載"安胎，下氣"，《千金食治》中記載"主內(nèi)虛，續(xù)絕傷，補骨，可作酒"，《唐本草》中記載"主虛勞，可為酒；主風虛，補骨髓"。牛骨甘，溫，無毒，《日華子本草》中記載"燒灰，治吐血，鼻洪，崩中，帶下，腸風，瀉血，水瀉"，'《綱目》中記載"治邪瘧"，內(nèi)服燒存性入散劑，外用燒存性調(diào)敷。另外牦牛骨、豬骨、猴骨、羊骨、貓骨、雞骨等其他動物的骨也多見有報道用于一些疾病的治療。動物骨類藥物的應用現(xiàn)多為醋制后入藥或泡酒后服用,在入藥的方式上比較傳統(tǒng)，由于動物骨質(zhì)地堅硬，水提時有效成分不易完全提取出來，藥材利用率較低，有效成分沒有獲得充分利用。經(jīng)現(xiàn)代較為系統(tǒng)的與臨床功效相關的生物活性和物質(zhì)基礎評價研究，動物骨中的水溶性蛋白及肽類、游離的氨基酸成分的療效越來越受到關注。人體經(jīng)口服動物骨后，經(jīng)胃蛋白酶及胰酶的酶解、消化，以小分子肽類成分吸收入血發(fā)揮療效，小分子的寡肽類物質(zhì)和氨基酸很容易被小腸吸收，而大分子的蛋白類在小腸里也很難被吸收。傳統(tǒng)的原粉直接服用，原藥粉中大分子蛋白，只有少量在體內(nèi)經(jīng)過胃腸道的分解，變成小分子的寡肽而被吸收，由于藥材粉碎的細度、胃腸道pH的變化及口服其他食物的干擾造成水解的不完全，有效成分被吸收利用的少，造成大量藥材的浪費療效大大降低。水提的提取工藝使得有大部分不溶入水的蛋白被濾過除去，造成大量的藥材浪費，療效同樣大大降低。3應用酶解法水解動物骨蛋白，獲得具有一定生理活性的生物活性肽越來越受到人們的關注。由于不同的酶作用的部位不一樣，酶解法得到的產(chǎn)物也不一樣，用單一的胃蛋白酶或胰酶來酶解，只能使藥材中的蛋白部分酶解，藥材中的蛋白得不到最大程度的利用，這樣就迫切的需要一種仿生的酶解方法——在動物或人體生物進化過程中己被證實、療效確切、模擬人體的消化過程的仿生酶解方法，將動物骨酶解后得到的有效成分更容易吸收，更加安全的利用，同時更加充分利用原藥材。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的在于提供一種更有效的，安全的動物骨仿生酶解產(chǎn)物；本發(fā)明的第二目的是提供該提取物在制備治療骨折、風濕痹痛、腰膝酸軟、骨質(zhì)疏松的藥物中的應用。發(fā)明人提供一種動物骨的酶解產(chǎn)物，該產(chǎn)物采用仿生酶解的方法制備取動物骨，粉碎成細粉，加水，調(diào)節(jié)pH至1.03.0，加入胃蛋白酶于3545。C保溫酶解0.54.O小時，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入胰酶或胰蛋白酶于405(TC保溫酶解28小時，即得。進一步優(yōu)化為取動物骨，粉碎成細粉，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至1.52.5，加入動物骨量的0.5%5%的胃蛋白酶于3545'C保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入動物骨量的O.5%~5%的胰酶或胰蛋白酶于4050'C保溫酶解36小時，即得。較優(yōu)的制備方法為-取動物骨，粉碎成細粉，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入動物骨量的1%2%的胃蛋白酶于401:保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至8.0，加入動物骨量的1%2%的胰酶或胰蛋白酶于50'C保溫酶解36小時，即得。發(fā)明人經(jīng)過試驗篩選，動物骨藥材細粉加水勻漿后，可預先加熱至8010(TC，保溫15~30分鐘，再降溫至酶解所需溫度，按以上操作酶解，其效果更佳。按本發(fā)明技術方案進行酶解，當胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白轉化力不低于25.0時，效果較為充分；酶活力越高，酶解速度越快、效果越好。經(jīng)現(xiàn)代研究證明，動物骨中的肽類成分也是有效部位。人體經(jīng)口服動物骨后，經(jīng)胃蛋白酶及胰酶或胰蛋白酶的酶解、消化，以小分子肽類成分吸收而發(fā)揮療效。發(fā)明人根據(jù)人體口服動物骨等動物藥的過程，創(chuàng)造性的在體外采用人體仿生酶解的方法，先后對原料進行胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶酶解，和人體直接口服藥材原粉比較，所得被小腸吸收消化的有效物質(zhì)群相同，但體外酶解選擇較優(yōu)的試驗條件，酶解的更充分，再口服所得的藥效更強，酶解成寡肽或小分子的活性部位群經(jīng)注射或粘膜、皮膚等途徑給藥時更容易被吸收，免疫原性更低，更有效。經(jīng)過試驗篩選，單獨以胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解動物骨，效果均優(yōu)于直接口服，但都低于本發(fā)明的仿生酶解方法，本發(fā)明方法在很大程度上增強了動物骨等動物藥的療效，而且由于以小分子寡肽的形式入藥，口服給藥是吸收更充分，發(fā)揮療效迅速，增強療效，值得推廣應用。本領域技術人員可以方便地將本發(fā)明酶解產(chǎn)物配合適當?shù)妮o料，制備成各種常規(guī)制劑，如a、將酶解液濾過直接噴霧干燥，加入適量的常規(guī)輔料如淀粉、乳糖、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉等制成膠囊劑或片劑。b、將酶解液濾過濃縮成稠膏，加入適量的糖粉和糊精制成顆粒劑。本發(fā)明提供的動物骨酶解產(chǎn)物可以單獨使用，也可以與其他藥物成分聯(lián)合使用，即在藥物活性成分中，可以只有該產(chǎn)物，還可以是其與其他藥物的混合物，達到配合治療、輔助治療的目的。本發(fā)明中所用的原料除動物骨外，還可以是動物的皮、腱、韌帶及角膜。本發(fā)明動物骨酶解產(chǎn)物可以用于骨折、骨質(zhì)疏松、腰膝酸軟、軟骨損傷、風濕痹痛、骨關節(jié)炎等骨科疾病的治療。有益效果為進一步驗證本發(fā)明產(chǎn)物的治療作用，發(fā)明人進行了"促進骨折愈合的實驗研究"，實驗中的"仿生酶解組"即為按本發(fā)明技術方案制得的相應的動物骨酶解產(chǎn)物1、材料1.1動物家兔，購自山東大學動物實驗中心。1.2試劑胃蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20070914;胰蛋白酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071228;胰酶，購自國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071130。1.3供試樣品的制備未酶解組取狗骨藥材細粉(S0目)50g,加入10倍量生理鹽水，勻漿30分鐘，攪勻，取l/5量，濾過，即得；胃蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入狗骨藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0,溫度為4(TC土2。C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，濾過，即得；胰蛋白酶酶解組取l/5勻漿液，加入狗骨藥材量的P/。胰蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為50'C土2'C，保溫同時攪拌酶解4h，85'C保溫20min，放冷，濾過，即得；5胰酶酶解組取l/5勻漿液，加入狗骨藥材量的1%胰酶，同時調(diào)節(jié)pH至8.0,溫度為50'C±2°C,保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，濾過，即得；仿生酶解組取l/5勻漿液，加入狗骨藥材量的1%胃蛋白酶，同時調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為40°C±2°C，保溫同時攪拌酶解4h，然后調(diào)pH至8.0，加入狗骨藥材量的1%胰蛋白酶，溫度為50°C±2°C，保溫同時攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，濾過，即得空白對照組即生理鹽水組。2、方法與結果2.1試驗方法3%戊巴比妥麻醉(30mg/kg/iv),用兩條線鋸并攏，將左橈骨中段鋸斷，造成2mm缺損，骨折位于旋前園肌肌止點的遠端，不做任何外固定。術后當日隨機分空白組、未酶解組、胃蛋白酶酶解組、胰蛋白酶酶解組、胰酶酶解組、仿生酶解組，每組10只，即開始給藥(1.0g/kg)。家兔分別于術后l、2、3、4W在相同條件下拍傷肢X線平片，以觀察骨痂出現(xiàn)的時間和數(shù)量，用"-"表示無骨痂形成；"+"表示骨折邊緣趨向模糊，有少量骨痂出現(xiàn)；"++"表示骨折邊緣明顯模糊，有中等量的骨痂出現(xiàn)；"+++"表示骨折邊緣接近消失，有較多的骨痂出現(xiàn)；"++++"表示骨折邊緣基本消失，兩骨折端己完全連接，有大量密度高的骨痂，密度接近正常骨。2.2試驗結果表l給藥l周對骨痂形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2給藥2周對骨痂形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3給藥3周對骨痂形成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>取牛骨500g，粉碎成細粉，加15倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.5，加入牛骨量的5%的胃蛋白酶于40'C保溫酶解2.5小時，調(diào)節(jié)pH至8.5，加入牛骨量的5%的胰蛋白酶于45t:保溫酶解5小時，噴霧干燥，加入適量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填裝膠囊。實施例5取虎骨500g，粉碎成細粉，加10倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.5，加入虎骨量的2%的胃蛋白酶于37'C保溫酶解3小時，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入虎骨量的2%的胰蛋白酶于40°〇保溫酶解6小時，噴霧干燥，加入適量的微晶纖維素，制粒，干燥，整粒，壓制成片。實施例6取狗骨300g、三七150g、紅花50g，狗骨粉碎成細粉，加10倍量水勻漿，調(diào)節(jié)pH至3.0，加入狗骨量的2X的胃蛋白酶于37X:保溫酶解3.5小時，調(diào)節(jié)pH至8.0,加入狗骨量的2%的胰蛋白酶于40'C保溫酶解6小時，噴霧干燥，得干粉；三七、紅花加水提取兩次，第一次加水IO倍量，第二次加水8倍量，每次1小時，合并水提液濃縮至藥材:藥液=1:2，加乙醇至乙醇含量至60%，乙醇液回收乙醇并濃縮至相對密度約1.5(60°C)，加入狗骨仿生酶解液噴干粉，加入適量的微晶纖維素，制粒，干燥，整粒，壓制成片。實施例7取實施例l所制顆粒治療風濕痹痛患者85例。本組85例，其中男38例，女47例；年齡1776歲；病程1年以下者21例，15年者37例，5年以上者27例；中醫(yī)辨證分類:行痹26例，痛痹39例，著痹20例。診斷依據(jù)參照國家中醫(yī)藥管理局1994年發(fā)布的《中醫(yī)病證診斷療效標準》中風濕痹證的診斷依據(jù)擬定。(l)以四肢關節(jié)走竄疼痛為主，伴重著、酸楚、麻木、關節(jié)屈伸不利；(2)實驗室檢查:血沉增快，抗鏈球菌溶血素"0">500u。證候分類(l)行痹(風邪偏勝)肢體關節(jié)肌肉疼痛，游走不定，屈伸不利，舌苔薄白，脈浮；(2)痛痹(寒邪偏勝)肢體關節(jié)疼痛較劇，遇寒加重，得熱痛減，晝輕夜重，關節(jié)屈伸不利，痛處不紅，觸之不熱，舌苔白滑，脈弦緊；(3)著痹(濕邪偏勝)肢體關節(jié)重著酸痛，痛處固定，下肢為甚，或有腫脹，肌膚麻木，天氣變化或陰雨時加重，舌苔白膩，脈濡緩。治療方法(l)口服給藥，每天服用量相當于15g原藥材量；(2)指導患者進行適當功能鍛煉；(3)適宜配合理療方法，縮短療程,提高療效。30天為1療程，治療2療程進行療效評定。療效標準參照《中醫(yī)病證診斷療效標準》中的有關標準擬定。臨床治愈:關節(jié)疼痛、腫脹消失，活動功能恢復正常，實驗室檢査結果正常；好轉:關節(jié)疼痛、腫脹減輕，活動功能好轉，實驗室檢査結果有所改善，未愈:關節(jié)疼痛、腫脹及實驗室8檢查結果均無改善。治療結果本組85例中，臨床治愈32例(37.64%)，好轉49例(57.66%)，未愈4例(4.7%)，總有效率為95.3%。實施例8取實施例3所制顆粒治療骨質(zhì)疏松癥的臨床觀察。共觀察治療60例，隨機分為治療組37例，其中男11例，女26例；年齡52歲82歲，平均64.7歲；5例發(fā)生腰椎壓縮性骨折，CT示椎管完整無神經(jīng)壓迫癥狀，3例有腰椎椎體壓縮性病變，2例發(fā)生股骨粗隆間骨折；對照組23例，其中男7例，女16例；年齡48歲80歲，平均63.2歲；7例有腰椎側彎或(和)椎體壓縮改變，l例椎體壓縮性骨折，CT檢査示椎管未受壓，2例橈骨遠端骨折。按照1999年10月通過的中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標準:全身、腰椎或股骨頸任一處骨密度(BMD)低于正常同性別峰值骨量2.OSD為骨質(zhì)疏松。納入標準患者36個月內(nèi)未采用性激素和相關藥物治療，臨床確診為骨質(zhì)疏松癥。排除標準肝腎功能嚴重損害者；內(nèi)分泌代謝疾病，包括糖尿病、甲狀腺功能亢進、類風濕性關節(jié)炎等。治療方法治療組實施例3所制顆粒，口服給藥，每日服用量相當于10g原藥材。對照組:采用骨合注射液(南京新百藥業(yè)有限公司，5ml/支)lOml靜脈滴注，每日l次；兩組均治療3個月為l個療程。觀察指標測量骨礦含量(BMD),測定腰椎24、股骨大轉子的BMD，以g/cr^表示。結果如表5所示表5兩組治療前后BMD比較組別例數(shù)BMD(g/cm2，S±s)治療前治療后治療組370.640±0.0440.726±0.086一對照組230.649±0.030.661±0.05與本組治療前比較，**P〈0.05;與對照組治療后比較，AAP〈0.05。結果顯示，治療組經(jīng)治療后骨礦含量發(fā)生明顯增長。9權利要求1、一種動物骨的仿生酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取動物骨，粉碎成細粉，加水，調(diào)節(jié)pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保溫酶解0.5～4.0小時，再調(diào)節(jié)pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保溫酶解2～8小時，即得。2、根據(jù)權利要求1所述的動物骨酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取動物骨，粉碎成細粉，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至1.52.5，加入動物骨量的0.5%5.0^的胃蛋白酶于3545'C保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入動物骨量的0.5%5.0%的胰酶或胰蛋白酶于405(TC保溫酶解36小時，即得。3、根據(jù)權利要求2所述的動物骨酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取動物骨，粉碎成細粉，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入動物骨量的]%2%的胃蛋白酶于4(TC保溫酶解13小時，再調(diào)節(jié)pH至8.0，加入動物骨量的1%2%的胰酶或胰蛋白酶于5(TC保溫酶解36小時，即得。4、根據(jù)權利要求1至3中任一所述的動物骨酶解產(chǎn)物，其特征在于將動物骨粉碎成細粉加水勻漿后先加熱至8010CTC并保溫1530分鐘，再降溫至所需溫度進行酶解。5、根據(jù)權利要求1至3中任一所述的動物骨酶解產(chǎn)物，其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/nig，胰酶的酪蛋白轉化力不低于25.0。6、根據(jù)權利要求l至5中任一所述的動物骨酶解產(chǎn)物中的動物骨可以是狗骨、虎骨、豹骨、鹿骨、猴骨、牛骨、豬骨、羊骨、牦牛骨、貓骨、雞骨、鼠骨。7、根據(jù)權利要求1至5中任一所述的動物骨酶解產(chǎn)物，其特征在于加入常規(guī)藥用輔料制成口服制劑。8、權利要求1至5中任一所述的動物骨酶解產(chǎn)物在制備用于治療骨折的藥物中的應用。9、權利要求1至5中任一所述的動物骨酶解產(chǎn)物在制備用于治療風濕痹痛、腰膝酸軟的藥物中的應用。10、權利要求1至5中任一所述的動物骨酶解產(chǎn)物在制備用于治療骨質(zhì)疏松的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種動物骨的酶解產(chǎn)物及其用途，屬中藥領域，其特征是采用仿生酶解的方法，取動物骨，粉碎成細粉，加水勻漿后，在適當?shù)臈l件下，先以胃蛋白酶保溫酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保溫酶解，所得的酶解物按不同的制劑要求制成制劑。本發(fā)明產(chǎn)物在治療骨折、風濕痹痛、腰膝酸軟、骨質(zhì)疏松方面具有良好的效果。文檔編號A61K35/32GK101647815SQ20081011816公開日2010年2月17日申請日期2008年8月13日優(yōu)先權日2008年8月13日發(fā)明者劉國飛,周小明申請人:北京凱瑞創(chuàng)新醫(yī)藥科技有限公司