Peg原位共價接枝的海藻酸鹽微膠囊及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及了一種海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊產(chǎn)品，具體地說是一種新型PEG原 位共價接枝改性海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊。
【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)60年代，Chang報道了半透膜微膠囊，指出用其包埋蛋白質(zhì)、酶等生 物活性物質(zhì)和細胞，可保持生物物質(zhì)活性[ChangTMS.SemipermeabIemicrocapsules,Sc ience，1964, 146:524-525]。20世紀(jì)80年代初，Lim和Sun針對組織/細胞功能缺損性疾 病（如糖尿?。?，成功制備了海藻酸鈉/a-聚賴氨酸（alginate/a-polylysine)半透膜 微膠囊（簡稱ct-APA微膠囊），包封Wistar大鼠胰島細胞并移植入糖尿病WistarLewis 大鼠體內(nèi)，分泌釋放胰島素以調(diào)控血糖量[LimF,SunAM.Microencapsulatedislets bioartificialendocrinepancreas,Science, 1980,210:908-910]。由此推動了 微囊化 技術(shù)相關(guān)材料和制備方法研究的快速發(fā)展，在細胞移植、藥物釋放和基因治療等生物醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域的臨床前研究中得到廣泛應(yīng)用[WangW,LiuXD,MaXJ,etal.Microencapsulation usingnaturalpolysaccharidesfordrugdeliveryandcellimplantation,J.Mater. Chem.，2006, 16:3252-3267]。隨后，取自天然的多糖材料--殼聚糖由于成本低，成膜性能 好，膜機械強度高，而被研究者看好用于聚賴氨酸替代品，越來越多的用于細胞包埋用微膠 囊的制備[L.Baruch,M.Machluf,Alginate-chitosancomplexcoacervationforcellenc apsulation:Effectonmechanicalpropertiesandonlong-termviability,Biopolymer s82 (2006) :570-579]。但現(xiàn)有用于細胞包埋的海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊因其具有很大的 表面粗糙度和表面電荷，導(dǎo)致移植體內(nèi)后易引起蛋白吸附，進一步激發(fā)機體纖維化反應(yīng)，致 使移植體功能喪失。PEG(聚乙二醇英文名polyethyleneglycol的簡稱）由于具有良好的 親水性、鏈段柔韌性、穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物材料的抗蛋白修飾領(lǐng)域。 目前通常采用的靜電吸附、摻雜共混的方法實現(xiàn)PEG修飾微膠囊卻存在穩(wěn)定性差、排阻體 積小、無法形成PEG刷狀結(jié)構(gòu)等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述問題，本發(fā)明提出將PEG用于生物微膠囊的制備，發(fā)明了一種新型PEG原 位共價接枝的海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊產(chǎn)品，能夠在保證微膠囊強度和免疫隔離性能的 前提下，利用點擊化學(xué)的方法將高密度梳狀結(jié)構(gòu)的PEG通過共價鍵接枝到海藻酸鹽-聚陽 離子微膠囊表面，從而起到抗蛋白吸附的效果，解決微膠囊體內(nèi)移植后蛋白吸附及纖維化 問題。
[0004] 技術(shù)方案
[0005] 本發(fā)明的一種新型PEG原位接枝改性海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊，其特征在于：微 膠囊內(nèi)為含有活細胞的經(jīng)疊氮化物接枝改性的海藻酸鹽的液體或水凝膠環(huán)境；微膠囊表面 是由PEG原位共價接枝改性，表面海藻酸鹽與PEG的質(zhì)量比為10:1-1:100 ;微膠囊表面也 可以通過聚陽離子和海藻酸鹽形成的聚電解質(zhì)復(fù)合水凝膠膜后，再由PEG原位共價接枝改 性，表面海藻酸鹽：聚陽離子：PEG的質(zhì)量比為：10:1:1-1:10:100。
[0006] 其中，修飾后微膠囊產(chǎn)品為粒徑100-1000微米的球形微膠囊；修飾后微膠 囊膜厚度在1-100微米；海藻酸鹽接枝疊氮化物的分子量為IOkDa- 2000kDa(例 如：50kDa-200kDa;200kDa-500kDa;600kDa-1000kDa;1000kDa-2000kDa);海藻酸鹽 接枝疊氮化物的接枝率為0.01 % -99.99 %。微膠囊膜中聚陽離子材料包括：殼聚 糖，其脫乙酰度為 80-98 %，分子量為lkDa-800kDa(例如：lkDa-5kDa; 10kDa-20kDa; 50kDa-100kDa;100kDa-800kDa) ;a-聚賴氨酸，分子量為 2kDa-500kDa(例如： 2kDa-10kDa;70kDa-150kDa;150kDa-300kDa;300kDa-500kDa) ;e-聚賴氨酸，分子量為 21^&-5001^^(例如：21^^-501^^ ;501^^-1001^^;1001^^-3501^^;3501^^-5001^^) ;聚 精氨酸，分子量為IkDa-500kDa(例如：lkDa-100kDa;100kDa-350kDa;350kDa-500kDa); 聚鳥氨酸，分子量為lkDa-500kDa(例如：lkDa-50kDa;50kDa-100kDa; 100kDa-350kDa; 350kDa-500kDa);聚組氨酸，分子量為lkDa-500kDa(例如：lkDa-50kDa;50kDa-100kDa; 100kDa-350kDa;350kDa-500kDa)。PEG-NH2 分子量為IOODa-1000 kDa(例如：100-5kDa; 5kDa-50kDa;50kDa-500kDa;500kDa-1000kDa) ,PEG-NH2 末端氨基的取代度為 10% -100%。 內(nèi)核中海藻酸鹽接枝疊氮化物的濃度在l-50g/L;內(nèi)核中細胞含量IO2-IO9個細胞/ml內(nèi)核 體積，活性保持90 %以上。
[0007] 微膠囊的內(nèi)核中海藻酸鹽凝膠為二價金屬鈣、鋇或鋅，或者三價金屬釓的疊氮化 物接枝海藻酸鹽水凝膠，海藻酸鹽溶液為疊氮化物接枝海藻酸的鉀鹽或鈉鹽溶液。
[0008] 所用的疊氮化物包括：1，2, 3, 4-四嗪、1，2, 4, 5-四嗪、1，2, 3, 5-四嗪以及 1，2,3,4_四嗪、1，2, 4, 5-四嗪、1，2, 3, 5-四嗪中任意一種在6-位取代有苯環(huán)基、氨基、酰 基、磺酰基等任意一種基團的四嗪衍生物。微膠囊中PEG原位共價接枝改性到微膠囊表面 海藻酸鹽分子鏈上的產(chǎn)物反應(yīng)式為：
[0009]
[0010]其中，PEG-NH2 的聚合度n為 2-2500,PEG-NH2 分子量為IOODa-1000 kDa,PEG-NH2 末端氨基的取代度為10% -100%。PEG-NH2利用酰胺化反應(yīng)與含羧基的烯烴化合物反應(yīng)得 到PEG-C=C，PEG-C=C的烯烴基修飾率為10% -100%。改性后的PEG-C=C通過烯烴 基與海藻酸鹽上的疊氮基（Alg-N3)發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)生成共價鍵，將PEG原位共價接枝到 微膠囊上，PEG的接枝率（每100個海藻酸鹽羧基接枝的PEG百分數(shù)）為0. 01-99. 99%。
[0011] 其中，烯烴化合物修飾PEG中所使用的烯烴化合物包括：含有碳碳雙鍵（-C= C-)、碳碳三鍵（-C=C-)的C2~C18的直鏈脂肪烯烴或炔烴，或含有碳碳雙鍵（-C=C-)、 碳碳三鍵（-C=C-)的C4~C18的閉合環(huán)狀脂肪烯烴或炔烴，以及上述任意一種脂肪烯烴 或炔烴中在脂肪碳鏈上有苯環(huán)基、酰氯基、氨基等任意一種基團取代的衍生物。
[0012] 微膠囊膜中聚陽離子材料包括：殼聚糖，其脫乙酰度為80-98 %，分子量 為lkDa_800kDa;a-聚賴氨酸，分子量為2kDa_500kDa;e-聚賴氨酸，分子量為 2kDa_500kDa;聚精氨酸，分子量為lkDa_500kDa;聚鳥氨酸，分子量為lkDa_500kDa;聚組氨 酸，分子量為lkDa-500kDa。微膠囊產(chǎn)品的膜成分中的海藻酸鹽為疊氮化物接枝海藻酸的鉀 鹽或鈉鹽，接枝率〇. 01% -99. 99%;或者為海藻酸的鉀鹽或鈉鹽。
[0013] 上述的微膠囊可以是直接由經(jīng)疊氮化物修飾后的海藻酸鹽經(jīng)螯合制備得到三維 凝膠珠，或者是外層再由海藻酸鹽和聚陽離子兩種高分子材料通過層層自組裝形成聚電解 質(zhì)復(fù)合水凝膠膜，再通過共價鍵將烯烴化合物修飾的PEG原位接枝到微膠囊表面暴露出的 疊氮基基團上。
[0014] 廣品的具體制備步驟為：
[0015] 1)制備疊氮化物修飾海藻酸鹽材料，其中，海藻酸鹽接枝疊氮化物的分子量為 10kDa-2000kDa;海藻酸鹽接枝疊氮化物的接枝率為0. 01% -99. 99%;
[0016] 2)制備海藻酸鹽凝膠微球，即將步驟1)制備的材料配制成l_50g/L的海藻酸鹽溶 液，然后通過銳孔擠出法、靜電液滴法、乳化法等制備成海藻酸鹽凝膠微球，稱之為A微球； 其中海藻酸鹽凝膠為二價金屬鈣、鋇或鋅，或者三價金屬釓的經(jīng)疊氮化物修飾后海藻酸鹽 的水凝膠。
[0017] 3)將步驟2)中的A微球浸入到烯烴化合物修飾的PEG的溶液中，微球與PEG溶液 體積比的范圍為1:1-1:40,反應(yīng)時間為1-60分鐘，反應(yīng)溫度在0-37°C，此時得到微膠囊，稱 之為B微球，即為表面由PEG原位共價接枝改性的海藻酸鹽的水凝膠珠產(chǎn)品；取出用生理鹽 水洗滌；
[0018] 烯烴化合物修飾PEG的配制方法是：烯烴化合物修飾PEG溶于生理鹽水中、或pH 為5. 5-7. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中、或PBS溶液中，烯烴化合物修飾PEG濃度為0.l-500g/ L；
[0019] 4)將步驟2)中的A微球浸入聚陽離子溶液中，A微