注射10%CCL4油溶劑（0.Iml/lOg)，禁食，自由飲水。24h后采血，分離 血清，測(cè)定ALT、AST。然后脫脊椎處死小鼠，打開(kāi)腹腔取出肝臟，稱重，取0. 5g肝臟加9倍 冰生理鹽水，組織勻漿，制成10%的肝臟勻漿液，低溫離屯、35(K)r/min，離屯、15分鐘，收集 上清液，測(cè)定SOD及MDA的含量。取部分肝臟右葉，置10%中性甲醒溶液中，常規(guī)脫水，石蠟 包埋，切片，作肥染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。
[0033] 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)CCL4造成的急性肝損傷小鼠模型，肝臟指數(shù)較正常組顯著增高 (P<0. 05)，說(shuō)明肝臟受到損傷。與模型組比較，環(huán)黃巧醇（CAG)低、高劑量組肝臟指數(shù)明顯 降低（P<0. 05)，說(shuō)明一定劑量的環(huán)黃巧醇對(duì)小鼠肝臟具有保護(hù)作用。肝臟指數(shù)=[肝臟重 量（g)/體重（g)]X100計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)CCL4造成的急性肝損傷小鼠模型，環(huán)黃巧醇 低、高劑量均能降低血清中ALT、AST的活性（P<0. 05)(表1)，升高肝組織中SOD含量，降低 MDA表達(dá)；表明CAG對(duì)CCL4引起的急性肝損傷有一定的保護(hù)作用（表2)。
[0034] 表1CAG對(duì)急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性的影響反±5)
[0036]n= 10, *p<0. 05,與空白對(duì)照組比較；郵<0. 05,與模型組比較
[0037] 表2 CAG對(duì)急性肝損傷小鼠組織中SOD活性和MDA含量的影響±.s)
[0039]n= 10, *p<0. 05,與空白對(duì)照組比較；郵<0. 05,與模型組比較
[0040] 病理組織切片（圖4)分析發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠的肝臟切片在光鏡下觀察無(wú)異常 變化，肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰。模型組肝細(xì)胞明顯腫脹，氣球樣變，肝細(xì)胞排列素亂，并 發(fā)生解離，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。與模型組相比較，環(huán)黃巧醇低、高劑量組肝細(xì)胞排列相對(duì)整 齊，結(jié)構(gòu)較為清晰，水腫、壞死及氣球樣變明顯較輕。可見(jiàn)，環(huán)黃巧醇對(duì)四氧化碳所造成的肝 細(xì)胞的損傷具有較好的改善和保護(hù)作用。
[0041] 實(shí)施例4 :環(huán)黃巧醇對(duì)藥物性肝損傷的保護(hù)作用
[0042] 48只昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分為4組，分別為正常組、環(huán)黃巧醇（CAG)、撲熱息痛 組、CAG高劑量+撲熱息痛組、CAG低劑量+撲熱息痛組，每組各12只。CAG低、高劑量組連 續(xù)灌胃10天，均1次/天，空白組和模型組給予相同體積的生理鹽水。末次給藥2.化后， 禁食，自由飲水，除正常組外，其余S組均腹腔注射撲熱息痛溶液180mg/Kg，正常組注射同 體積的0.9%生理鹽水。24h后采血，分離血清，測(cè)定ALT、AST。然后脫脊椎處死小鼠，打 開(kāi)腹腔取出肝臟，稱重，取0. 5g肝臟加9倍冰生理鹽水，組織勻漿，制成10 %的肝臟勻漿液， 低溫離屯、3500r/min，離屯、15分鐘，收集上清液，測(cè)定SOD及MDA的含量。
[0043] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與正常組比較P< 0. 05,說(shuō)明用撲熱息痛造成藥物性肝損 傷模型成果。與模型組比較，環(huán)黃巧醇給藥組均能顯著降低撲熱息痛造成所致藥物性肝損 傷小鼠血清AST、ALT含量，升高肝組織中SOD含量，降低MDA含量（P<0.05);說(shuō)明環(huán)黃巧 醇對(duì)藥物性肝損傷的小鼠肝臟具有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表3。
[0044] 表3CAG對(duì)藥物性肝損傷小鼠血清和肝臟中ALT、AST活性的影響(I' ±.v)
[0046]n= 12, *p<0. 05,與空白對(duì)照組比較；郵<0. 05,與模型組比較
[0047] 實(shí)施例5 :環(huán)黃巧醇對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用
[0048]SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為4組，每組12只，雌雄各半，分別為正常組、 模型組、環(huán)黃巧醇（CAG)低劑量（350mg/Kg)組、高劑量（700mg/Kg)組。給藥方式為正常組 灌胃給予生理鹽水1血/lOOg,其余各組按1血/100g灌胃給予55°白酒，基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，連 續(xù)20d。第21天開(kāi)始，正常組灌胃給予生理鹽水1血/lOOg,其余各組上午按1血/100g灌 胃給予55°白酒，CAG低劑量和高劑量組下午分別按350mg/Kg、700mg/Kg灌胃給予環(huán)黃巧 醇，模型組下午灌胃給予同體積的生理鹽水，基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，連續(xù)lOd。末次給藥后禁食不 禁水12h，眼眶取血，350化/min離屯、lOmin，分離血清，巧憶各大鼠血清AST、ALT的含量。 處死大鼠，迅速取出肝臟，用生理鹽水洗凈血潰，濾紙吸干，稱取適量肝臟，按比例（肝臟重 量g:生理鹽水體積血=1:9)加入生理鹽水冰水浴條件下機(jī)械勻漿制成10%肝臟勻漿液； 35(K)r/min，離屯、lOmin，取上清液，測(cè)定肝臟組織中MDA、SOD的含量。
[0049] 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，環(huán)黃巧醇給藥組均能顯著降低白酒所致酒精性肝損傷 大鼠血清AST、ALT含量，升高肝組織中SOD含量，降低MDA含量（p< 0.05);說(shuō)明環(huán)黃巧醇 對(duì)酒精性肝損傷的大鼠肝臟具有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表4。
[0050] 表4CAG對(duì)酒精性性肝損傷小鼠血清和肝臟中ALT、AST活性的影響反±s)
[005引n= 12, *p<0. 05,與空白對(duì)照組比較；郵<0. 05,與模型組比較 [005引實(shí)施例6 :環(huán)黃巧醇對(duì)慢性肝纖維化的治療作用
[0054] C57小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分組，除正常組小鼠外，其余各組每周兩次給予 腹腔注射10 %CCL4造模（20y1/lOg)，正常對(duì)照組C57小鼠腹腔注射橄攬油。每次腹腔注 射前均測(cè)量小鼠體重，根據(jù)體重注射相應(yīng)劑量的10%CCL4,并作詳細(xì)記錄。造模2周后，于 繼續(xù)造模的同時(shí)，正常對(duì)照組、模型組每天生理鹽水灌胃（200y1/只），CAG低、高劑量藥物 組分別用50、lOOmg/kg/d的給藥量配成0. 5%簇甲基纖維素鋼混懸液灌胃。連續(xù)用藥治療 6周。各組小鼠灌胃期間每天觀察精神活動(dòng)、毛色、飲食、體重等一般狀態(tài)；末次給藥后禁食 不禁水12h，稱重，采用摘眼球取血，35(K)r/min離屯、，取血清按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中谷 丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)活性；取血后頸椎脫白處死小鼠，迅速取出肝臟稱重 (計(jì)算肝指數(shù)=肝重/體重X100% )，用生理鹽水洗凈血潰，濾紙吸干，稱取適量肝臟，按比 例（肝臟重量g:生理鹽水體積血=1:9)加入生理鹽水冰水浴條件下機(jī)械勻漿制成10% 肝臟勻漿液；35(K)r/min，離屯、lOmin，取上清液，測(cè)定肝臟組織中超氧化物歧化物（SOD)活 力、及徑脯氨酸（Hyp)和丙二醒（MDA)的含量；取肝右葉用10%甲醒固定，石蠟包埋切片， 進(jìn)行肥染色，觀察其病理變化。
[005引實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CAG明顯降低了（XL4所致肝纖維化小鼠體內(nèi)的ALT、AST水平（P<0. 05) (見(jiàn)表5)，同時(shí)降低小鼠血清中MDA、Hyp的含量，升高SOD的活性（P<0. 05)，如表6所示。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CAG對(duì)CCL4所致的肝功能損傷有一定的改善和保護(hù)作用。
[0056] 表5CAG對(duì)CCL4致肝纖維化小鼠的影響（；±5'）
[0057]
[005引*p<0. 05,與正常組比較；郵<0. 05,與模型組比較
[0059]表6 CAG對(duì)小鼠組織中SOD、MDA和Hyp活性的影響（；+ ?)
[0061] *p<0. 05,與正常組比較；郵<0. 05,與模型組比較
[0062] 病理組織切片（圖5)分析發(fā)現(xiàn)，肥染色可見(jiàn)正常組肝小葉與肝細(xì)胞排列整齊，結(jié) 構(gòu)完整；模型組肝細(xì)胞腫大變圓，匯管區(qū)及小葉問(wèn)纖維組織增生；而環(huán)黃巧醇CAG低、高劑 量組肝細(xì)胞排列相對(duì)整齊，水腫、壞死程度明顯較輕，結(jié)構(gòu)較為清晰，纖維間隔纖細(xì)不連續(xù)。 免疫組化的結(jié)果表明CAG抑制了肝組織中a-SMA和膠原的產(chǎn)生，提示其對(duì)慢性肝纖維化病 變有一定的保護(hù)作用。
[006引實(shí)施例7:環(huán)黃巧醇注射液的制備
[0064] 獨(dú)方：環(huán)黃茂醇 1.;晦 玄醇 120ml TweenSO 自爲(wèi) 注射用水 補(bǔ)足至溶液為500m1
[0065] 制備方法：稱取環(huán)黃巧醇1.Og,于40°C溶解在60ml乙醇中，加入6.Og的Tween 80,攬拌使其充分溶解，其次，加入注射水至250ml，加入4.Og活性炭，充分?jǐn)埌?0min，過(guò)濾 至濾液澄清度合格，并測(cè)得濾液pH為6. 0 ;量取60ml乙醇，邊攬拌邊加入注射用水至250ml 作為稀釋液備用；補(bǔ)加稀釋液使環(huán)黃巧醇濃度為2.Omg/ml;分別用0. 45ym的微孔濾膜和 0. 22ym的微孔濾膜過(guò)濾，灌封至2ml安飯瓶中，經(jīng)120°C熱壓滅菌30min，冷卻，即得環(huán)黃巧 醇注射液。
[0066] 實(shí)施例8 :環(huán)黃巧醇片劑的制備
[0067]將環(huán)黃巧醇乳糖淀粉分別過(guò)80目篩，混勻，加適量淀粉漿制軟材，于20目篩下制 粒，置于80°C烘箱中干燥，于14目篩下整粒，加徑甲淀粉鋼和硬脂酸儀充分混勻后壓片，其 中輔料配比為淀粉：乳糖：徑甲淀粉鋼：硬脂酸儀（3:8:0. 6:0. 4)，制成片重為300mg/片， 環(huán)黃巧醇的含量為IOOmg/片的片劑。
[0068] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 環(huán)黃芪醇用于制備保肝藥物或護(hù)肝藥物或促進(jìn)肝損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。2. 環(huán)黃芪醇用于制備藥物性肝損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。3. 環(huán)黃芪醇用于制備促進(jìn)酒精性肝損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。4. 環(huán)黃芪醇用于制備促進(jìn)缺血再灌注肝損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。5. 環(huán)黃芪醇用于制備促進(jìn)膽汁淤積性肝損傷修復(fù)藥物的應(yīng)用。6. 環(huán)黃芪醇用于制備治療各種化學(xué)性肝損傷藥物的應(yīng)用。7. 環(huán)黃芪醇用于制備治療慢性肝纖維化的藥物的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述環(huán)黃芪醇用于制備治療四氯化碳所 致急性肝損傷藥物的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任意權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于：所述藥物為固體制劑或 溶液劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述固體制劑為膠囊劑、片劑或顆粒劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了環(huán)黃芪醇用于制備保肝藥物或護(hù)肝藥物或治療肝損傷藥物的應(yīng)用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明環(huán)黃芪醇具有保肝，護(hù)肝，以及促進(jìn)肝損傷修復(fù)的作用，故本發(fā)明具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61P1/16, A61K31/58
【公開(kāi)號(hào)】CN105343109
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510817156
【發(fā)明人】顧正兵
【申請(qǐng)人】泰州永恒生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日